Tema 6: Expresión de proteínas recombinantes en E. Coli (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 14
Fecha de subida 03/10/2017
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Profesor: Jaume Pinyol

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TEMA 6 TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE María Belén Pérez Sanmartín 2do biotecnología.
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN E.
COLI.
0 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología 1 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología Proteína recombinante: es una proteína sintetizada no a partir de la fuente natural que la produce, sino a partir de un microorganismo u organismo modelo e implica el clonaje del gen de la fuente original al organismo modelo, es decir, clonamos el gen de la proteína hasta expresar la proteína en un huésped diferente. Esto nos permite obtener más rendimiento y producción porque la mayor parte de las proteínas están en muy bajas cantidades en sus organismos productores.
No tan solo tiene ventaja a la hora de purificar si no que expresar la proteína recombinante puede ser la única posibilidad si antes habíamos hecho mutagénesis dirigida. Por tanto: 1. Facilita la purificación.
2. Que sea una proteína soluble y no tóxica.
3. Puede ser la única posibilidad si hacemos una modificación previa (la cepa original ya no la puede hacer). Es decir, si se coge una proteína codificada en un genoma humano o en otros organismos superiores, no se puede reintroducir en el organismo originario sino que se ha de expresar siempre de forma recombinante.
Se hace sobre E. coli porque es el organismo más conocido del planeta, después de E. coli como hospedador serían las levaduras como Saccaromyces. Son los segundos organismos mejor conocidos, luego también células eucariotas COS, células de insecto e incluso virus eucariotas.
Un 60% de las proteínas recombinantes o son producidas (se expresan) en E. coli o levadura. E.
coli sería 2/3 y la levadura el 1/3 restante.
Todos los puntos que se dirán podrán ser aplicados tanto para E. coli como para levaduras (son extrapolables). Así, cuando se mira la expresión de proteínas recombinantes se podrá ver siempre a tres niveles: OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES.
¿Qué se puede hacer a nivel de gen, proteína o plásmido para obtener (mejorar la producción) las proteínas recombinantes? Esto ha de verse a modo de una especie de red, ya que está todo conectado. Para la expresión de la proteína necesitamos un gen con su secuencia codificante pero también un promotor a partir del cual la RNA polimerasa pueda transcribir nuestro gen de interés. El plásmido donde se inserta el gen ha de tener: promotor + polylinker para introducir el inserto + terminador.
1. Gen - Construcción y elección del promotor óptimo.
- Optimización del inicio de traducción y estructura secundaria del mRNA.
- Elección del uso de codón. Genes sintéticos.
- Estabilidad del mRNA.
2 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología - Terminación de la transcripción.
2. Proteína - Estabilidad de la proteína: chaperonas, proteasas y proteínas de fusión.
- Destinación de la proteína en diferentes compartimentos celulares. Phage display.
- Detección y purificación.
3. Plásmido.
- Efecto del número de copias.
- Estabilidad del plásmido.
PROMOTORES.
A nivel del gen, ¿qué promotor se emplea para expresar esta proteína recombinante? Pasos: 1. En la planta de la que procede el gen se ha de identificar el gen que codifica a la proteína de interés.
2. Se clona el cDNA.
3. Se introduce en un vector de expresión. Después tendremos el vector con el cDNA que expresa una proteína en cuestión.
En primer lugar, para expresar el gen que nos produce la proteína recombinante hemos de elegir el promotor. Hay muchas posibilidades, pero todas se basan en que es un promotor inducible. No se pueden usar promotores constitutivos, ya que cuando se introduce un vector lo que nos interesa es un máximo rendimiento. Si utilizamos un promotor constitutivo E. coli modificará su metabolismo y le provocará un estrés brutal ocasionando una alta carga metabólica. Habría muchos problemas para crecer de manera y para que se pudiese producir la proteína recombinante.
El promotor ha de ser fuerte e inducible para tener altos niveles de transcripción y traducción.
- - Si se usa un promotor constitutivo la célula destinará todos sus recursos a sintetizar la proteína recombinante y no crecerá porque no sintetizará sus proteínas. Por tanto, no se dispondrá de suficiente biomasa para producir grandes cantidades de proteína recombinante.
Si se usa un promotor inducible, E. Coli podrá crecer de forma normal y cuando esté en fase exponencial se podrá inducir al promotor. En ese punto se dará un retraso en el crecimiento del microorganismo ya que no sólo trabaja para él sino también para “nosotros”, pero como ya teníamos suficiente biomasa, el rendimiento a la hora de purificar la proteína será notable, obtendremos gran cantidad de proteína.
¿En qué situación utilizaremos un promotor débil? Si el producto (la proteína recombinante) es muy tóxica para la célula que la ha de expresar, en el momento en que se exprese en grandes cantidades la célula morirá. En estos casos se ha de usar un promoor débil para que no se exprese en cantidades tóxicas.
Se acostumbran a usar promotores inducibles propios de E. Coli y promotores de fagos (con sus respectivas polimerasas).
3 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología PROMOTORES LAC Y PTAC.
El primer promotor para trabajar con proteínas recombinantes sería el lac Uv5 lleva una mutación en la zona de regulación del cAMP e insensibiliza al operador y al promotor al cAMP. Así, se hace insensible a los niveles de cAMP, de manera que la célula podrá crecer en un medio rico.
Al ser un promotor insensible a cAMP pues se pueden crecer degradando lactosa en un medio rico porque no necesita cAMP. Se puede aportar una gran cantidad de nutrientes con lo que el rendimiento y la biomasa del cultivo será mayor.
Este promotor es de los más débiles a la hora de expresar una proteína recombinante. El 20% del peso seco de la célula puede ser nuestra proteína recombinante, de manera que si esta proteína tiene un efecto tóxico pues la célula morirá. Esto para expresar proteínas tóxicas va bastante bien.
El promotor pTAC es fuerte y está constituido por la caja -10 del operón lac y la caja -35 del operón triptófano. Es un promotor quimérico. Curiosamente, el promotor corresponde a la secuencia consenso de la caja -35 y -10 de E. coli, por tanto, es un promotor muy fuerte que produce mucho transcrito. De esta manera, si controlamos el gen de interés por este promotor tan fuerte, la RNA polimerasa dejará de transcribir los genes de E. coli y empezará a producir los de la proteína recombinante.
4 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología Además, si introducimos el promotor en un vector que está en muchas copias (un plásmido), E.
Coli no donará a basto, se colapsará y no podrá transcribir más genes. Por esta razón, para promotores fuertes se aconseja usar plásmidos de bajo número de copias o vectores derivados de pBR porque estos mantienen el vector a un nivel de copias normal (moderado).
SISTEMAS DE DOBLE PROMOTOR. pET Algunos vectores como los plásmidos pET tienen de doble promotor que permiten sintetizar la proteína independientemente de la dirección de inicio.
Los sistemas de doble promotor usionan: gen diana + promotor de la RNA polimerasa del fago T7.
En el genoma del huésped (ej. E. Coli) se coloca la RNA polimerasa del fago T7 bajo control del promotor del operón lac, es decir, tenemos la secuencia codificante para el genoma del fago T7 bajo el control del operón lac.
El gen que codifica para la RNA polimerasa del fago T7 está en el genoma de la célula huésped mientras que el gen diana lo tenemos clonado en un plásmido que contiene el promotor de la RNA polimerasa del fago T7. Entonces, interrumpiendo el promotor del operón lac puede estar (o no) el operador del operón lac.
Así pues, la RNA polimerasa del fago T7 transcribe múltiples copias del gen diana. Así se evita utilizar la RNA polimerasa de E. Coli, que estará entretenida transcribiendo otros genes para sintetizar sus propias proteínas y tendrá menos carga metabólica. Esto permite generar una gran cantidad de copias del gen diana. Si se trabaja con una proteína que no es tóxica y que se pliega bien, este es el sistema más eficiente.
5 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología Control de la expresión basal de RNAp T7.
Tenemos la RNA polimerasa del fago T7 controlada por el operón lac, por tanto, en ausencia de inductor (IPTG) no se habría de transcribir. Aún así, la expresión basal, se puede producir la transcripción de pequeñas cantidades de RNA polimerasa del fago T7 de manera que provocará la síntesis del gen diana en ausencia del inductor. Para evitar este tema de las fugas, se utiliza un plásmido adicional pLys que codifica para la lisozima del fago T7 : lo utiliza el fago para lisar la célula diana y es un inhibidor de la RNA polimerasa.
En presencia de este plásmido adicional en ausencia de inductor tenemos inhibidas las pocas copias de RNA polimerasa que se pueden escapar. No obstante, cuando hay inductor la cantidad de RNA polimerasa T7 es muy superior a la cantidad de lisozima de manera que empieza a haber una cantidad normal a pesar de que una parte se degrade de manera que el gen diana se expresará a lo bestia.
OTROS PROMOTORES UTILIZADOS PARA LA EXPRESIÓN RECOMBINANTE.
Todos los promotores comentados hasta ahora no tienen capacidad de ajuste fino o fine tuning: son todo o nada, es decir, son más o menos intensos pero funcionan tal que en presencia de infuctor generan proteína recombinante pero en ausencia de inductor no se expresa ¿alguno permite realizar una síntesis gradual? Sí, el promotor arabinosa.
Se induce la síntesis de nuestro gen diana añadiendo arabinosa en el medio de cultivo de manera que dependiendo de la cantidad de arabinosa tendremos más o menos síntesis del gen diana. Se recomienda para optimizar y reconocer la expresión del gen a pequeña escala, pero no a nivel 6 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología industrial. Sirve para ver si es muy tóxico o no, según lo tóxico que sea pues se clona en un sitio u otro.
El promotor pCOLD se trata del promotor de la proteína cold shock y se activa cuando la célula pasa a un ambiente de baja temperatura.
¿Ventaja? Nos ahorramos el coste del reactivo (IPTG, pero no el coste de refrigerar el producto) y, además, la ventaja que tiene es que hay muchas proteínas que a 37 grados no pliegan bien y a 25 se pliegan de una manera magnifica. Perite activar la síntesis de la proteína recombinante bajando la temperatura del cultivo. El rendimiento de proteína recombinante bien plegada a menudo es, francamente, mejor que no expresando a 37 grados.
ELEMENTOS “UPSTREAM” Están localizados en el extremo 5’ de la caja -35 de algunos promotores. Son secuencias ricas en AT que incrementan el nivel de transcripción gracias a la interacción con la subunidad alfa de la RNA polimerasa II.
INICIO DE LA TRADUCCIÓN Y ESTRUCTURAS SECUNDARIAS DEL mRNA.
La caja Shine-Dalgarno o RBS (5’UAAGGAGG) o una parte sustancial de la misma ha de estar siempre entre 4 y 14 nucleótidos para poder reclutar ribosomas.
Como la interacción con el RNA 16S del ribosoma es por complementariedad, la formación de estructuras secundarias en esta zona dificulta el inicio de traducción. También hay secuencias dentro de la región codificante que favorecen la iniciación de la traducción. 5’ AUG AAU CAC AAA GUG.
El rendimiento de la proteína recombinante a veces es muy bajo y una de las causas de que esto suceda puede ser que el transcrito bloquee la secuencia RBS del gen que codifica a la proteína. Si este mRNA está bloqueado por el propio mRNA porque forma un loop pues no se te traducirá.
Entonces hay programas informáticos que te dicen si hay regiones de complementariedad y miran mutagénesis dirigida para que no se forme el loop.
7 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología TERMINADORES DE LA TRANSCRIPCIÓN.
- Reducen el coste energético de la transcripción.
- Disminuyen la posibilidad de que se formen estructuras secundarias en el mRNA que interfieran con la traducción.
- Evitan la traducción de niveles innecesarios de otras proteínas (coste energético y efectos en trans).
- Evitan la formación de RNAs antisentido que pueden interferir con la traducción de marcadores de selección.
Si se utilizan vectores (plásmidos) que no portan terminadores después de la región de la expresión del gen recombinante, se producirá la transcripción de todo el plásmido y esto es dramático. Este hecho sucedía en plásmidos antiguos.
Imaginar que en el plásmido tenemos resistencia a ampicilina de manera que si no hay terminación: 1. Incrementa el coste d la transcripción: más carga metabólica. Incrementa la traducción de niveles innecesarios de otras proteínas.
2. Promueve la formación de estructuras secundarias que interfieren en la traducción.
3. Se forman RNAs antisentido que pueden interferir con la traducción de selección.
OPTIMIZACIÓN DEL USO DE CODÓN Y GENES SINTÉTICOS.
- - En las proteínas de E. Coli que se expresan en mayor cantidad hay una correlación muy buena entre la abundancia de un tRNA en concreto y la presencia del codón correspondiente en el mRNA.
Por ejemplo, los codones de la Arginina: AGA y AGG son muy poco frecuentes en E.
Coli y muy abundantes en levaduras y otros eucariotas.
Para los codones 𝑋1 𝑋2 𝐶 y los codones 𝑋1 𝑋2 𝑈 existe un único tRNA (reglas “woble”). La eficiencia de la traducción se ve mejorada si se ecualiza el número de puentes de hidrógeno.
8 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología Optimizar el uso de codón puede incrementar un orden de magnitud el rendimiento de la producción. Se puede conseguir mediante: - Cepas “rosetta” Mutagénesis dirigida.
Construir el gen sintético.
¿Cuándo se sintéticos? usan genes Cuando se conoce la secuencia de nucleótidos del gen de una determinada proteína.
Cuando no se tiene el cDNA.
¿? Cuando se habrían de introducir tantas mutaciones dirigidas en una secuencia que no sale rentable y es más efectivo sintetizar el gen entero.
También para examinar la distribución de codones de este gen y se verá que muchos de estos codones que utiliza el gen para codificar la proteína son raros en E. Coli. De manera que se rediseña la secuencia del gen sólo para tener codones frecuentes en E. Coli y así irá más relajada produciendo proteína recombinante.
Si tenemos codón que codifica triptófano y lo segrestamos no podrá producir lo suyo, por lo que es un estrés bastante grande.
Dos estrategias: 1. Se hacen oligos de 50-60 nt solapados uno con el otro. Si están fosforilados, una vez se alinean hibridan entre sí y por adición de T4 DNA ligasa se obtendrá el gen que queríamos hacer (deseado) . El método es recomendado para péptidos pequeños.
2. Assembly PCR: ahora la veremos.
GENES SINTÉTICOS. “ASSEMBLY PCR”.
Se colocan oligos solapados sólo por una pequeña zona. Esto permite hacer secuencias más largas que al final acaban amplificando por PCR (es como una PCR recombinante pero a gran escala).
9 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS SINTETIZADAS.
- Saturación del sistema de chaperonas.
Falta de estabilización de la estructura por modificaciones postraduccionales --> formación de cuerpos de inclusión. ¡¡¡No siempre son un problema!!! Expresión a 25-30ºC Sobreexpresión de los genes de chaperonas.
Expresión como proteína de fusión.
Elección de un destino celular adecuado.
Si se expresa una proteína recombinante se saturará el sistema de plegamiento de E. Coli, de manera que quedarán bloqueadas las chaperonas intentado recombinar nuestra proteína… se trata de coexpresar el mismo gen a la vez que las chaperonas o chaperoninas de E. coli CO- EXPRESIÓN DE CHAPERONAS.
Hay plásmidos que transformados al mismo tiempo y que permiten inducir la síntesis de chaparonas para asistir al plegamiento de nuestra proteína recombinante.
10 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología DESTINACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE (I) DESTINACIÓN DE LA PROTEÍNA RECOMBINANTE (II).
11 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología PROTEÍNAS DE FUSIÓN (I) PROTEÍNAS DE FUSIÓN (II) 12 Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología PHAGE DISPLAY (I) RAPID TRANSLATION SYSTEM 13 ...