Tema 4. Proteïnes (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Bioquímica I
Año del apunte 2014
Páginas 24
Fecha de subida 02/02/2015
Descargas 13
Subido por

Vista previa del texto

Tema 4. Nivells estructurals de les proteïnes En comparació amb la resta de polímers, les proteïnes són les macromolècules més versàtils.
Estan formades per 20 tipus d’aminoàcids i tenen una gran diversitat de grups funcionals que els permeten reaccionar amb altres macromolècules.
NIVELLS ESTRUCTURALS DE LES PROTEÏNES Estructura primària Estructura secundària Estructura terciària Estructura quaternària  Estructura primària Seqüència d’aminoàcids d’una cadena polipeptídica  Estructura secundària Conformació local que adopten els aminoàcids dins la cadena polipeptídica  Estructura terciària Conformació global que adopta la cadena polipeptídica a l’espai  Estructura quaternària Associació entre polipèptids d’una proteïna L’ENLLAÇ PEPTÍDIC L’enllaç peptídic és un enllaç covalent de tipus amida entre el grup α-carboxílic d’un aminoàcid i el grup α-amí d’un altre.
L’enllaç peptídic és un enllaç planar (el carboni, el nitrogen i els elements als que estan units es troben al mateix pla) (1) amb caràcter de doble enllaç ja que està estabilitzat per dues formes de ressonància (2) que li aporten un caràcter parcial (40%) de doble enllaç. És per això que té una longitud intermèdia entre un enllaç senzill i un enllaç doble (3). En funció de la disposició dels carboni alfa l’enllaç peptídic podrà tenir una conformació cis o trans. Quasi sempre serà trans (4).
C-N enllaç senzill: 1,49 Å C-N enllaç peptídic: 1,32 Å C-N enllaç doble: 1,27 Å (3) (1) (2) (4) CARACTERÍSTIQUES DE PÈPTIDS I PROTEÏNES En funció del número d’aminoàcids units per mitjà de l’enllaç peptídic s’obtenen diferents polímers. Si el polímer està format per menys de 50 aminoàcids s’obtenen els pèptids i podrem parlar de dipèptids (n=2), tripèptids (n=3), tetrapèptids (n=4), ogliopèptids (n<10), polipèptids (n>10)... Si nombre d’aminoàcids és major que 50 parlarem de proteïnes.
Els pèptids són polímers lineals no ramificats amb una part constant i una variable (cadenes laterals). Tenen direccionalitat, amb un extrem amí i un extrem carboxil.
Estructura primària Tant en pèptids com en proteïnes es pren per conveni l’extrem amí (N-terminal) com a principi de la cadena. L’estructura primària és la seqüència d’aminoàcids d’un pèptid i pot anomenarse mitjançant una escriptura completa, amb el nom complet dels aminoàcids, o una escriptura simplificada amb la seva nomenclatura de tres o d’una lletra.
Isoelectroenfocament El càlcul del punt isoelèctric d’un pèptid es realitza igual que en els aminoàcids: es calcula la mitjana dels dos valors de pKa que intervenen en la formació de la forma elèctricament neutra.
En el cas d’aquest tetrapèptid intervenen en la formació de la forma elècticament neutra l’àcid glutàmic (E) i la lisina (K).
La diferència de punt isoelèctric s’utilitza per separar pèptids o proteïnes mitjançant un càtode (positiu) i un ànode (negatiu). El procés s’anomena isoelectroenfocament o enfocament isoelèctric i consisteix en el moviment de les proteïnes fins al pH que correspon al seu punt isoelèctric. Cada proteïna, doncs, s’aturarà en un pH característic. Es tracta d’una tècnica preparativa ja que és possible treballar amb les proteïnes un cop finalitzat l’anàlisi i la separació.
pH < pI Proteïnes amb càrreca +: es mouen cap a l’ànode pH = pI Proteïnes amb càrrega 0: no es mouen pH > pI Proteïnes amb càrrega -: es mouen cap al càtode ANÀLISI DE LA COMPOSICIÓ D’UN PÈPTID L’anàlisi de la composició d’un pèptid es realitza per tal de quantificar els residus d’una proteïna o pèptid i determinar la presència d’aminoàcids anormals o modificats. El procediment emprat consisteix en el trencament dels enllaços peptídics per mitjà de la hidròlisi del pèptid i en un anàlisi quantitatiu per cromatografia de bescanvi iònic, que permetrà la identificació i la quantificació dels elements.
La hidròlisi dels enllaços peptídics pot realitzar-se mitjançant mètodes químics o enzimàtics: Mètodes químics - Hidròlisi àcida HCL 6M, 100oC, 24h. Pèrdua de W i parcial de S, T, Y. Pas de N i Q a D i E respectivament.
Es posa un element molt àcid que allibera protons. L’asparagina passa a àcid aspàrtic i la glutamina a àcid glutàmic. Les condicions són molt extremes i això fa que alguns aminoàcids siguin molt poc estables.
- Hidròlisi bàsica NaOH 2-4M, 100oC, 4-8h. Valoració de W.
S’utilitza un element molt bàsic i els aminoàcids aguanten millor en aquestes condicions.
Mètodes enzimàtics - Pronasa Barreja de peptidases o proteases poc específiques. Valoració de W, N i Q.
Talla pràcticament tots els enllaços peptídics, les condicions no són tant dràstiques i conserva força bé els aminoàcids.
DETERMINACIÓ DE L’ESTRUCTURA PRIMÀRIA D’UNA PROTEÏNA L’estructura primària és la seqüència d’aminoàcids d’una cadena polipeptídica. Les següents reaccions i operacions permeten conèixer el pes molecular de la cadena a determinar, dividirla i conèixer també el pes molecular dels fragments i conèixer els extrems amí i carboxil de la cadena i dels fragments. Per separat aquestes tècniques no ens permeten determinar l’estructura primària d’una proteïna, però sí que ho podem fer combinant-les.
1) Separació del pèptid d’altres pèptids mitjanant el trencament dels enllaços SH Dues cisteïnes poden unir-se per mitjà d’un enllaç disulfur i formar una cistina. Aquest pot ser intracatenari o intercatenari. El primer que cal fer és eliminar aquests enllaços per tal de separar els pèptids. Normalment es realitza un tractament amb DTT, una molècula reductora que trenca enllaços disulfur, però també pot aplicar-se àcid perfòrmic.
2) Determinació de les masses moleculars dels pèptids per espectrometria de masses L’espectrometria de masses és una tècnica analítica, ja que no és possible treballar amb les proteïnes després de l’anàlisi, que permet una determinació molt precisa del pes molecular d’una mostra. Consisteix en la ionització d’una molècula en fase gasosa i en la seva acceleració mitjançant un camp elèctric. Es mesura el temps d’arribada de la molècula a un detector (time of flight - TOF) o bé com es desvia per un camp magnètic. La velocitat d’arribada al detector dependrà de la grandària del pèptid (relació càrrega/massa) i s’obtindrà un espectre amb pics característics per cada pèptid o proteïna. Fins fa relativament poc la ionització de proteïnes en fase gasosa no era possible. Actualment es realitza fent servir l’electrospray o el mètode MALDI.
3) a) Identificació del residu N-terminal d’un polipèptid Per identificar el grup amí terminal d’un polipèptid, és a dir, el primer aminoàcid, es fa reaccionar aquest amb clorur de dabsil o de dansil que reaccionarà amb el grup amí i donarà lloc a un compost fluorescent. En el cas de la lisina, al tenir aquesta un altre grup amí amb el qual podria reaccionar el producte, no es podrà afirmar que es tracti del grup amí terminal.
3) b) Identificació del residu N- o C-terminal d’un polipèptid Mitjançant el tractament amb una amino o carboxipeptidasa és possible també identificar els extrems d’una cadena polipeptídica. L’aminopeptidasa allibera el primer aminoàcid de la proteïna mentre que la caboxipeptidasa allibera l’últim. L’aminoàcid alliberat pot ser analitzat però aquest mètode presenta un problema: depenent de l’aminoàcid pot ser que aquests productes no tallin bé l’enllaç. Per aquest motiu aquest mètode només s’utilitza per identificar el primer i l’últim aminoàcid ja que intentar-ho fer amb més podria portar confusions. Per exemple, si obtinguéssim primer una alanina i després una altra alanina no podríem saber del cert si hi ha dues alanines o si bé no ha tallat bé la primera i ha tornat a aparèixer.
4) Hidròlisi parcial del pèptid Es realitza una ruptura peptídica específica i divideix el pèptid en dos. Per exemple, el bromur de cianogen talla després d’una metionina. Poden utilitzar-se també enzims específics.
Seqüenciació de proteïnes mitjançant la degradació d’Edman Un altre mètode que permet la seqüenciació de proteïnes és la degradació d’Edman, que consisteix en la repetició d’un cicle. Presenta el problema que, al ser una reacció química, té un cert grau d’eficiència i comença a ser ineficient a partir d’entre 8 i 10 cicles. Mitjançant seqüències parcials podríem acabar obtenint l’estructura primària completa.
1) Reacció d’Edman Marca el primer aminoàcid amb PHT 2) Separació de l’aminoàcid-PTH del pèptid 3) Identificació de l’aminoàcid-PTH per HPLC 4) Repetició del cicle per aconseguir la seqüenciació total de la proteïna Estratègia per la seqüenciació de pèptids i proteïnes L’estratègia a seguir per la seqüenciació de pèptids i proteïnes seria l’obtenció de seqüències parcials que permetrien, per solapament, l’obtenció de la seqüència completa.
1) Separació i reducció del pèptid 2) Determinació de la massa molecular per espectrometria de masses 3) Identificació dels aminoàcids N-terminal i C-terminal 4a) Digestió amb tripsina 5a) Separació dels fragments tríptics 6a) Seqüenciació parcial dels fragments 4b) Digestió amb V8 5b) Separació dels fragments 6b) Seqüenciació parcial dels fragments 4c) Digestió amb BrCN 5c) Separació dels fragments 6c) Seqüenciació parcial dels fragments 7) Encaix dels diferents fragments Tripsina Talla molt específicament l’extrem carboxil de lisina i arginina Determinació de la seqüència de pèptids mitjançant espectrometria de masses successiva Aquest altre procés consisteix en la realització de dues espectrometries de masses successives.
La primera ionitzaria els pèptids o proteïnes i els fa col·lisionar provocant el trencament dels seus enllaços. Per comparació del pes molecular abans i després del trencament seria possible conèixer quin és l’aminoàcid alliberat. El principal problema d’aquest procés és que necessita ser complementat amb altres mètodes, ja que no és possible diferenciar els extrems N i C i no es pot diferenciar tampoc entre aminoàcids amb una massa idèntica (I i L).
Exemple Massa molecular acumulada 75/222/355/487/562/679 Massa molecular residual 679/604/457/324/192/117 607 és la massa molecular total de la cadena. La col·lisió amb el primer espectròmetre provoca una ruptura en dos fragments que junts hauran de sumar el pes total de la cadena. Les masses moleculars més petites (75 i 117) correspondran als extrems de la cadena (glicina i valina), tot i que es desconeix quin és l’extrem C i quin és l’extrem N.
Fragments: 75 + 604; 222 + 457; 355 + 324; 487 + 192; 562 + 117 Abans o després de Gly (75): 204 -75 = 129 (Glu) Fragment sense Gly-Glu: 403 Abans o després de Val (117): 174 – 117 = 57 (Gly) Fragment sense Val-Gly: 490 Estratègia alternativa En molts casos, com ja es coneix la seqüència de les proteïnes de la cèl·lula, es pot utilitzar la següent com a estratègia alternativa.
1) Separació i reducció del pèptid 2) Determinació de la massa molecular per espectrometria de masses 3) Digestió amb tripsina 4) Determinació de la massa molecular dels fragments triptics per espectrometria de masses 5) Comparació dels fragments obtinguts amb els bancs de dades 6) Identificació de la proteïna i de la seva seqüència DIAGRAMES DE RAMACHANDRAN Els enllaços entre carbonis o entre carboni α i nitrogen de les cadenes polipeptídiques tenen la propietat de poder girar, de manera que poden disposar-se de diferents maneres i aquestes diferents disposicions afectaran les seves propietats. Els angles de torsió o angles dièdrics (Φ i Ψ) són els graus que giren aquests enllaços i la conformació local de la cadena polipeptídica, és a dir, la seva estructura secundària, serà una o altra en funció d’aquests.
Els diagrames de Ramachandran consisteixen en l’estudi de les diferents conformacions dels polímers relacionant diferents valors dels angles Φ i Ψ amb si són energèticament favorables i per tant amb si poden donar-se.
El color verd fosc indica una conformació estable. L’enllaç serà energèticament estable quan Φ = -90 i Ψ = 120 o quan Φ = 90 i Ψ = -60, però en canvi no ho serà quan Φ = 90 i Ψ = -90.
Com major sigui el radical R més restringides estaran les diferents conformacions de la cadena ja que hi haurà menys possibilitats d’angles viables. En el cas de la glicina per exemple hi haurà moltes conformacions possibles ja que és un aminoàcid petit.
Dins la proteïna hi ha parts que segueixen conformacions regular com hèlix alfa i làmina beta mentre que altres parts o segueixen cap regularitat. No obstant, aquesta estructura irregular serà fixa per cada proteïna.
ESTRUCTURA SECUNDÀRIA. HÈLIX-ALFA L’hèlix alfa és un tipus d’estructura secundaria de les proteïnes caracteritzada pel plegament formant una estructura espiral on les cadenes laterals queden a l’exterior i l’interior queda estabilitzat mitjançant enllaços d’hidrogen intracatenaris que uneixen un hidrogen i un oxigen de diferents carbonis alfa. La imatge següent mostra una visió lateral i una superior de la cadena.
Diagrama de Ramachandran per les hèlix alfa L’hèlix alfa pot ser dextrogira (right-handed helix), que és el cas més comú, o bé levogira (left-handed helix).
Paràmetres per definir una hèlix  h, elevació Distància de l’eix de l’hèlix ocupada per un residu (un aminoàcid)  n Número de residus per volta d’hèlix  p, pas d’hèlix Distància de l’eix de l’hèlix que ocupa una volta  N Número d’àtoms per volta d’hèlix (atoms en un cicle unit per un enllaç d’hidrògen) En l’hèlix alfa trobem que: h = 1,5Å n = 3,6 residus/volta p = 1,5 · 3,6 = 5,4 Å nN = 3,613 N = 13 àtoms Altres estructures hèlix Tot i que l’hèlix alfa és l’estructura secundària regular més habitual, en alguns casos trobem altres tipus d’hèlix com per exemple: Hèlix 310 n=3 i N=10  més estirada Hèlix π(4.410)  més aplanada ESTRUCTURA SECUNDÀRIA. LÀMINA BETA En la l’estructura de làmina beta la cadena beta es troba totalment estirada i unida a una altra cadena beta formant les làmines beta mitjançant enllaços d’hidrogen. Poden ser paral·leles, si van en la mateixa direcció, o antiparal·leles, si van en sentit contrari. És més habitual la presència de fulles antiparal·leles. És un tipus disposició regular ja que és igual per a tots els tipus de proteïnes: coneixem els aminoàcids i els enllaços que la formen. També apareixen representats als diagrames de Ramacandran.
Tot i que la majoria d’aminoàcids segueixen una disposició regular en hèlix alfa o làmina beta a vegades trobem estructures regulars secundàries com són per exemple els girs de la làmina beta. El gir de la làmina beta antiparal·la sovint adopta una estructura determinada anomenada gir beta.
Algunes proteïnes tenen també girs omega, que segueixen una conformació més o menys regular.
PROTEÏNES FIBROSES Les proteïnes fibroses són estructures amb una forma filamentosa o allargada on no hi ha plegament d’unes estructures sobre d’altres. Són resistents i tenen normalment una funció estructural. Estan formades per pocs aminoàcids diferents i només tenen un tipus d’estructura secundària. Per exemple, si la proteïna ha de formar una làmina beta estarà formada per aminoàcids que tendeixin a aquesta estructura. Són força insolubles i els filaments s’associen formant fibres. Alguns exemples són el col·lagen, les queratines, la fibroïna...
Queratina L’α-queratina està formada per dues hèlix alfa enrotllades associades entre si mitjançant ponts disulfur. És molt resistent a la desnaturalització.
Col·lagen El col·lagen és una proteïna rica en glicina, prolina i aminoàcids modificats (hidroxiprolina, hidroxilisina) que presenta una hèlix específica. La glicina és un aminoàcid amb una estructura petita que li permet adoptar qualsevol estructura mentre que la prolina no pot adoptar la conformació hèlix alfa.
La triple hèlix del col·lagen (tropocol·lagen) es caracteritza per ser levògira (contrària a l’hèlix alfa) i molt compacta. Té 3,3 residus per volta i la hidroxilació de la prolina i la lisina permet una major quantitat d’enllaços d’hidrogen. S’estableixen també enllaços covalents entre grups de lisina per mitjà de l’enzim lisina oxidasa. Les cadenes de col·lagen poden ser producte de diferents gens, la qual cosa porta a una diversitat de col·làgens.
Alteracions en el col·lagen poden comportar conseqüències patològiques com el latirisme (deficiència en la Lisil Oxidasa), l’escorbut (deficiència en la Prolil Oxidasa), problemes en l’entrecreuament de fibres, que fa l’estructura més fràgil, o alteracions degudes a mutacions dels gens com per exemple el Síndrome d’Ehlers-Danlos, que provoca una major flexibilitat del col·lagen.
PROTEÏNES GLOBULARS Les proteïnes globulars, a diferència de els proteïnes fibroses, es caracteritzen per tenir una forma globular compacta, ser fràgils i realitzar normalment una funció catalítica. Estan compostes per molts aminoàcids diferents, tenen estructura secundària i terciària, són solubles i no formen fibres. No segueixen cap tipus d’estructura regular, tot i que poden trobar-se superestructures secundàries. En són exemples la mioglobina i els citocroms.
ESPECTROSCOPIA PER LA DETERMINACIÓ DE LA PRESÈNCIA I CONCENTRACIÓ DE PROTEÏNES La determinació de la presència de proteïnes i la seva concentració se sol realitzar mitjançant tècniques espectroscòpiques, les quals estan basades en la interacció de la llum amb la matèria. És important recordar el caràcter dual de la llum com a ona-partícula i que la seva energia no és continua, és quantal, es distribueix en nivells i es mesura en fotons ( ).
En funció de com sigui la interacció de la llum amb la matèria hi ha tres tipus d’espectroscòpia i normalment s’utilitza l’espectroscòpia basada en l’absorció de llum.
L’espectroscòpia pot realitzar-se a diferents longituds d’ona i en funció d’això tindrem diferents tipus d’ones. En l’anàlisi de les proteïnes interessaran particularment les longituds d’ona corresponents a la radiació visible i ultraviolada.
Perquè es produeixi l’absorció de l’energia d’un fotó d’una certa longitud i un electró es vegi excitat a l’estat electrònic superior és imprescindible que l’energia aportada per aquest fotó sigui exactament la diferència d’energia entre un estat i l’altre. És a dir, el fotó ha d’aportar exactament la quantitat d’energia necessària per a fer aquest sal.
Espectroscòpia visible i ultraviolada de les proteïnes La Llei Lambert-Beer afirma que la intensitat de la llum decau exponencialment en travessar una substància que l’absorbeix segons l’equació següent: A correspon a l’absorbància de la substància, c és la concentració de la molècula, l indica la longitud de pas de la llum, que se sol considerar constant, i ε és el coeficient d’extinció molar, una propietat intrínseca de la molècula per a cada longitud d’ona.
Coneixent l’absorbància, el coeficient d’extinció molar propi de la molècula a identificar i la longitud de pas de la llum serà possible calcular en quina concentració es troba aquesta molècula.
Mesura de l’absorció de llum mitjançant un espectrofotòmetre La mesura de l’absorció de llum es realitza mitjançant un espectrofotòmetre. Aquest consisteix en una font de llum que emet llum a diferents longituds d’ona, un monocromador que permet escollir la longitud d’ona incident que travessarà la mostra i un detector que mesura la quantitat de llum no absorbida i permet, per tant, calcular l’absorbància de la molècula de la mostra.
Un espectre d’absorció mostra la variació de l’absorbància amb la longitud d’ona i depèn de la conformació local de la cadena. L’espectre següent correspon a longituds d’ona de radiació ultraviolada, per sota de 380 nm.
Per estudiar els espectres d’absorció interessa determinar una longitud d’ona on l’absorbància sigui específica per la proteïna. Una longitud d’ona inferior a 240 nm no és útil ja que altres molècules també absorbeixen i per això apareixen valors tant alts de coeficient d’extinció molar. El cromòfor és la part de la proteïna en què es produeix l’absorció. En bioquímica els més útils per determinar la presència de proteïnes, ja que són els que millor absorbeixen, són el triptòfan i la tirosina (aminoàcids aromàtics) que absorbeixen característicament a 280nm.
Una proteïna que no tingui aminoàcids aromàtics, doncs, no absorbirà a aquesta longitud d’ona. El coeficient d’extinció molar d’un cromòfor depèn també del seu entorn. Una variació d’absorbància, per tant, assenyala una modificació de l’entorn de l’aminoàcid.
Generalment les proteïnes no absorbeixen a visible. Trobem, però, que l’hemoglobina sí que ho fa. Això es deu, no a la cadena, sinó a un grup unit a ella. El color és la capacitat d’absorbir a visible i indica la presència d’un metall. Quan s’utilitza un colorant s’està afegint a una substància que no absorbeix a visible una altra substància que sí ho fa. En proteïnes s’utilitza molt el Blau de Coomassie, que presenta l’avantatge que s’uneix pràcticament a totes les proteïnes per igual.
Fluorescència Després de l’absorció d’energia i excitació d’un electró, la molècula pot retornar aquesta energia i desexcitar-se per dues vies. Pot emetre un fotó de la mateixa energia que el fotó incident o bé pot emetre calor per dissipació i emetre l’energia restant amb un fotó que tindrà una longitud d’ona més alta. Aquest segon procés s’anomena fluorescència, i és un procés de remissió d’energia dut a terme pels fluoròfors.
La fluorescència es du a terme amb l’espectrofluorímetre i és una tècnica més sensible que l’absorció, ja que permet detectar quantitats més baixes. Els fluoròfors de les proteïnes seran també cromòfors, ja que si no hi ha absorció no hi pot haver fluorescència. La seva capacitat d’actuació dependrà de la disposició local de la proteïna: la fluorescència pot variar en funció dels aminoàcids propers. Per aconseguir detectar aminoàcids a una longitud d’ona determinada s’utilitza clorur de dansil o clorur de dabsil.
PREDICCIÓ DE L’ESTRUCTURA SECUNDÀRIA La predicció de l’estructura secundària de les proteïnes globulars es realitza mitjançant l’algoritme de Chou-Fassman, basat en la probabilitat d’un aminoàcid de trobar-se en una determinada conformació local. Així per exemple, afirma que si es troba un segment de 6 aminoàcids sense Prolina en que és més probable la conformació alfa que la conformació beta, es pot predir que el segment tindrà una conformació alfa.
A més, existeixen també les estructures supersecundàries, agrupacions d’estructures secundàries que s’acostumen a trobar seguides: ESTRUCTURA TERCIÀRIA. DOMINIS El dominis són fragments d’una proteïna amb una estructura terciària i una funció independent a la resta de la cadena polipeptídica. Les proteïnes poden estar composades combinant diferents dominis per tal d’associar les seves propietats.
DETERMINACIÓ DE L’ESTRUCTURA TERCIÀRIA D’UNA CADENA POLIPEPTÍDICA. RAIGS X.
La cristal·lografia de raigs X és la tècnica més resolutiva i més emprada per la determinació de la posició tridimensional dels àtoms d’una proteïna. Es basa en la capacitat dels electrons per difractar els raigs X i en la combinació dels raigs X difractats per electrons veïns. Aquestes combinacions d’ones difractades dependran només de la disposició electrònica. Mitjançant una font de raigs X i un detector de raigs X s’obté un espectre de difracció que permet conèixer la intensitat i la posició dels senyals. Per a que el patró d’interferència sigui informatiu és necessari que la longitud d’ona de la radiació sigui inferior a l’espaiament regular existent entre els elements de l’estructura.
El principal problema que presenta aquesta tècnica és que requereix la cristal·lització de les proteïnes mitjançant l’eliminació d’aigua i que com més rígid sigui el cristall major serà la resolució. Si bé això presenta l’avantatge que la conformació de la proteïna serà similar a com seria en solució aquosa, els principals problemes són que els rajos X poden trencar els enllaços químics de l’estructura; que no totes les proteïnes cristal·litzen i no sabem, d’entrada, si ho faran, i que no podem eliminar la totalitat d’aigua perquè aleshores perdríem l’estructura.
La imatge de l’esquerra es correspon a un espectre de difracció 2D on s’observa la posició i la intensitat de les senyals. Al centre apareix un punt molt electronegatiu (metà), que hauria de ser molt negre encara que apareix blanc. A partir de l’espectre s’obtindria un mapa de densitat electrònica, la imatge de la dreta.
Una alternativa a la cristal·lografia de raigs X és la Ressonància Magnètica Nuclear (RMN). Si bé aquesta tècnica no permet analitzar proteïnes més grans de 40 aminoàcids, permet calcular la concentració en que es troben de forma precisa.
ESTRUCTURA QUATERNÀRIA L’estructura quaternària és la manera com es troben associades diferents cadenes polipeptídiques dins d’una proteïna. Quan es tracta d’un complex gran, però, no es parla d’estructura quaternària sinó de com es troben associades les proteïnes entre si. Les cadenes polipeptídiques poden ser homotípiques, si són idèntiques o quasi idèntiques, o heterotípiques si són molt diferents CROMATOGRAFIA D’EXCLUSIÓ MOLECULAR La cromatografia d’exclusió molecular o cromatografia per filtració en gel és un mètode de purificació de proteïnes. Consisteix en una fase mòbil, formada pel dissolvent (eluent), i una fase estacionària formada per una reïna amb porus d’una grandària determinada per on només podran passar determinats compostos. Les proteïnes petites, a l’introduir-se als porus, passen més lentament mentre que les grans s’elueixen primer. El volum d’eluent en el que surten les molècules més grans, que no penetren dins dels porus, s’anomena volum d’exclusió. Els volums particulars en què vagin sortint les molècules que sí penetren els porus s’anomenaran volums d’elució. El volum d’elució serà menor per les proteïnes més grans i anirà creixent per proteïnes petites.
Mitjançant l’estandardització de la columna aquest sistema permet separar proteïnes en funció del pes molecular i conèixer-lo. No permet conèixer, però, de quantes subunitats està formada la proteïna.
L’absorbància es mesura a 280 (aminoàcids aromàtics) perquè aquests són presents a gairebé totes les proteïnes.
ELECTROFORÈSI EN GELS DE POLIACRILAMIDA S’introdueix una solució de proteïnes en un gel porós i s’aplica una diferència de potencial per separar les molècules en funció de la relació càrrega/massa. Les proteïnes grans tindran més dificultats i trigaran més en sortir. Les proteïnes amb càrrega positiva no baixaran.
Electroforèsi en gels de poliacrilamida en presència de SDS L’objectiu de l’addició de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) és la pèrdua de la conformació global de les proteïnes (estructura terciària) de manera que totes tinguin una càrrega negativa i la separació es realitzi únicament en funció del pes molecular. L’SDS eliminarà únicament les interaccions no covalents, no eliminarà enllaços covalents com l’enllaç disulfur.
Gràcies a l’estandarització prèvia de la columna amb proteïnes de pes molecular conegut es té una correspondència de distància de migració i massa molecular que permet determinar la massa molecular de les cadenes aïllades.
Combinació cromatografia d’exclusió molecular i SDS-PAGE L’anàlisi combinat mitjançant cromatografia d’exclusió molecular i SDS-PAGE permet determinar si una molècula té estructura quaternària de proteïnes.
El primer gràfic, corresponent a un anàlisi de cromatografia d’exclusió molecular mostra que el pes total de la mostra és de 180 KDa. Quan l’analitzem per electroforèsi amb gels de poliacrilamida, però, obtenim que només hi ha un tipus de subunitat i que aquesta té una massa molecular d’aproximadament 60 KDa. Això ens indica que sí que hi ha estructura quaternària ja que hi ha 3 subunitats.
Es tracta d’una tècnica preparativa ja que, un cop finalitzada, és possible treballar amb les proteïnes.
MÈTODES IMMUNOLÒGICS PER L’ANÀLISI DE PROTEÏNES Els mètodes immunològics per l’anàlisi de proteïnes tenen com a objectiu la determinació d’una proteïna específica dins d’una barreja de proteïnes.
Les immunoglobulines són proteïnes compostes per diferents cadenes polipeptídiques i dominis que s’uneixen específicament a un antígen, de manera que pot utilitzar-se un anticòs específic per determinar la presència d’una proteïna determinada.
Anàlisi de l’expressió de proteïnes mitjançant western blod Western blot és una tècnica analítica per determinar la presència d’una proteïna concreta després d’una electroforesi en presència de SDS i BME. La transferència a una membrana de cel·lulosa es fa perquè d’aquesta manera les proteïnes són més accessibles.
Es basa en la incubació de la mostra amb un anticòs primari que detecta una proteïna específica i posteriorment amb un anticòs secundari marcat que s’uneix a l’anticòs primari. El motiu pel qual es marca l’anticòs secundari i no el primari és purament econòmic i pràctic.
Marcant l’anticòs secundari només cal marcar un anticòs, mentre que si es marqués el primari caldria un anticòs marcat específic per cada proteïna. Aquest anticòs marcat emet un senyal que serà visible i ens indicarà el pes molecular.
ELISA Elisa és un mètode molt sensible per analitzar la presència i els nivells d’una proteïna a fluids biològics. Presenta l’avantatge que permet analitzar un volum major de mostra però no indica el pes molecular.
Es basa també en la utilització de dos anticossos. El primer s’immobilitza en un suport sòlid i s’incuba amb la mostra. La proteïna s’hi uneix i s’afegeix un segon anticòs unit a un enzim, l’activitat del qual s’avaluarà amb l’addició d’un substrat i la detecció del producte. En funció de la intensitat del color es podrà conèixer la concentració de la proteïna gràcies a patrons, solucions amb una diferent concentració ja coneguda de la proteïna a analitzar.
Separació de proteïnes mitjançant immunoprecipitació.
A una preparació d’un extracte cel·lular s’afegeix un anticòs primari que s’unirà a una proteïna específica. A continuació s’afegeix la proteïna A-Sepharosa que sedimentarà al fons i mitjançant rentats s’eliminarà la resta. D’aquesta manera s’ha fet una purificació de proteïnes amb un anticòs. S’ha purificat la proteïna i no la cadena polipeptídica ja que prèviament no s’havia introduït SDS. Finalment es fa una electroforesi en gels de poliacrilamida amb SDS i BME per separar la proteïna purificada en les seves cadenes polipeptídiques i conèixer la seva massa molecular.
Determinació de l’associació entre polipèptids mitjançant immunoprecipitació i western blod La immunoprecipitació permet la purificació d’un complex proteic i aquest és dividit en les seves cadenes polipeptídiques mitjançant l’electroforesi amb gels de poliacrilamida amb SDS i BME. Mitjançant western blot seria possible obtenir el pes molecular de cada una de les cadenes i establir interaccions. Si en un extracte anti A, per exemple, es troba una resposta anti B vol dir que hi ha una interacció entre A i B.
ASPECTES TERMODINÀICS DEL PLEGAMENT DE PROTEÏNES El plegament d’una cadena polipeptídica és un procés on augmenta l’ordre i que per tant està desafavorit entròpicament ΔS < 0. Sabem, però, que aquest procés es dóna, i per tant ΔG < 0.
Per què això sigui possible hi ha d’haver algun enllaç que es formi a la forma plegada i no a la desplegada que provoqui una disminució de l’entalpia que contraresti l’entropia negativa.
Possibles enllaços Els possibles enllaços que podrien formar-se i provocar aquesta disminució d’entalpia podrien ser covalents o no covalents.
L’enllaç covalent que podria formar-se és l’enllaç disulfur. No obstant, tot i formar-se’n algun de nou, no se’n formen masses i per tant la seva formació no contribueix en la formació de l’estructura plegada.
Pel que fa als enllaços no covalents, pot donar-se una interacció càrrega - càrrega, es poden formar enllaços d’hidrogen o bé poden donar-se interaccions de Van der Waals. Les interaccions càrrega – càrrega es donen quan, amb el plegament de la proteïna, queda una molècula amb càrrega positiva a prop d’una amb càrrega negativa. Això però no passa gaire i per tant no contribueix. Si bé al tallar els enllaços d’hidrogen d’una proteïna plegada aquesta perd la seva estructura terciària i es desplega, aquests també poden formar-se abans del seu plegament, per tant contribueixen a l’estabilitat però no al plegament de la proteïna. Per últim les interaccions de Van der Waals es donen entre molècules sense càrrega però amb una distribució asimètrica de càrrega (dipols). Aquest tipus d’enllaç decau molt ràpidament amb la distància, per tant la proteïna ha de tenir una estructura molt compacta per a que es donin. És el component entàlpic més important que fa que una proteïna es plegui. La interacció pot ser dipol – dipol, dipol – dipol induït, quan la presència d’un dipol crea l’altre, o forces de dispersió de London, quan la fluctuació de càrregues de dos grups sense moment dipolar que es troben molt a prop es dóna de manera coordinada. La distància és un component molt important en aquestes interaccions: l’estructura de les proteïnes globulars ha de ser molt compacta perquè puguin donar-se.
Plegament en medi aquós El fet que el plegament de les proteïnes es doni en un medi aquós és un aspecte molt important per explicar l’energia de Gibbs negativa del procés ja que, encara que la proteïna en perdi, l’aigua guanya desordre.
A prop d’un component hidrofòbic l’aigua forma estructures molt ordenades, per tant li beneficia que la proteïna es plegui de manera que els residus hidrofòbics es disposin a l’interior i poder així perdre aquest ordre. D’aquesta manera es redueix l’augment d’ordre global del procés.
El component entàlpic i l’efecte hidrofòbic permeten que el plegament de les proteïnes sigui energèticament possible. Globalment interessa que el plegament d’una proteïna doni una estructura estable però tampoc massa, doncs cal que també es pugui desplegar.
La mioglobina té una entropia positiva perquè està formada per molts residus hidrofòbics que fan que, en el procés de plegament, l’aigua guanyi molt desordre.
Desnaturalització de proteïnes Si es va augmentant la temperatura d’una proteïna arriba un moment en què ΔH < -TΔS (ΔH > TΔS) i que per tant ΔG > 0. Això provoca la desnaturalització (pèrdua de l’estructura terciària) de la proteïna. Es tracta d’un procés cooperatiu, o tot o res.
Moltes vegades, en desnaturalitzar-se, les proteïnes precipiten per la unió de residus hidrofòbics i la formació d’un agregat gran. Això, però, no passa sempre. En presència d’un detergent com l’SDS l’efecte hidrofòbic s’anul·la, ja que el aquest fa de pont en la unió de les proteïnes i l’aigua, i hi ha desnaturalització. En aquest cas, però, no hi ha precipitació perquè s’evita la formació de l’agregat.
Un altre mètode de desnaturalització és l’addició de sal en una solució de proteïnes. La sal competeix amb aquestes interaccionant amb l’aigua i provocant que les proteïnes reaccionin entre elles i precipitin.
Flexibilitat L’estructura d’una proteïna és força rígida a la seva part central, on hi ha molts enllaços de Van der Waals, però no tant a les parts de l’exterior, que admeten un cert grau de flexibilitat. En aquestes parts no hi ha una gran contribució de les forces de Van der Waals i solen haver-hi molts residus amb càrrega positiva i negativa.
CINÈTICA DEL PLEGAMENT DE PROTEÏNES Paradoxa de Levinthal Suposant tres possibilitats de conformació per cada residu en el plegament d’una proteïna de 100 residus hi hauria 3100= 5·1047 conformacions diferents. Si la cerca de la conformació estable es fes per atzar, suposant 10-13 segons per conformació, es necessitarien: El plegament de les proteïnes, però, no es dóna completament a l’atzar sinó que l’estructura s’anirà fixat a mesura que es vagin donant les conformacions correctes de manera que s’accelerarà el procés de plegament.
Procés de plegament 1. Nuclis d’estructuració. Algunes parts de la proteïna adopten una configuració secundària definitiva. Normalment adopten estructures regulars com hèlix α o làmina β.
2. Glòbul fos. Els nuclis d’estructuració es van estenent i es van unint entre ells. L’estructura secundària ja és gairebé definitiva, però encara no ho és la terciària. La majoria de residus hidrofòbics es troben cap a l’interior i els hidrofílics cap a l’exterior.
3. Estructura terciària definitiva. L’estructura terciària es reajusta modificant alguns enllaços, especialment disulfurs.
4. Estructura quaternària definitiva. Si hi ha diverses cadenes polipeptídiques es forma l’estructura quaternària amb l’assistència de proteïnes de la cèl·lula.
Xaperones Tot i que algunes proteïnes són capaces de plegar-se sense la intervenció de cap altre element, altres requereixen la interacció de les xaperones, que faciliten el plegament i eviten la precipitació de les proteïnes parcialment plegades. Solen ser proteïnes de xoc tèrmic (hsp – Heat Shock Proteins), que s’indueixen pel calor, i principalment hi ha dos tipus: les hsp 70 i les hsp 60.
Les proteïnes hsp 70 s’uneixen proteïnes parcialment plegades per evitar que els residus hidrofòbics que es troben a l’exterior reaccionin entre si provocant la precipitació de la proteïna. Donat que una temperatura elevada augmenta el risc de desnaturalització, a major temperatura major inducció d’aquest tipus de proteïnes.
Les proteïnes hsp 60 forment complexes dins dels quals s’intruduiran les proteïnes parcialment plegades. D’aquesta manera s’evita la interacció amb altres proteïnes i s’aporta ATP per accelerar el procés.
Reajustaments de l’estructura terciària La proteïna disulfur isomerasa (PDI) reforma els ponts disulfur formats de manera incorrecta per a que la proteïna adopti la seva conformació nativa final. Per altra banda, la proteïna prolin isomerasa (PPIs), peptidil-protil cis-trans isomerasa o rotamasa facilita l’adopció de la conformació cis del enllaços peptídics on intervé un residu de prolina. Tot i que normalment a les proteïnes els enllaços estableixen una configuració trans, quan intervé una prolina, a pesar de predominant l’enllaç trans, la diferència entre un i l’altre és menor gràcies a la interacció d’aquest enzim. Aquestes PPIs també es coneixen com a immunofilines i estan classificades en dos grups no relacionats estructuralment: les ciclofilines i els FKBPs, que són inhibits per la ciclosporina i el FK506 respectivament, els dos immunosupressors més potents coneguts.
Progrés de la reacció de plegament Una proteïna, per passar d’un estat de plegament al següent, necessita l’aportació d’una certa energia. Quan completa el seu plegament una part de la molècula (cues) pot oscil·lar de manera que la proteïna té dos estats vibracionals diferents.
Pot formar-se també una forma superestable, però donada l’alta quantitat d’energia que necessita la proteïna per formar-la és una forma molt poc habitual i augmentarà la probabilitat a major edat de la cèl·lula. Poden donar-se canvis mutacionals que afavoreixin la forma superestable de la proteïna. El problema d’aquestes formes és que són tant estables que és complicat eliminar-les i una concentració massa elevada pot ser tòxiques. S’anomenen també proteïnes amildogèniques i solen ser riques en làmina beta. El quadre següent mostra exemples de patologies causades per una acumulació d’aquestes proteïnes.
Malaltia Proteïna defectiva Malaltia de Alzheimer Proteïna amiloide β Esclerosi Lateral Amiotròfica (ELA) Superòxid dismutasa Malaltia de Hintington Huntingtina (amb expansions polyE) Amiloïdosi de la Lisozoma Lisozima Amiloïdosi renal hereditària Fibrinògen Malaltia de Parknison Α-Sincleïna Encefalopaties espongiformes transmisibles (TSEs) Proteïna Prió CONCEPTES IMPORTANTS Definir què és l’estructura primària d’una proteïna.
Entendre com s’identifica l’estructura primària d’una proteïna.
Dissenyar un abordatge experimental per identificar l’estructura primària d’una proteïna.
Obtenir l’estructura primària d’una proteïna a partir de les dades experimentals.
Definir l’estructura secundària d’una proteïna (disposició local que adopta la cadena polipeptídica; conformació local que adopten els Aa dins la cadena polipeptídica) Entendre quin grau de flexibilitat té la cadena polipeptídica i com aquesta varia amb els residus que la formen. Residus petits + flexibilitat, + tipus d’estructures sec Descriure les característiques principals de l’hèlix alfa i de la làmina beta Citar altres estructures secundàries descrites a les proteïnes Indicar les característiques principals de les proteïnes fibroses Descriure l’estructura de la triple hèlix del col·lagen Diferenciar les característiques d’una proteïna fibrosa i una globular.
Entendre que són l’absorbància i la fluorescència i de què depenen Determinar la concentració d’una proteïna a partir de la seva absorbància (llei de LambertBeer) Saber que l’estructura secundària es pot predir a partir de l’estructura primària.
Definir què és l’estructura terciària d’una proteïna i què és un domini.
Indicar en què consisteix la difracció de raigs X i com s’apliquen a la determinació de l’estructura terciària d’una proteïna.
Definir què és l’estructura quaternària d’una proteïna.
Interpretar experiments als que es combini la cromatografia d’exclusió molecular i l’electroforesi per a calcular l’estructura quaternària i la massa molecular de les subunitats.
Entendre en què consisteixen els experiments de western blod i com determinen la presència d’una proteïna en una barreja.
Entendre com els experiments de co-immunoprecipitació i western blod ens indiquen que dos proteïnes es troben associades.
Entendre quines són les contribucions entàlpica i entròpica al plegament de les proteïnes.
Explicar en què consisteix l’efecte hidrofòbic.
Indicar per què la desnaturalització de les proteïnes és un procés cooperatiu.
Citar condicions que promouen la desnaturalització i precipitació de proteïnes.
Entendre les característiques bàsiques del plegament de proteïnes: fixació progressiva d’estats parcialment estables.
Enumerar els diferents estats intermediaris en el procés de plegament i descriure’ls.
Conèixer les proteïnes que faciliten el plegament i descriure la seva funció.
Indicar què són les proteïnes amiloidogèniques, com es generen i per què són perjudicials.
...