Tema 8 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 11
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 16
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 Tema 8. Quantificació cel·lular, test de citotoxicitat i mort cel·lular MÈTODES DE QUANTIFICACIÓ MÉS UTILITZATS EN CULTIUS CEL·LULARS Per tal de quantificar en cultius cel·lulars, les formes més senzilles és mitjançant hemocitòmetres o recomptadors automàtics. Tenim altres eines per fer recompte ja que quan les cèl·lules no creixen adherides sinó formant grumolls és molt difícil fer el recompte; en aquest cas es fa recompte de nuclis que al ser més petits que les cèl·lules apareixen separats.
També hi ha recomptes de viabilitat cel·lular que comprenen mètodes senzills com són els colorimètrics. En trobem de 3 tipus:  MTT. Assaig colorimètric sensible i útil per processar moltes mostres. Permet mesurar tant la viabilitat com la proliferació. Necessita d’un espectrofotòmetre d’scanning.
 Neutral red (NR). Assaig colorimètric sensible i útil per processar moltes mostres. Necessita d’un espectrofotòmetre d’scanning-  LDH. Assaig colorimètric sensible i útil per processar moltes mostres. Necessita d’un espectrofotòmetre de banda estreta.
Hemocitòmetre L’hemocitòmetre és un porta excavat i en aquesta part excavada hi ha una regió marcada per una sèrie de línies. Es compten les cèl·lules que hi ha a la regió central, entre la part excavada i el cobreobjectes hi caben 10 -4 ml. Si nosaltres tripsinipzem un cultiu, resuspenem i agafem una mostra i la posem a l’hemocitòmetre sabem el nombre de cèl·lules que hi ha a 10-4 ml, de manera que ho podem extrapolar a la quantitat de medi total que tenim i també podem saber quant líquid hem d’agafar si volem cultivar un nombre concret de cèl·lules. Metodologia simple, no subjecta a errors i és bastant fiable, s’utilitza bastant.
Comptadors cel·lulars automàtics Els comptadors cel·lulars automàtics s’utilitzen en laboratoris que han de fer molts recomptes. Es basa en fer passar el líquid on tenim les cèl·lules per un espai on hi ha un corrent que, cada vegada que passa una cèl·lula, es veu modificat i així pot fer el recompte cel·lular. És més fiable. Es pot saber el tipus de cèl·lula que tenim. Cars, requereixen manteniment. Hi ha sistemes mixtes (manuals i automàtics): posem la càmera de Neubauer a una màquina que ens diu les cèl·lules que hi ha.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 Recompte de nuclis A la imatge veiem un embrió tot i que podria semblar un grumoll. Cal tenir present que quan tenim grumolls es fa servir la mateixa metodologia ja que això ens permetrà diferenciar les cèl·lules.
En aquest cas s’ha fet una tinció de nuclis. Observem que alguns estan marcats en rosa (externs) i altres en blau (intern). Aquesta tècnica s’utilitza poc, només per cèl·lules que creixen en suspensió i formen grumolls al créixer.
Mètodes colorimètrics Assaig MTT L’assaig MTT s’utilitza molt i hi ha moltes variants comerciants. Totes les variants es basen en el mateix, en la capacitat de les deshidrogenases mitocondrials per transformar un substrat, el MTT que és de color groc, en un producte, el formazan que és de color blau fosc i insoluble en aigua i forma cristalls.
Si tenim un cultiu cel·lular, la quantitat de cristalls de formazan que es produeix ve determinat pel nombre de cèl·lules que tenim en el cultiu. Per tant, si establim una corba podrem determinar quin és el número de cèl·lules que tenim.
Per visualitzar la quantitat de formazan que s’ha produït el que se sol fer és lisar les cèl·lules i dissoldre el formazan en clorhídric i aleshores determinar la concentració.
Aquest mètode s’utilitza en assajos de toxicitat de drogues com per exemple drogues antitumorals. L’eficàcia d’aquestes drogues induint la mort cel·lular es pot estudiar mitjançant aquest mètode.
Veiem un exemple on tenim dos tipus cel·lulars A i B; testarem l’eficàcia d’una droga cel·lular a dues línies diferents i això ens donarà una idea de quina de les dues és més sensible.
Per elaborar l’experiment el que es fa és cultivar les dues cèl·lules i quan aquests cultius estan més o menys desenvolupats s’elimina el medi i s’introdueix la droga en concentració creixent (de d’esquerra a dreta). Cal tenir present que els pous dels extrems els deixem de control. A continuació s’elimina del medi la droga i es deixa recuperar les cèl·lules en un medi amb MTT. Per tant, allà on hi hagi més cèl·lules hi haurà una concentració més elevada de formazan.
Podem observar que en relació a les dues columnes que no hem tractat amb la droga, hi ha un punt que fa referència a la meitat de formazan. Amb aquesta concentració de droga hem matat el 50% de les cèl·lules inicials. Per tant, podem determinar que la cèl·lula A és més sensible a la droga ja que necessitem menys quantitat de drogar per matar la meitat de cèl·lules.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 Aquest sistema s’utilitza per determinar la sensibilitat de línies cel·lulars diferents i també l’eficàcia d’una determinada droga. Als gràfics podem veure com la sensibilitat a la droga varia en funció de la línia cel·lular. Quan treballem amb cultius és important saber que la sensibilitat d’una línia cel·lular enfront una determinada droga pot variar en funció de les condicions del cultiu. Observem al gràfic del mig que es van cultivar unes cèl·lules en presència de feeder layer i en absència de feeder layer; la sensibilitat de les cèl·lules que es cultiven amb feeder layer és menor a quan es cultiven sense feeder layer. Així doncs, les presència d’estructures que fan que el cultiu sigui més similar al que passa in vivo les cèl·lules són menys sensibles. És per aquest motiu que, a vegades, quan s’han utilitzat cultius cel·lulars per determinar la sensibilitat de cèl·lules enfront una determinada droga, si no s’han fet cultius tridimensionals, donen in vivo resultats no tant bons com in vitro ja que la cèl·lula modifica la resposta a determinades drogues en funció de l’ambient en el qual es troben.
Neutral red El neutral red és un component que s’acumula en els lisosomes de les cèl·lules viables i per tant amb una cobra dosi – efecte, la quantitat de neutral red que s’ha incorporat a les cèl·lules està en relació amb el nombre de cèl·lules que tenim en el cultiu.
Un cop hem fet el tractament, solubilitzem el neutral red amb àcid acètic o etanol i mesurem l’absorbància per saber el número de cèl·lules. Aquest sistema i l’anterior ens permeten saber el nombre de cèl·lules viables que tenim en un cultiu.
Podríem fer alguna cosa semblant amb el que hem fet amb el MTT per a una droga i dues línies cel·lulars.
Assaig de la lactat deshidrogenasa (LDH) El sistema de lactat deshidrogenasa es fa servir en cultius en bioreactors, és a dir, de gran escala i té un avantatge i és que en aquest cas no cal cultivar cèl·lules per fer l’assaig. Simplement agafant una alíquota del sobrenedant del medi ens fa tenir una idea de com tenim el nostre cultiu.
Les cèl·lules a mesura que es van morint, entre altres coses, alliberen LDH al medi. Per tant, com més cèl·lules es moren, més LDH hi ha en el medi. Per tant, podem agafar una alíquota i analitzar la concentració d’aquesta proteïna. Per fer-ho més senzill i no haver de purificar la proteïna, s’afegeix piruvat i NADH i es veu si es forma lactat i NAD+.
+, La reducció està unida a la oxidació de NADH fins NAD que pot ser seguida espectofotomètricament a 340 nm, ja que el + NADH té una absorbància elevada a 340 nm comparat amb el NAD .
+ Si el cultiu es viable i no hi ha mort cel·lular no trobarem NAD , en canvi, si es comencen a morir cèl·lules sí que en trobarem. En cultius tancats i a gran escala (bioreactors) això és molt important ja que ens permet veure quina és la seva “salut”.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 DUPLICACIONS DE LA POBLACIÓ CEL·LULAR Encara que dos persones cultivin el mateix nombre de cèl·lules pot ser que un obtingui més cèl·lules finals que l’altre i això pot ser degut a que les cèl·lules inicials ja havien fet un cert nombre de divisions. Quan treballem amb línies finites és molt important.
El valor de PD ens dóna una idea més fiable del número de vegades que s’han duplicat les cèl·lules. Si tenim estandarditzat un cultiu, tripsinitzem i posem la meitat de cultiu en un flascó i l’altre meitat en un altre, tindran el mateix PD.
TEMPS MIG DE GENERACIÓ (MGT) EN H No totes les línies cel·lulars proliferen a la mateixa velocitat i el temps mig de generació ens indica quant triga una població cel·lular en duplicar el nombre de cèl·lules. És important que aquests càlculs els elaborem en un període de temps on les cèl·lules estan creixent exponencialment.
.
El temps mig de generació ens permet tenir una idea del cicle cel·lular. Si partim de cultius primaris pot passar que no totes les cèl·lules siguin proliferants, per tant, hem de buscar un sistema que ens permeti veure si totes les cèl·lules que tenim en el cultiu són proliferants o no. Cal tenir present la fracció proliferant ja que si les cèl·lules no són proliferants, no contribueixen al creixement del nombre de cèl·lules.
Els monòcits són uns tipus cel·lulars que tenen una fase de lag molt gran i poden trigar de 2 a 4 setmanes a començar a créixer.
Quan parlem de línies cel·lulars, normalment són proliferants ja que les que no proliferen desapareixen. En un teixit sí que es podria donar el cas on trobem línies no proliferants.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 FASES DEL CICLE CEL·LULAR I DURADA Quan quantifiquem ens pot interessar veure la durada del cicle cel·lular, quant triga una cèl·lula en dividir-se i sobretot quant triga cadascuna de les fases del cicle cel·lular.
Per saber quina és la durada del cicle cel·lular, normalment, a cèl·lules que estan en creixement exponencials se’ls hi fa un tractament de 30’ amb un nucleòtid marcat com ara la timidina. Les cèl·lules que durant aquest període estaven en fase S, hauran incorporat aquest element i les que no ho estaven, no ho hauran incorporat, és a dir, no més ho incorporen aquelles que estaven replicant. A partir d’aquí fem un subcultiu i anem comptant el nombre de mitosis marcades i que per tant estaran estaven en fase S. Les marcades són les LM i les no marcades UM.
A partir d’haver fet aquest pols, cada X temps anem traient una alíquota i mirem quantes mitosis estan marcades i quantes no. Obtenim una corba del tipus: A partir d’un cert moment comencen a aparèixer mitosis marcades, al començament hi ha un % petit però va augmentant fins arribar a un punt on totes les mitosis estan marcades ja que totes les cèl·lules que arriben a aquest temps en mitosi estaven en fase S. Després veiem que torna a baixar ja que aquí trobem cèl·lules que quan vam fer el pols estaven a G1 i per tant que no estaven marcades. Al cap d’un cert temps apareix un cert pic i que fa referència a les cèl·lules que van patir la primera divisió i ara apareixen en la segona. A partir d’aquí la cosa es desincronitza una mica.
La llargada entre els dos pics ens indica aproximadament la durada del cicle cel·lular. El temps que hi ha entre el 50% de mitosis marcades a la corba descendent i el 50% de mitosis marcades a la corba descendent ens indica la durada aproximada de la fase S. Per una altra banda, veiem que la part inicial del gràfic fa referència a la durada de la fase G2 més la meitat de la durada de la mitosi.
Sabent això podem arribar a calcular quina és la durada de la mitosi: L’índex mitòtic fa referència al nombre de cèl·lules dividides respecte el total de cèl·lules comptades.
Si nosaltres volem tastar l’efecte d’una droga durant la fase S, ens interessa que la majoria de cèl·lules del nostre cultiu estiguin en aquesta fase S, llavors farem el tractament i veurem quin és l’efecte.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 MORT CEL·LULAR Fins ara hem parlat de viabilitat cel·lular però cal tenir present que les cèl·lules en cultiu poden morir. En alguns casos les cèl·lules poden morir sense haver afegit cap droga. Clàssicament, la mort cel·lular s’associa a dos tipus principals de fenòmens: necrosi i apoptosi.
 Apoptosi. L’apoptosi es caracteritza perquè el nucli de la cèl·lula es comença a fragmentar i finalment la cèl·lula també acaba fragmentantse en petits fragments cel·lulars. L’important de l’apoptosi és que els fragments cel·lulars, inclús els fragments del nucli, conserven l’estructura que tenien en la cèl·lula. Per tant, els fragments del nucli continuen tenint l’embolcall nuclear de doble membrana. A nivell estructural, tot i que la cèl·lula es disgrega, conserva el balanç osmòtic.
L’apoptosi és una mort cel·lular programada.
 Necrosi. El procés de necrosi està més associat a problemes de cops, etc. En aquest cas la mort cel·lular implica una pèrdua del balanç osmòtic, és a dir, es produeix una lisi. Normalment, en els organismes la necrosi està associada a processos inflamatoris. Actualment s’ha vist que a nivell molecular, la necrosi també està regulada i per tant afirmen que quan parlem de mort cel·lular programada no només hem de parlar d’apoptosi sinó que també de necrosi.
Mort cel·lular en cultius En els cultius cel·lulars, es pot donar apoptosi en una amplia varietat de circumstàncies:  Eliminació de factors de creixement en línies cel·lulars que creixen a densitats elevades.
 Diferenciació terminal de les cèl·lules in vitro.
 Nombre de divisions finit.
 Exposició a agents citotòxics, etc.
Les restes de cèl·lules apoptòtiques, que en un teixit normal són fagocitades pels macròfags, en el cultiu queden en el medi i poden provocar altres tipus de mort com la necròtica. Així doncs, tot i no ser un procés inflamatori, en cultius cel·lulars, es pot produir una mort per necrosi.
Sovint, la mort cel·lular programada es considerava que era únicament l’apoptosi i la necrosi es considerava com una mort cel·lular no programada. Avui dia sabem que hi ha mecanismes cel·lulars que participen en la necrosi i que per tant no és tan fàcil aquesta discriminació 6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 Altres sistemes de programació de mort cel·lular A part de l’apoptosi i la necrosi trobem altres tipus de mort cel·lular clàssica com ara l’autofàgia o la entosi.
Per una banda, l’autofàgia es dóna quan les cèl·lules estan privades dels nutrients necessaris, és un procés que es dóna de forma natural. En aquestes circumstàncies són capaces d’envoltar amb el seu reticle endoplasmàtic porcions del citosol i inclús orgànuls. Aquests embolcalls són fusionats amb lisosomes i degradats per tal d’obtenir compostos d’interès. L’autofàgia es dóna sobretot en teixits especialitzats en secreció que sintetitzen enzims digestius i així quan arriba un senyal es podrà respondre ràpidament. El procés d’autofàgia és un procés natural que es dóna en condicions extremes (per exemple quan no mengem) que en cultius també es pot produir si deixem de subministrar a les cèl·lules determinats nutrients. L’autofàgia pot ser reversible i si no es reverteix, es produeix la mort total.
Pel que fa a l’entosi trobem que es dóna quan cultivem cèl·lules epitelials i aquestes encara no s’han adherit. Recordem que els epitelis tenen tendència a formar capes estratificades (com ara a l’epiteli intestinal) i que es produeixen unions entre les cèl·lules que són impermeables. Així doncs, les cèl·lules epitelials tenen tendència a formar unions estretes amb les cèl·lules veïnes, formant una monocapa, però quan aquestes cèl·lules estan en suspensió i intenten establir aquestes unions, com que no estan aposentades sobre una matriu extracel·lular, a vegades les unions que es fan es produeixen envoltant altres cèl·lules veïnes. No es tracta de cèl·lules que tinguin tendència a fagocitar sinó a l’intentar establir unions, envolten altres cèl·lules i les acaben digerint.
Importància dels factors tròfics Una altra característica dels cultius és que tota cèl·lula necessita estímuls per mantenir-se viva, necessita de factors tròfics. Pot ser que en un cultiu cel·lular no haguem afegit tot per tal que les cèl·lules puguin créixer correctament, és a dir, si no posem factors de creixement o tot allò que necessitem per proliferar, s’induirà l’apoptosi. A vegades, tot i tenir els factors de creixement que necessiten, hi ha cèl·lules que necessiten d’altres estímuls que són el que s’anomenen factors tròfics. Sabem que les cèl·lules per mantenir-se vives necessiten ser estimulades per factors tròfics i aquests a vegades no es troben en el cultiu perquè no es coneixen.
Veiem un exemple de la importància dels factors tròfics en els ratolins. Veiem que els ratolins durant el seu desenvolupament embrionari produeixen tot una sèrie de neurones. Els ratolins mutants que no són capaços de produir el factor de creixement nerviós o que no són capaços de produir el seu receptor, s’ha vist que durant el desenvolupament es produeixen totes les neurones necessàries però hi ha unes que al cap del temps desapareixen.
Veiem que si hi ha aquesta mutació desapareixen les neurones que contactaven amb la pell i tot haver-hi crescut, com que no rebien els estímuls tròfics per mantenir-se amb vida, es moren i desapareixen.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 SI hi ha mutació en un altre factor de creixement (NT – 3) o en el seu receptor, són unes altres neurones les que es veuen afectades: les que van al múscul.
Per tant, cada tipus cel·lular requereixen per mantenir-se vives, uns factors tròfics. Quan treballem amb cultius cel·lulars que no coneixem, si no tenim els factors de creixement adequats, el que ens pot passar és que les cèl·lules se’ns morin en el cultiu. En el sèrum normalment trobem factors tròfics.
En el nostre organisme, quan els limfòcits T reaccionen i s’activen, se’ls hi programa la seva mort. Si aquests limfòcits queden actius i vius durant molt temps podem tenir malalties associades.
DETECCIÓ DE CÈL·LULES APOPTÒTIQUES A continuació veurem diferents sistemes que ens permetran determinar si en un cultiu cel·lular s’està produint mort cel·lular o no.
Caracterització morfològica La caracterització morfològica no és fàcil d’utilitzar, i per tant, no és el més adequat. Veiem unes imatges d’unes cèl·lules a les quals se’ls indueix apoptosi i necrosi.
Recordem que a l’apoptosi, a les fases inicials, els nuclis de les cèl·lules perden la seva forma esfèrica i es comencen a separar com en nuclis globulars. En canvi, en el procés necròtic observem una pèrdua del balanç osmòtic de la cèl·lula, per tant la cèl·lula s’infla i lisa.
Si treballem amb un tipus cel·lular que coneixem perfectament sí que podríem diferenciar una cèl·lula apoptòtica d’una necròtica però això no sol ser massa habitual ni massa útil.
Tinció nuclear La tinció nuclear ens dóna una idea més acurada si la cèl·lula està en apoptosi o no. A la imatge veiem cèl·lules Jurkat que és una línia limfoblastoid on els nuclis s’han tenyit amb dos compostos. Sabem que en la inducció de l’apoptosi hi ha dues vies: intrínseca i extrínseca. Pel que fa a la via extrínseca, es veu estimulada per una molècula que es coneix com lligand fas que quan interacciona amb el seu receptor s’activa l’apoptosi. Podem observar que en presència o absència d’aquest lligand la morfologia canvia.
En aquest cas tenim una visió més objectiva ja que únicament ens fixem en el nucli i no en tota la cèl·lula com fèiem abans.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 Detecció de la translocació de la fosfatidil serina Un altre mètode per determinar l’apoptosi és mitjançant la utilització de l’annexina que és un anticòs que s’uneix a la fosfatidil serina, un fosfolípid de membrana que se sol trobar a la monocapa interna.
En les cèl·lules apoptòtiques hi ha una flipasa que s’activa i que transporta aquest fosfolípid de la membrana interna a la externa. Per tant, si fem un marcatge de la fosfatidil serina amb un anticòs, observarem que les cèl·lules apoptòtiques donaran senyal, en canvi les cèl·lules normals no ja que la fosfatidil serina es troba a la monocapa interna i el marcatge no pot arribar. A les cèl·lules necròtiques, com que la seva membrana s’està trencant, també presentaran marcatge ja que per aquestes zones pot entrar l’anticòs i marcar el fosfolípid.
Així doncs, necessitem d’un altre colorant que ens permeti distingir entre les cèl·lules apoptòtiques i necròtiques. El que es fa és un marcatge del DNA amb un colorant que és impermeable per la membrana (DAPI o IP). Per tant, les cèl·lules necròtiques, a part del marcatge de la fosfatidil serina també presentaran marcatge de DNA ja que el colorant podrà entrar al nucli degut que la membrana està feta malbé. En canvi, en les cèl·lules apoptòtiques la membrana està intacta, i per tant, el colorant no pot entrar i no hi haurà marcatge.
Detecció de l’activitat de la caspasa 3 Podem fer també marcatge de les caspases actives. Les caspases les trobem en forma de procaspasa a la cèl·lula i estan inactives. Per activar-se s’ha d’elaborar un tall proteolític i així esdevenir en caspases. La caspasa 3 desencadena un paper fonamental en la via extrínseca i intrínseca de l’apoptosi, de manera que per tal de determinar si s’està produint apoptosi, podem detectar la caspasa 3.
Per tal de detectar les cèl·lules apoptòtiques el que es fa és marcar la fosfatidil serina i la caspasa 3. En aquest cas concret, el marcatge de la fosfatidil serina es fa amb annexina (com en el cas anterior) i el marcatge de la caspasa es fa de forma indirecta; es tracta d’un substrat específic per la caspasa 3 que quan està activa el talla i només en aquestes condicions s’uneix al DNA i emet fluorescència. A la imatge veiem una cèl·lula apoptòtica.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 Mètode túnel El mètode túnel també el podem utilitzar per detectar apoptosi tot i que no és específic per això. Aquest mètode ens permet detectar extrems 3’ lliure en el DNA. El que fa aquest nucleòtid és incorporar nucleòtids marcats, per exemple, amb fluorescència.
En una cèl·lula humana sabem que tenim 43 cromosomes i en cadascun hi ha 2 extrems 3’ lliures, per tant, el marcatge que farem serà relativament feble. Quan el DNA es degrada hi ha una major quantitat d’extrems 3’ lliures i per tant, si nosaltres apliquem una metodologia que ens permeti marcar els extrems 3’ lliure, trobarem diferències entre una cèl·lula normal i una altra apoptòtica, on el DNA que trobem entre els nucleosomes s’està degradant.
Aquest mètode ens serveix per detectar apoptosi però no és exclusiu. Per exemple, si nosaltres sotmetem a les cèl·lules a un tractament de radiacions ionitzants, estarem trencant el DNA, i també tindrem un marcatge positius.
Veiem un exemple de tinció de cèl·lules tumorals, de compostos que s’utilitzen per intentar induir l’apoptosi. Observem que hi ha cèl·lules on els nuclis es veuen lobulats (característic de l’apoptosi) i el marcatge s’ha produït perquè el DNA està fragmentat i per tant hi ha extrems 3’ lliure (color groc).
Aquest mètode s’utilitza per veure l’eficàcia de drogues antitumorals, per veure si indueixen l’apoptosi. Aquestes drogues no produeixen trencament en el DNA, sinó que produeixen apoptosi i com a conseqüència d’això es trenca el DNA. Per tant, no són agents clastogènics.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T8 Altres mètodes per la detecció Si tenim una població de cèl·lules on s’està produint apoptosi i extraiem el DNA, quan elaborem una electroforesis, obtenim imatges del tipus: Com que el DNA es va degradant i l’únic que trobem són els fragments de nucleosomes. Si tot el DNA estigués degradat ho veuríem com el carril 0 o 1.
Si es treballa amb el gradient de densitat, s’ha vist que les cèl·lules apoptòtiques tenen una densitat diferent al de les cèl·lules no apoptòtiques. Aquest fet ens permet diferenciar-les i inclús aïllar-les sin ens interessa treballar amb elles.
11 ...