Biocatàlisi Tema 4 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biocatàlisi
Año del apunte 2015
Páginas 6
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 13

Vista previa del texto

1 INTRODUCCIÓ: QUÈ SÓN ELS ENZIMS? 2 CLASSIFICACIÓ I NOMENCLATURA DELS ENZIMS.
3 CINÈTICA ENZIMÀTICA (I).
4 CINÈTICA ENZIMÀTICA (II).
4.1 INTRODUCCIÓ La cinètica s’ocupa d’analitzar els enzims des del punt de vista de la seva activitat. Quan determinem aquest paràmetre, a més, podem obtenir informació d’altres aspectes de l’enzim. Per exemple: un canvi en les condicions de la reacció sobre un enzim em pot donar informació sobre el seu mecanisme. Escollim com a variable el pH, i veiem que hi ha una zona de l’escala de pH en que l’activitat de l’enzim és màxima (pH òptim).
En aquest rang de valors, el pH em defineix el millor estat d’ionització dels aminoàcids per a la catàlisi.
Tanmateix, cal dir que no sempre les dades cinètiques representen un mecanisme. Si els valors cinètics s’ajusten al mecanisme proposat, això ens indica que és possible que es dóni. Si no s’ajusten el mecanisme es descarta. Llavors ens caldrà fer més aproximacions estructurals i cinètiques per comprovar que realment el mecanisme s’ajusta al funcionament de l’enzim.
El model més simple d’anàlisi és l’anàlisi de la reacció S → P, tot i que no per això és la reacció més freqüent.
L’equació de Micaelis-Menten explica matemàticament el comportament dels enzims que catalitzen aquest tipus de reaccions. Tanmateix, la que s’utilitza és la de Briggs-Haldane que té unes petites variacions que s’ajusten més al comportament general dels enzims.
L’ordre d’una reacció ens diu el nombre de molècules que han de xocar simultàniament perquè la reacció es produeixi. En aquest cas tenim una reacció de primer ordre A→B. La velocitat d’una reacció de cinètica de primer ordre la definim com la formació de producte en el temps o bé la disminució de substrat en el temps, tot això multiplicat per una constant experimental (k).
Les reaccions de segon ordre depenen de la concentració de dos substrats, dues molècules, que poden ser iguals o diferents. Dins d’aquestes podem trobar les reaccions de pseudo-primer ordre, com són les reaccions d’hidròlisi en solució aquosa. El canvi de concentració d’aigua respecte tota la quantitat que hi ha en l’entorn és tan petit que considerem que l’efecte de la reacció sobre la concentració d’aigua és despreciable; per tant la velocitat de la reacció només depèn de la concentració de substrat hidrolitzat.
També són importants les reaccions d’ordre 0, on la velocitat és igual a una constant. Es dóna en una reacció de primer ordre, a concentracions molt altres de substrat, un cop superada la primera fase de creixement exponencial (que és d’ordre 1).
Es sabia que treballant a concentracions de substrat més grans que de producte en analitzar a diferents concentracions de S la velocitat inicial, s’obté una gràfica que s’ajusta a una corba hiperbòlica. Les deduccions de Micaelis-Menten i Briggs-Haldane tenen com a objectiu obtenir una explicació matemàtica que ens permeti determinar els paràmetres cinètics de la reacció i que s’ajusti als resultats experimentals de la gràfica.
El mínim que sempre hem de considerar com a procés intermig és el procés de formació del complex ES. Un cop format, però, aquest s’ha de transformar altre cop (a E+P). Aquesta és l’etapa limitant del procés. La constant de l’equació d’aquesta etapa és la k2. En molts casos, k2 és la kcat de la reacció.
En funció de la concentració de substrat tenim diferents tipus de reacció. Quan tenim concentracio de S alta, l’enzim estarà al màxim possible unit amb S, formant el complex ES. En aquestes condicions la velocitat és independent de S, i la reacció és d’ordre 0. Considerem que tot l’enzim E està formant complex ES. Si, per contra, les concentracions de substrat són molt baixes, la velocitat de la reacció dependrà de forma directament proporcional a S.
4.2 SUPÒSITS DE L’EQUACIÓ DE MICAELIS-MENTEN. MODEL DE L’EQUILIBRI RÀPID.
L’equació va ser deduïda el 1913. Es basa en què en la primera etapa del procés, la de formació del complex ES, es dóna de forma molt ràpida i per tant la k de formació i dissociació d’aquest complex és la que tenim en compte. L’etapa transformació del complex ES en E+P no es té en compte.
1 La concentració de substrat inicial és molt més gran que la concentració d’enzim inicial [So>Eo].
2 No hi ha formació de producte. [P]=0 3 E+S ↔ ES es forma i es desfà instantàniament i l’equilibri es manté en tota la reacció.
4 L’etapa ES → E+P sempre és molt més lenta que la de dissociació d’ ES → E+S. Aquest és el punt feble de l’equació de Micaelis, doncs hi ha molts enzims que no compleixen aquest supòsit.
El què volem és tenir una expressió que ens permeti quantificar els paràmetres cinètics de la reacció (constants) a partir d’informació que puc saber de la reacció. No tenim mètodes per saber la concentració de complex enzim-substrat al medi [ES]. Per això he d’arribar a una expressió que es pugui expressar en termes de concentració d’enzim i substrat per separat.
Igualo l’equació de velocitat de formació del complex ES i l’equació de la velocitat de dissociació. Si la hipòtesi es basa en què l’equilibri ràpid manté constant ES puc fer aquesta aproximació matemàtica. Al final arribaré a una expressió que em diu la constant de dissociació d’ES (Ks): és el quocient de les dues constants de velocitat de les equacions que he igualat.
Per altra banda, sabem que la concentració d’enzim total en un moment donat de la reacció és la concentració d’enzim inicial menys l’enzim que està complexat. Substitueixo en l’expressió de Ks i obtinc: Reordenem l’expressió i arribem a una nova fórmula: expressió de la concentració de substrat [S] en funció de la concentració d’enzim inicial [Eo]. Tots dos són paràmetres que conec. Substitueixo [ES] i finalment obtinc l’expressió de la velocitat inicial.
Aquesta última expressió en funció de la concentració de substrat que tingui pot tenir varis significats: Si [S] és molt gran, tot ES=Eo. En aquestes condicions, tindrem la velocitat màxima de la reacció.
Finalment arribem a l’expressió deduïda per Micaelis-Menten.
4.3 APROXIMACIÓ DE BRIGGS-HALDANE. MODEL DE L’ESTAT ESTACIONARI.
Però com ja hem dit, no tots els enzims compleixen el quart supòsit. Hi ha una aproximació feta per BriggsHaldane que apliquen el principi de l’estat estacionari a l’equació de Micaelis-Menten. Ells introdueixen el supòsit que durant un temps de reacció més o menys llarg, el què es manté constant en el temps és la concentració de complex [ES], però aquest pot anar de la mateixa manera cap a formar E+P o bé E+S. Aleshores aquí sí que cal considerar la Ks.
Què és l’estat estacionari (steady-state)? La reacció té un temps inicial que s’anomena estadi pre-estacionari que dura milisegons/microsegons.
Aquest és el temps de reacció en el qual [ES] augmenta. A mesura que augmentem el temps de la reacció veiem que aquest increment de la concentració va tendint a 0. Això és degut a que es va formant a mesura que es desfà, amb la qual cosa la concentració de complex es manté constant.
En un principi tot és igual que per a la deducció de l’equació de Micaelis-Menten, però en aquest cas introduïm que el canvi d’[ES] en el temps depèn de la formació i també de la dissociació, considerant que pot anar tant cap a E+S com cap a E+P.
L’eliminació d’ES indrodueix la k2 o kcat.
Reajustant l’equació obtenim Km, la constant de Micaelis-Menten. En el numerador hi ha les constants que participen en l’eliminació d’ES, i en el denominador hi ha la constant de la formació d’aquest. Tot això ens porta a una expressió en la qual ES, que no sé, l’expresso en termes que sí que puc saber.
El model de l’equilibri ràpid és un cas particular del model de Briggs-Holdane.
Aquells enzims que ho compleixen, Km=Ks.
Quan estem a una concentració de substrat molt petita, aleshores la velocitat depèn només de [So]. En aquestes condicions la reacció és d’ordre 1.
La velocitat inicial que tinc en aquella S que té el mateix valor que la Km és la meitat de la velocitat màxima.
4.4 INFORMACIÓ CONTINGUDA EN LA GRÀFICA DE VELOCITAT INICIAL EN FUNCIÓ DE S.
1 Quan tenim una concentració de S petita, la reacció és d’ordre 1.
2 Quan la concentració de substrat és igual a la Km, la velocitat de la reacció és la meitat de la velocitat màxima.
3 A concentració de S gran, la velocitat de la reacció és màxima i és reacció és d’ordre 0.
4.5 REACCIONS ENZIMÀTIQUES AMB MÉS D’UN COMPLEX INTERMEDIARI ENZIM-SUBSTRAT.
En les dues deduccions que hem vist es complia que sempre es formava el complex ES, i que aquesta era una etapa clau per a la reacció. Però assumiem el model més simple, és a dir, el que passa directament d’ES a E+P.
Però sabem que en realitat en una reacció enzimàtica hi ha més intermediaris. El complex ES, abans de dissociar-se, esdevé el complex EP. En termes químics, hauriem de dir que totes les reaccions enzimàtiques tenen com a mínim aquesta etapa. L’objectiu de veure la deducció de Micaelis-Menten amb aquest nou intermediari és que, segons el mecanisme de la reacció, podem variar les constants macroscòpiques d’aquesta. En aquest cas, quines constants s’introdueixen al sistema i com poden afectar a les constants macroscòpiques? Els supòsits són: 1 No tenim producte, només substrat, i estem a condicions de velocitat inicial. Per tant la reacció és pràcticament irreversible.
2 La concentració d’ES i d’EP és constant durant el que dura la reacció. La velocitat en que es formen aquests complexos és igual a la velocitat a la que desapareixen.
3 La velocitat de formació de producte és igual a la velocitat de desaparició d’EP, i la velocitat de formació i desaparició d’ES i EP és la mateixa.
4 Desenvolupem l’expressió i arribem en un punt en què podem expressar-la en termes de concentració d’enzim. Ho fem amb el principi de conservació de la matèria.
5 Desenvolupem i dividim tota l’expressió entre k2+k3.
6 Observem que la Km ens queda modificada per el valor del quocient de les constants k2 i k3. Aquesta Km modificada l’anomenem Km app.
7 Substituïm la Kapp en l’expressió i la posem en funció de la concentració de complex ES 8 Sabem que la velocitat de la reacció de formació de producte és directament proporcional a k2*[ES]. Aïllo i substitueixo a l’expressió que tenia.
9 La kcat ens queda modificada, igual que la Km, per les constants k2 i k3. La gràfica, igual que l’anterior, té la mateixa forma que la d’una hipèrbole rectangular.
En general, les constants macroscòpiques que modifiquem són la Km (que esdevé Km app) i la kcat.
Ambdues queden multiplicades per el factor k3/k2+k3. Les constants modificades sempre seran més petites que les constants simples, perquè el denominador sempre serà més gran que el numerador i donarà un valor inferior a 1.
Si la k2 és molt més petita que k3, aleshores es pot despreciar i kcat=k2 i Km app=Km.
5 ...