Tema 4: Mètodes d'estudi de l'ecologia microbiana (III) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 2º curso
Asignatura Ecologia Microbiana
Año del apunte 2016
Páginas 3
Fecha de subida 10/04/2016
Descargas 9
Subido por

Vista previa del texto

Ecologia Microbiana TEMA 4 Ariadna Lòpez Coll TEMA 4: MÈTODES D'ESTUDI D'ECOLOGIA MICROBIANA (III) Hi ha un seguit de tècniques destinades a saber quina és l'activitat dels microorganismes. Quan parlem d'activitat ens referim a què poden fer els microorganismes, quin és el seu paper en l'ambient. Com que es treballa amb la mostra, ens mostren l'activitat de la comunitat, però hi ha d'altres que ens permeten saber qui fa què.
Anàlisis químiques Per veure l'activitat de la comunitat, afegim un additiu químic. Podem afegir un compost que utilitzin els reductors del sulfat (lsulfat) i mirem si es forma sulfhídric, que llavors voldrà dir que hi ha reductors de sulfat. Si augmenta la quantitat de sulfhídric i disminueix la de lactat, direm que la comunitat és reductora de sultfat. Això nomès és un exemple, ja que podem trobar molts més casos.
Mètodes radioisotopics S'utilitzen radioisòtops, un dels més utilitzat és el c14. Per exemple, per detectar activitat fotosintètica, afegim CO2 marcat radioactivament amb aquest C14, si veiem que s'incorpora a les cèl·lules, podem confirmar que hi ha activitat fotosintètica, ja que els autòtrofs són aquells que fixen CO2. Tambè es pot utilitxar el S35, per veure si es produeix sulfhídridic 35 (activitat sulfat reductora).
Si volem detectar respiració, podem afegir glucosa marcada i veure si hi ha producció de CO2 marcat o bè proporcionar a la mostra H2 35S per tal de determinar l'activitat heterotròfica. Tots aquests experiments es fa un control amb cèl·lules mortes, perquè hem d'estar segurs a que l'activitat es deguda als microorganismes i no provinent per fenòmens abiòtics. Si no detectem activitat en les cèl·lules mortes, el compost que ens apareix és degut a l'activitat dles microorganismes vius de la comunitat.
FISH-MAR Combina activitat amb l'anàlisis de la diversitat, és a dir, diversitat i quantificació. Es tracta bàsicament de FISH combinada amb Microautoradiografia (radioisòtops).
És una tècnica molt utilitzada en mostres naturals, per veure si un determinat grup de microorganismes realitzen una determinada activitat. Primer s'agafa la mostra i s'incuba amb un compost radioactiu que volem saber si la comunitat l'utilitza, és a dir, un determinat substrat. Volem saber si hi ha una comunitat incorpora CO2 marcat, és a dir, si és autòtrofa. L'incubem durant dos hores amb CO2, desrpès fixem l'aigua amb la mostra amb formaldehid, filtrem i fixem el filtre en un porta, matant els microorganismes.
Tot seguit, apliquem hibridació in situ, és a dir, la tècnica de FISH amb totes les sondes que vulguem utilitzar.
Per exemple, volem veure si les gamma bacteries han incorporat aquest CO2 marcat, llavors el filtre serà específic per aquestes. Seguidament, submergeixo el porta hibridat amb una emulsió fotogràfica, i desprès ho deixem a les fosques. La radioactivitat de les cèl·lules (que han incorporat el C14) que Ecologia Microbiana TEMA 4 Ariadna Lòpez Coll reaccionarà amb l'emulsió fotogràfica, gracies als grànuls de plata de l'emulsió. Es deixa reposar diverses hores o dies en aquestes condicions. Desprès d'aquest temps, es fa un revelat per tal de veure els resultats.
Aquells microorganismes que hagin utilitzat la glucosa marcada, emetran radioactivitat la qual reaccionarà amb la emulsió fotogràfica creant uns puntets negres al voltat de les cèl·lules que emetran radioactivitat. La plata que abans no es veia ara es veu en forma de grànuls al voltant de la cèl·lula que ha incorporat la radioactivitat. Podem veure si les cèl·lules tenen o no grànuls de plata. Si no hi han grànuls de plata, vol dir que no l'ha incorporat. Per tant, ens permet saber si una comunitat és activa o no.
Microsensors Els microsensors tambè es poden utilitzar per mesurar l'activitat, sobretot en mantells estratificats.
Prenen mesures al llarg del temp, com per exemple pH,oxigen temperatura.... però parlem d'escala a milimetres. En aquest cas, com no volem fer malbè la comunitat, els microsensors van molt bé perquè tenen puntes micromètriques i ens permeten baixar a escales de micres per pendre mesures de diferents paràmetres. Si ho fas al llarg del temps, pots obtenir taxes d'incorporació, és a dir, diferents activitats.
Isòtops estables Dues metodologies per veure si hi ha activitat. No es poden confondre amb els isòtops radioactius. Un isòtop és un element que té el mateix nombre de protons i diferent nombre d'electrons. Per exemple, el carboni té dos carbonis estables (C12 i C13) i un carboni radioactiu (C14), el qual es descomposa, mentres que els estables no es descomponen. Els isòtops estables tambè es poden utilitzar.
– FRACCIONAMENT AMB ISÒTOPS ESTABLES: nomès activitat. Es basa en el fet de que els enzims presents en les cèl·lules utilitzen preferentment els isòtops estables més lleugers, com el carboni 12. Discriminen els isòtops estables més pesats. Si analitzem en una mostra natural la diferencia en carboni 12 en quan a carboni 13, podem diferenciar si la mostra és d'origen biòlogic o geològic (la qual presentarà més quantitat de carboni 13). Quan més negatiu, la mostra és d'origen biològic. Com més aprop del 0, origen geològic. El metà és d'origen biològic perque el fraccionament és molt més gran el carboni12 que carboni 13. En canvi, el carbonat marí és d'origen geològic. Quan parlem d'activitat biològica, parlem de l'existència de microorganismes en aquella mostra. Tambè es pot fer amb sofre estable, ja que nomès es pot fer amb aquells elements que tenen isòtops estables. El sofre presenta dos isòtops estables (32 i 34) i un radioactiu (35). Els microorganismes utilitzen preferentment el 32, el qual és el més lleuger. Per exemple, el sulfhídric provè molt d'ell d'activitat biològica. Tambè, en aquests experiments amb O, s'ha sabut quan va ser que l'atmosfera terrestre va començar a enriquir-se O, mirant la proporció de O16 i O14.
– SONDEIG AMB ISÒTOPS ESTABLES: permet combinar anàlisi de diversitat i anàlisi d'activitat.
Tambè s'incuba la mostra ambiental amb un determinat compost que està marcat amb l'isotòp estable més pesat. S'utilitzen per veure si una comunitat és capaç d'utilitzar el C13. Volem saber Ecologia Microbiana TEMA 4 Ariadna Lòpez Coll si la nostra comunitat és capaç de metabolitzar un hidrocarbur. Utilitzem l'octà i el marquem amb C13, algunes cèl·lules incorporaran l'octà marcat i altres que no. Si extraiem el DNA, hi haurà marcat, que serà aquell que han utilitzat el octà, i altres que no presentaran C13 sinò que C12, per tant, tindran un DNA més lleuger. Gràcies a la ultracentrifugació, podem separar el DNA del més pesat al més lleuger, si tenim un més pesat que l'altre. Es podran veuran dues bandes,la més pesada queda més abaix i aquesta correspondrà als organismes que hagin incorporat l'octà.
Desprès, per saber quins microorganismes hi han, podem fer pirosequenciació, DGGE. Si no amplifiquem, podem analitzar tots els genomes, podem utilitzar el shotgun seqüencing per analitzar el metagenoma (metagenòmica).
Tambè es pot fer amb l'extracció del RNA en comptes del DNA. No necessiten temps d'incubació tant llargs i evites el problema de l'alimentació creuada (una cèl·lula allibera el producte i una altre cèl·lula l'incorpora quan realment no l'ha utilitzat directament, però quedarà marcat amb l'octà). Un cop separat el RNA més pesat del més lleuger, apliquem transcriptasa inversa i llavors apliquem tècniques de seqüenciació.
Chips funcionals Podem aplicar-ho amb gens que no siguin el 16S: si volem saber si la comunitat té activitat nitrogen deshidrogenasa, podem utilitzar el gen i poder veure si tenim fluorescència o no. Llavors sabrem que aquesta comunitat té aquesta activitat. S'aplica la mateixa metodologia que en el cas del gen 16s.
Experiments amb enzims específics Actua a nivell de comunitat. Veient si hi ha aquests enzims, sabem que hi ha aquesta activitat. Hi ha una sèrie d'assatjos enzimàtics. Incorporem els reactius i mirem si es formen els productes. Veiem imatges que utilitzen ELF-9 (compost que s'uneix a sucre, proteïnes, fosfat) i si hi ha enzim que el degrada, el ELF es veu fluorescent, que es el que veiem aquí. La primera foto es la fang activat (microorganismes que depuren l'aigua, barreja de microorganismes que formen agregats que és el fang activat). Es va unir ELF9 unit a fosfat, i es volia mirar si hi havia activitat fosfatasa i llavors si es veia fluorescent, es que si. Es volia veure si un grup determinat feia aquesta funció.
...