Tema 4: PCR (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecniques de bioquímica i biologia molecular
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 20/04/2016
Descargas 17
Subido por

Vista previa del texto

Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili Tema 4: PCR 1. Fonament: Tenim un motlle de DNA que volem copiar  no volem copiar tot el cromosoma, sinó sol un fragment.
Dissenyarem uns encebadors de 25 a 30 bases complementaris a la seqüència que volem amplificar, s’usarà l’enzim DNA polimerasa i es fan una sèrie de reaccions cícliques.
2. Procediment: a. Desnaturalització o Melting: 95ºC per a la que doble cadena es desnaturalitzi i tinguem com a resultat dues cadenes simples, les quals serviran com a motlle per sintetitzar la cadena complementària.
b. Hibridació de l’encebador al motlle o Annealing: s’ha de calcular quina és la temperatura òptima per a que els primers es trobin més estabilitzats quan estan anellats a les cadenes simples que quan estan lliures. Aquesta temperatura es calcula segons la seqüència, concretament de la quantitat de GC. Hi ha una fórmula per calcular la temperatura d’Annealing, en la que la meitat de les molècules està hibridada i l’altre meitat no. Aquesta temperatura serà menor que la de la fase anterior  es refreda la mescla per permetre que els encebadors s’uneixin mitjançant ponts d’hidrogen a les cadenes de DNA desnaturalitzades.
c. Extensió: es formen les noves cadenes de DNA gràcies a l’acció de l’enzim DNA polimerasa, que s’unirà a l’extrem 3’ dels primers i polimeritzarà. Aquest procediment es duu a terme a la temperatura òptima del tipus de DNA polimerasa que s’usi. La més típica és la Taq Polimerasa, i la temperatura òptima d’aquesta són 72ºC.
 Al final d’aquest primer cicle, tenim un parell de dobles cadenes.
 És important que els canvis de temperatura siguin ràpids  s’ha de refredar i escalfar ràpid per a que la polimerasa actuï de forma correcta. Els termociclador estan adaptats per fer rampes de temperatura molt ràpides.
 Després es duran a terme més cicles, s’acostumen a dur a terme uns 35. A mesura que augmenta el nombre de cicles, els fragments de DNA inicial, és a dir, els que tenen tot el contingut del genoma, tenen cada cop una menor concentració ja que augmenta la quantitat de cadenes del fragment que ens interessa mentre que la dels fragments totals es manté igual.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili  En la PCR convencional, quan duem a terme 35 cicles, arribem a tenir una quantitat tant gran d’amplicó que deix de ser proporcional a la quantitat de DNA inicial: s’ha amplificat tantes vegades que s’ha perdut la relació. Aquest fet ens indica que la PCR convencional pot ser quantitativa si fem pocs cicles, però arriba un moment en que hi ha tant de motlle que el sistema està saturat i no es pot quantificar  hi ha diferents estratègies per quantificar de forma absoluta en aquest tipus de PCR, però s’usen molt poc perquè són molt complicades.
2. PCR quantitativa a temps real: per solucionar el problema de la quantificació de la PCR convencional, es va dissenyar una altre PCR que mesura la concentració no en el punt final, sinó durant els primers cicles d’aquesta, que és quan el producte és proporcional a la concentració de la mostra inicial. Gràcies a la PCR quantitativa a temps real es pot quantificar de forma relativa o absoluta l’expressió del gen, entre altres aplicacions.
 Similituds amb la PCR convencional: segueix sent una reacció de PCR  té els mateixos reactius i el fonament segueix sent el mateix.
 Diferències amb la PCR convencional:  Els aparells són diferents, en la PCR a temps real s’usa un sistema basat en la fluorescència per mesurar la concentració d’amplicó, són aparells molt més cars, ja que el termociclador, a més de tenir una placa que refreda i escalfa ràpidament, permet mesurar la fluorescència de la mostra en cada moment de la reacció  PCR a temps real és quantitativa i quantifica durant l’amplificació, mentre que la PCR convencional no acostuma a usar-se per quantificar i en cas que es faci, es quantifica un cop acabada la quantificació.
 En la PCR a temps real es poden detectar mutacions puntuals, com veurem més endavant.
 Fases de la PCR a temps real: En la PCR a temps real, es fa una reacció estàndard de PCR en la qual s’afegeix un component, el qual cada vegada que s’uneix un nucleòtid, incorpora fluorescència i aquesta es emesa. El termociclador mesura quanta fluorescència s’incorpora en cada cicle, s’emetrà més o menys fluorescència en funció del nombre de còpies inicial, que és el valor que volem conèixer.
En l’esquema es representa el senyal de fluorescència en cada cicle. A l’inici de la PCR, tot i que hi hagi motlle, no es produeix suficient senyal de forma que no s’ha produït un amplicó prou sensible. Hi ha un moment en que es comença a percebre fluorescència (zona proporcional) i aquesta fluorescència va augmentant fins que arriba un moment en que es satura la reacció (Plató). Cada tub que posem en la reacció ens dóna una corba sigmoïdal, cada corba té una zona proporcional en que, com menys cicles es trigui en arribar a la zona proporcional, més concentració inicial de motlle teníem. El que fem per tant és correlacionar la senyal emesa i el cicle a partir del qual comencem a obtenir fluorescència  cicle llindar. En conclusió, el nombre de cicles que han de passar per assolir una fluorescència complerta de cada mostra ens dona una idea de l’abundància que tenim de motlle de cada mostra.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili  Utilitats PCR a temps real:  Quantificació de DNA mitjançant PCR Per conèixer el nombre de còpies d’un gen el genoma Detecció de mutacions puntuals  Quantificació de RNA mitjançant PCR: és fa amb cDNA, no amb DNA Per conèixer l’expressió d’un gen en un determinat teixit i moment  Components de l’equip  Termociclador de 96 pous  Sistema òptic que detecta simultàniament els 96 pous  espectre continu: 500-660 nm  Software: Funcionament de l’aparell Anàlisi de resultats en format Excel  Marcadors fluorescents del procés de PCR: s’ha de tenir clar quina molècula fluorescent usem, perquè el nostre termociclador ha de ser capaç d’estimular i mesurar la fluorescència d’aquell fluorocrom  Sondes TaqMan: s’afegeix una sonda que té la seqüència interna de l’amplicó marcada en els 2 extrems amb dos marcadors: Reporter: fluorocrom unit covalentment a l’extrem 5’ de la sonda Quencher: apantalla la fluorescència del Reporter, es troba unit covalentment a l’extrem 3’ de la sonda.
Aquest extrem es troba bloquejat per tal d’evitar la seva extensió Quan la sonda està intacta, no hi ha fluorescència ja que el Quencher està apantallant al Reporter. Quan la DNA polimerasa arriba a la regió on està la sonda, degut a que, juntament amb l’activitat polimerasa 5’ 3’ presenta una activitat exonucleasa 3’  5’, trenca la sonda. En aquest moment és quan el Reporter emet fluorescència ja que al trencar-se la sonda, ja no es troben proper al Quencher i aquest no l’apantalla.
Utilitat: únicament s’emet fluorescència quan s’ha amplificat el segment específic, en el cas que s’uneixi a un altre fragment, com que no es trenca la sonda TaqMan, no s’emet fluorescència i no es detecta.
La sonda és molt cara (600 €) i es pot comprar dissenyada o li podem dir a la casa que ens dissenyi.
 SYBGreen: colorant fluorescent que s’uneix al DNA de doble cadena, concretament en el soc petit. És un fluorocrom de color verd mitjançant el qual podem mesurar la fluorescència emesa mentre es produeix la reacció de PCR. És més senzill i barat que els altres fluorocroms, però és inespecífic ja que s’unirà a qualsevol molècula de DNA de doble cadena que s’estigui sintetitzant en el tub, de forma que si tenim un artefacte, també es donarà senyal d’aquest, el que ve a ser un fals positiu.
Per tal d’assegurar-nos de que amplifiquem el que ens interessa, fen un control de qualitat mitjançant corbes de dissociació.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili  Molecular beacons -Característiques per augmentar l’eficiència del procés: es fa servir un software (no va explicar més)  Amplificar fragments petits (50-150 pb)  Aspectes essencials en el disseny de primers: Han d’estar el més propers possible, però sense que es superposin Han de presentar un contingut en GC entre el 30 i 80 % S’han d’evitar repeticions d’un mateix nucleòtid, especialment 5 o més G La temperatura de Melting ha de ser entre 58 i 60 ºC Els darrers 5 nucleòtids de l’extrem 3’ no han de contenir 2 G i/o C  Dissenyar la sonda TaqMan a una distància de més de 50 pb des del FP (Primer forward)  La temperatura de Melting de la sonda TaqMan ha de ser entre 68 i 70 ºC, amb 10 ºC de diferència amb els primers per augmentar l’especificitat d’unió.
 Controls: la PCR té un risc de contaminació externa.
 Actius: Tub NTC (No Template Control): posar RNA enlloc de cDNA  no ha de donar amplificació. El fallo típic és amplificar DNA quan el que volem amplificar és cDNA. A banda d’aquest tub control, s’afegeix DNAsa abans del pas de RNA a cDNA.
Controls endògens  Passius: ROX: es tracta d’una substància fluorescent que es troba en el tampó que, en el cas que hagi errors de pipeteig, ha de ser constant per tal de que la màquina pugui detectar aquests errors en cas de que siguin petits  Mètodes de quantificació:  Quantificació absoluta: quina quantitat de còpies d’un àcid nucleic diana hi ha en la nostra mostra? Cal construir una recta patró, on es representa la senyal fluorescent enfront la concentració d’àcids nucleics, per construir-la, s’usa l’àcid nucleic d’interès purificat i de concentració coneguda i es fan dilucions d’aquesta  cada gen que vulguem amplificar, necessitarà el seu àcid nucleic (corba patró ha de ser específica per cada parella de primers) pur amb la seva recta patró. Aquesta corba patró ens ha de permetre treballar dins d’un marge molt ample de concentracions, per tal d’evitar que s’hagi de repetir tot el procediment amb la mostra problema més repetida o més concentrada.
 Pendent de la recta patró: si l’amplificació de les diferents mostres patrons és 100 % eficient, donarà un valor de pendent de -3.32, cal que sigui repetitiva, sinó no serà fiable. Tot i així, l’eficiència no sempre és del 100%, hi ha unes determinades condicions que permeten una amplificació molt bona però no amb una eficiència total. Una eficiència total correspon a l’obtenció del màxim de còpies que es poden obtenir en aquell sistema. Òbviament, com més baixa és aquesta eficiència, més dolent és l’assaig. L’eficiència pot dependre de diferents factors tècnics: o Primers formen dímers, baixant així l’eficiència de la PCR o El cicle de temperatures no està prou afinat o Degut a la mostra problema Es pot acceptar una eficiència del 80-90 %, sempre i quan tinguem en compte que la nostra reacció no està treballant al màxim Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili  Quantificació relativa: és la que més s’usa, sobretot en l’estudi de l’expressió d’un gen en diferents mostres.
1- Selecció del gen que es vol quantificar 2- Selecció d’un gen control endogen: aquest serà constitutiu respecte a la variable d’estudi i la seva concentració no es veurà afectada en les diferents mostres. N’hi ha de molts tipus i depenent del tipus d’assaig es faran servir uns o uns altres. Un dels més usats és la beta-actina, ja que s’ha vist que en moltes circumstàncies la seva síntesi és constant. Tot i així, s’ha de fer una consulta bibliogràfica prèvia per saber quin gen constitutiu usar.
De cada DNA motlle tindrem com a mínim 2 tubs  un d’amplificació del gen problema i un altre d’amplificació del gen de referència.
3- Doble amplificació: es fa un banc de dilucions de la mostra i s’amplifiquen gen problema i gen control. El resultat d’això és una recta patró en la qual no coneixem la concentració dels diferents punts, però ens serveix per mirar com es comporta l’amplificació en diferents concentracions.
Si veiem que les rectes obtingudes del gen problema i del gen control són lleugerament paral·leles, significa que estem fent servir el gen control correcte, si això no passes, la comparació entre els dos gens seria molt més complicada i indirecta, de forma que la millor opció seria buscar un altre gen problema.
Un cop veiem que les rectes són paral·leles, es passa a fer una normalització estàndard  calculem la relació gen problema / gen control i comparem les diferents mostres.
 Precisió o reproductibilitat: s’aconsegueix mitjançant l’ús de rèpliques. Hi ha dos tipus de rèpliques:  Idèntiques: una mostra la posem en dos pous de quantificació diferents, ja que si una falla podem fer servir l’altre  són també anomenades rèpliques tècniques  Experimentals: hem de realitzar l’experiment més d’un cop per tal de poder demostrar l’observació que hem fet.
EN TOTS ELS PASSOS ES FAN RÈPLIQUES Aquestes rèpliques s’han de dur a terme perquè un dels inconvenients d’aquesta tècnica és que treballem amb volums minúsculs i, al tractar-se d’una tècnica quantitativa o semi-quantitativa, els volums són molt importants i tots els components s’han de pipetejar. En cas que es cometin errors, aquests poden afectar molt en el resultat i la reproductibilitat dels resultats. Duent a terme aquestes rèpliques, disminuïm considerablement l’efecte de tals errors.
Una altra solució és fer reaccions màster-mix, es a dir, no pipetejar els volums molt petits i fer barreges inicials.
Un altre risc que pot haver en qualsevol PCR és la contaminació creuada. Aquesta es pot produir només mentre estem pipetejant de mostra en mostra, ja que, per exemple, podem arrossegar motlle de la mostra anterior i generar falsos positius. Per aquest motiu hi ha una zona on preparem la reacció, una on amplifiquem i una altre on es fa la revelació dels resultats. En la PCR quantitativa s’estalvia el risc del gel d’agarosa (recorda que no es feia electroforesi), però les precaucions s’han de tenir presents perquè afecten en qualsevol tipus de PCR.
Maria Lobato Gómez. Universitat Rovira i Virgili  Exemple d’aplicació: quantificació dels nivells de alfa-2-macroglobulina en RNA de fetge, melsa, ronyó i ovari de ratolí  es compara el mateix gen d’un animal en diferents teixits. En aquest exemple, el gen de referència que s’usa és el rRNA 18S.
Es fan les corbes del gen problema i del de referència: Les corbes són paral·leles, de forma que podem normalitzar amb el mètode senzill: Es divideix l’expressió del gen problema pel gen de referència en cada teixit. Quan es normalitza, s’acostuma a veure quin s’expressa més i quin menys però hem de decidir respecte quin teixit volem expressar els resultats (és una decisió que hem de fer nosaltres); en l’exemple es normalitza a partir dels resultats del ronyó:  Altres aplicacions de la RealTime-PCR:  Genotipats: quan usem sondes TaqMan, no més podem quantificar la quantitat de RNAm original, sinó que també es poden estudiar les variants al·lèliques que hi ha en el cromosoma d’un individu, és a dir, per detectar SNPs.
Si estem en el cas que per un locus tenim 2 al·lels que difereixen en un únic nucleòtid, el que es fa és dissenyar una sonda TaqMan que sigui 100 % complementària a un dels dos al·lels i una altra que sigui 100 % complementària a l’altra. De forma que, quan amplifiquem el DNA d’un individu amb els mateixos primers però diferent sonda TaqMan, segons els resultats que trobem podrem saber si l’individu, en aquell locus en concret, és homozigot per un dels dos al·lels o heterozigot  Això es fa basant-se en el color de la fluorescència detectada.
En cas que la DNA polimerasa trobi un mismatch (que és el cas quan la sonda TaqMan no és 100 % complementària al DNA perquè no correspon al mateix al·lel), es quedarà aturada en aquell punt, no trencarà la sonda TaqMan i en conseqüència, no s’emetrà fluorescència.
...

Comprar Previsualizar