Tema 4: Introducció del DNA en l'hoste i selecció de recombinants (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecnologia del DNA recombinant
Año del apunte 2015
Páginas 4
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 8
Subido por

Vista previa del texto

Tema 4. Introducció del DNA en l’hoste i selecció de recombinants Objectiu: incorporació de DNA en un hoste per clonar-lo, expressar-lo o estudiar el seu efecte en la cèl·lula hoste.
1. Incorporació DNA en l’hoste (TRANSFORMACIÓ) 1.1. Directa Microinjecció: introducció mecànica de solucions en el nucli de l’hoste mitjançant micropipeta.
☺ Alta eficiència: 20%  Molt sensible, equipament complex i sol es poden fer 10 microinjeccions en una hora 1.1.2. Microbombardeig: DNA adherit a micropartícules  es dispara a alta velocitat sobre les cèl·lules ☺ Efectiu in vivo (teràpia gènica) i in vitro  Aplicació dificultosa i car 1.1.3. Permeabilització cel·lular: porus en la membrana  molècules en solució penetren a través del gradient de concentració. Les cèl·lules es mantenen vives en una solució (en la qual afegirem ATP i un extracte citosòlic per no perdre el funcionament cel·lular).
☺ Es pot fer amb gran quantitat de cèl·lules a la vegada en poques hores.
1.1.3.1. Electroporació: electroporador aplica camp elèctric sobre la membrana cel·lular que augmentà la permeabilitat.
☺ Efectiu en quasi totes les cèl·lules i espècies, alta eficiència, es pot realitzar a petita escala i in vitro.
 Tractament molt agressiu, transport no específic i cost de l’electroporador.
1.1.3.2. Mètode de CaCl2: lípids de membrana i DNA tenen càrrega negativa, ions Ca2+ s’uniran a les càrregues negatives, neutralitzant-les. A baixes temperatures el calci estabilitza la membrana lipídica, augmentem la temperatura per a que la paret sigui més fluida i permeti el pas de la molècula.
☺ Menys agressiu que electroporació  cèl·lules no moren  Eficiència menor que Electroporació 1.1.1.
1.2. Transfecció: persuasió de les cèl·lules per a que incorporin el DNA recombinant, mitjançant 2 tipus de mètodes: 1.2.1. Mètodes químics: formen complexes que s’incorporaran per endocitosi en l’hoste. S’usen diversos reactius: 1.2.1.1. Fosfat de calci: DNA precipita amb clorur de calci (calci protegeix DNA de nucleases cel·lulars) en solució salina de fosfats  els agregats són endocitats per l’hoste.
☺ Barat, equipament tradicional  Baixa eficiència, aquesta depèn de la quantitat de DNA que ha precipitat 1.2.1.2. DEAE dextrà: té càrrega positiva, s’uneix al DNA, permetent unió amb la superfície de la cèl·lula i l’endocitosi.
☺ Senzill, reproduïble i de baix cost, requereix poques quantitats de DNA  Poques línies cel·lulars incorporen DNA per aquest mètode, a més, DEAE és tòxic.
1.2.1.3. Lipofecció: lípids catiònics + DNA = liposomes afins a la membrana  entrada DNA al citosol ☺ Eficient, reproduïble, es pot transferir DNA i RNA in vivo en humans i animals  Laboriosa 1.2.2. Mètodes físics: introducció mecànica del DNA (inclouen 1.1.1., 1.1.2 i 1.1.3.1) 1.2.2.1. Fusió de protoplasts: primer s’eliminen la paret cel·lular dels bacteris (lisozima) i la paret de l’hoste (cel·lulases i amilases)  obtindrem els protoplasts que s’aglutinaran fins que la membrana es fusionarà i finalment formaran un heterocarió esfèric (2 nuclis de diferents espècies) 1.3. Transducció: introducció del DNA en virus  infecció de virus a la cèl·lula hoste (cicle lític) Cicle lític: fag s’uneix a la membrana de la cèl·lula hoste  injectarà el seu DNA  DNA re-circularà  DNA es replicarà // Síntesi proteïnes càpsida i cua  Assemblatge fags  Alliberació fags Replicació per Rolling circle: DNA pot replicar-se indefinidament: el producte generat (concatèmer) presenta regions cos, les quals tenen una diana de restricció per les terminases. Entre dos regions cos trobem tot el material genètic del fag.
Síntesi càpsida  terminases reconeixen regió cos  tallen el DNA  DNA s’incorpora dins la càpsida  terminases connecten la càpsida amb la cua Empaquetament in vitro: cal separar el DNA del fag lambda   Sistema d’empaquetament d’una cadena: Una soca d’Escherichia coli infectada amb fag lambda mutat en la regió cos (no lloc de reconeixement per les terminases), aquesta no pot empaquetar els fags però sí sintetitzar proteïnes de la càpsida i la cua, les quals s’acumularan.
Fem una lisi de les cèl·lules  En un tub d’assaig: lisat (proteïnes càpsida i cua) + DNA recombinant: tindrem totes les proteïnes necessàries per a que el nostre DNA s’empaqueti.
Sistema d’empaquetament de dues cadenes: Una soca d’E. coli infectada per fag lambda deficient de proteïna E (càpsida) i una altra soca d’E. coli infectada amb un altre fag lambda, aquest cop deficient de proteïna D (assemblatge). Fem una lisi de les dues soques per separat  En un tub d’assaig: lisat de les dues soques + DNA recombinant: els continguts de les dues soques es complementaran i permetran l’empaquetament del nostre DNA.
2. Identificació de cèl·lules transformades (SELECCIÓ) 2.1. Plasmidis com vector: 2.1.1. Inactivació d’un marcador: quan s’insereix el fragment de DNA en el plasmidi es destrueix la integritat d’un dels gens d’aquest, acostumen a ser gens que confereixen resistència a antibiòtics (p. ex. Ampicil·lina i tetraciclina). Un exemple seria pBR322, quan incorpora DNA en la diana BamHI, perd resistència a la tetraciclina. Per detectar les bactèries que han incorporat aquest plasmidi i que el plasmidi que han incorporat presenta el gen d’interès s’usa la tècnica de rèplica en placa: - Bacteri que no ha incorporat plasmidi: no presenta resistència ni a la ampicil·lina ni a la tetraciclina - Bacteri que conté plasmidi que NO ha incorporat DNA d’interès: presenta resistència als 2 antibiòtics - Bacteri que conté plasmidi que ha incorporat DNA d’interès: resistència ampicil·lina però no a la tetraciclina.
Sembrat en medi ampicil·lina + tetraciclina: creixen tots els bacteris que han incorporat plasmidi  fem una rèplica de la placa (imatge) i fem sembrat en un medi tetraciclina: creixen bacteris que han incorporat plasmidi sense DNA d’interès  ens quedem amb els que han aparegut en el primer sembrat però no en el segon.
2.1.2.
Inactivació gen LacZ: operó Lac: 3 gens: LacY (codifica per la lactosa permeasa, enzim responsable de l‘entrada de lactosa a la cèl·lula), LacA (codifica la tiogalactidòsid transacetilasa, amb funció fisiològica actualment desconeguda) i LacZ, l’últim té com a producte la β-galactosidasa, la qual hidrolitza la lactosa en glucosa i galactosa.
Regulació: s’activa en absència de glucosa i presència de lactosa. IPTG és un inductor que s’uneix al repressor lacI, que inactiva l’operó quan està unit a la regió reguladora.
En l’operó Lac trobem un polilinker: regió de DNA petita amb moltes seqüències diana.
Procediment: introduïm el nostre DNA en el polilinker de l’operó Lac  no síntesi de β-galactosidasa. Sembren en un medi amb X-gal (substrat de la β-galactosidasa anàleg a la lactosa, que al degradar-se dona coloració blava).
Les cèl·lules que no han incorporat el plasmidi i que han incorporat el plasmidi que ens interessa presentaran coloració blanca, ja que no es degrada X-gal, en canvi les que han inserit el plasmidi sense el DNA incorporat presentaran coloració blava. Per diferenciar els dos primers tipus de cèl·lules, ens basem en que el plasmidi presenta un gen de resistència a l’ampicil·lina, i durem a terme la tècnica de rèplica en placa explicada anteriorment.
2.2. Fags com a vector: 2.2.1. Inactivació per inserció del gen LacZ transportat pel fag: la inserció d’un nou DNA dins del gen Lac Z inactiva la síntesi de B-galactosidasa, i, de la mateixa forma que passa amb el plasmidi pUC18, els fags recombinants són distingits quan s’usen cèl·lules hoste Lac- en presència d’un substrat cromogen (X-gal)  les plaques clares seran les que presenten fags recombinants, les que ressenten fags no recombinants seran blaves.
Soca d’E. coli sense mutar: la B-galactosidasa està codificada pel gen LacZ de l’operó lac i es sintetitza en el seu estat actiu, com a homotetràmer.
Soca M15 E. coli: presenta el gen de la B-galactosidasa mutat, s’ha fet una deleció de lacZ (lacZΔM15), els residus N-terminals 11-41 són eliminats, no es forma el homotetràmer i per tant obtenim una B-galactosidasa inactivada, és l’anomenat pèptid ω.
Els fags usats porten una seqüència que codifica lacZα, els primers 59 residus de la B-galactosidasa, és l’anomenat pèptid-alfa. Aquest, al igual que el pèptid ω, quan està sol no és funcional. Aquests s’inseriran en la zona on trobem el gen Lac Z’.
Quan el pèptid alfa i el pèptid ω s’expressen junts, les cèl·lules es transformen en lacZΔM15 i formen l’enzim Bgalactosidasa funcional.
Mètode de detecció: alfa complementació, ens basem en que la infecció de la cèl·lula pel fag comporta la formació d’una B-galactosidasa mutant, gràcies a la presència de la seqüència N-terminal del pèptid alfa que porta el fag en la seva seqüència. En un medi de cultiu amb agar, X-gal i IPTG els resultats seran els següents: si hi ha alfa complementació, obtindrem colònies blaves i si no n’hi ha, obtindrem colònies blanques. Està explicat en lo dels plasmidis, la teoria de la selecció és la mateixa: es distingeixen els fags recombinants dels que no ho són.
2.2.2.
Selecció usant el fenotip SPI: el fag lambda normalment no pot infectar cèl·lules de E. coli que presenten un pròfag conegut com P2. En aquests fags lambda se’ls anomena Spi+ (sensibles a la inhibició del pròfag P2).
Alguns fags lambda són escollits de tal manera que la inserció d’un nou DNA causa un canvi de Spi+ a Spi(manquen de ds gens involucrats en la recombinació: red i gam), pel que el recombinant pot infectar cèl·lules que transporten el pròfag P2. Aquestes cèl·lules són usades com receptores per experiments de clonació amb aquests vectors, únicament els recombinants Spi- seran inefectius i seran els únics capaços de formar plaques.
2.2.3.
Selecció sobre la base de la mida del genoma lambda: el sistema d’acoblament de lambda, on s’acoblen partícules de fags madurs, pot inserir únicament molècules de DNA que presenten una mida d’entre 37 i 52 kb dins de la càpsida del fag.
Qualsevol molècula amb una mica inferior a 37 kb no podrà ser acoblada. Molts vectors han estat construïts tallant segments llargs de la molècula de DNA per a que aquesta tingui una mida menor a 37 kb. Així, el fag únicament serà acoblat quan s’hagi inserit DNA extra (és a dir, el nostre DNA d’interès), el qual donarà al genoma una mida superior a 37 kb. De forma que únicament els fags recombinants, els que presenten DNA forà i, per tant, tenen una mida dels del rang d’acoblament, seran capaços de replicar-se i lisar les cèl·lules.
Factors a tenir en compte: es pot produir la lligació vector-vector, però aquesta no re-circularitzarà al tenir una mida suficient (5,4+5,4 = 10,8 kb). Si el fragment es lligués amb ell mateix, tindria una mida adequada, però aquesta ha estat prèviament tractat amb fosfatasa.
Còsmid c2XB: conté una diana de restricció per a BamHI i dues regions cos separades per un lloc de restricció amb extrems roms. La creació d’aquests extrems roms, la qual lliga de forma molt ineficient en les condicions usades, preveu la lligació del vector amb ell mateix durant la lligació.
...