Tema 8. Clonaje (clase) (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 6
Fecha de subida 14/06/2017
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Tema 8. Clonaje TABLA DE CONTENIDO 1 Introducción .......................................................................................................................... 2 1.1 1.2 2 Modificación de extremos ........................................................................................................... 2 Unión de extremos ...................................................................................................................... 2 Vectores ................................................................................................................................ 2 2.1 Características de los vectores .................................................................................................... 2 2.2 Tipos de vectores: ....................................................................................................................... 3 2.2.1 Plásmidos ..................................................................................................................................................... 3 2.2.2 Bacteriófagos ............................................................................................................................................. 3 2.2.3 Cósmido ....................................................................................................................................................... 4 2.2.4 Fagémidos ................................................................................................................................................... 4 2.2.5 BACs ............................................................................................................................................................. 4 2.2.6 YACs ............................................................................................................................................................. 4 3 Organismos hospedero:........................................................................................................ 4 3.1 4 Inserción del DNA ................................................................................................................. 4 4.1 4.2 4.3 4.4 5 E. Coli K12 .................................................................................................................................. 4 Transformación ........................................................................................................................... 4 Transducción ............................................................................................................................... 5 Electroporación............................................................................................................................ 5 Transfección ................................................................................................................................ 5 Identificación......................................................................................................................... 5 5.1 Métodos de selección de los recombinantes ............................................................................... 5 5.1.1 Inactivación insercional ............................................................................................................................. 5 5.1.2 Alfa-Complementación o identificación por blancas y azules .......................................................... 5 5.1.3 Método enzimas de restricción y electroforesis (de los más utilizados).......................................... 6 1 INTRODUCCIÓN Consiste en introducir en DNA secuencias exógenas.
Por una parte tenemos el vector y por otra parte el DNA diana (el fragmento que quiero incorporar).
Si tengo un vector de tipo plasmídico: busco el plásmido adecuado para hacer el clon. El DNA diana lo sacaremos del DNA genómico o a partir del mRNA. Tenemos una mezcla de mRNA diferentes y amplificamos la zona genómica de interés.
Para esto llevamos a cabo el proceso de PCR (amplifica una región específica o un mRNA específico). El mRNA tendrá dos sitios de restricción para enzimas de restricción, y estos enzimas de restricción cortarán para que se puedan unir al plásmido.
Generalmente tenemos dos estrategias de clonaje: clonaje direccional (dos enzimas de restricción que generen extremos no compatibles para poder orientar) y no direccional (con enzima de restricción único).
Una vez realizada la PCR haremos la digestión, y obtendremos un fragmento grande (cuerpo del vector) y uno pequeño con sitios de restricción.
Obtenemos un extremo de tipo cohesivo (con que haya uno cohesivo ya es direccional). El sitio de restricción tiene que leerse 5’-3’. Sustituimos el fragmento que está entre los sitios de restricción del vector por el fragmento que queremos insertar.
Mediante la reacción de ligación puedo tener el vector religado y el vector con el fragmento dentro (el recombinante).
Cogemos esta mezcla y la metemos en una mezcla con un grupo de células que adquirirán moléculas de DNA. Tendremos una placa con colonias; cada una corresponde a una célula concreta que ha sido transformada por una molécula de DNA y se ha reproducido. Quiero seleccionar las que tengan DNA exógeno; estas tendrán un marcador de selección, de forma que si pongo un antibiótico, y mi inserto aporta resistencia frente a este, solo crecerán las bacterias que hayan integrado el vector.
El sitio múltiple de clonaje (MCS) son secuencias de diferentes sitios de corte de enzimas de restricción. Hay sitios de secuencias de reconocimientos empalmadas entre sí, y se digieren sitios de corte único. Tengo que buscar enzimas que corten una vez en el vector y enzimas que no corten en el gen, para poder cortar solo por los extremos.
1.1 Modificación de extremos Podemos rellenar extremos 5’ protuyentes con una actividad polimerasa 5’à3’, y degradar 3’ protuyentes con exonucleasa 3’à5’.
Linkers sintéticos; fragmentos de DNA con una secuencia específica que se usan para modificar los extremos de las moléculas de DNA, de romos a cohesivos.
1.2 Unión de extremos La clonación es realizada por una DNA ligasa, que es mucho más eficiente con extremos cohesivos, ya que habrá previamente un apareamiento por complementariedad de bases.
Tratamos los extremos del vector con fosfatasa alcalina. Si se elimina el fosfato, el vector no podrá ligar consigo mismo, pero sí con el inserto que tengo.
2 VECTORES 2.1 Características de los vectores Origen de replicación para que se puedan replicar una vez los introduzcamos en la célula, un marcador de selección (para saber cuáles han incorporado vector) y sitios de restricción (únicos en el vector).
• Ejemplos de marcadores de selección: resistencia a antibióticos, autotróficas (necesitan de un determinado compuesto en el medio de cultivo para poder sobrevivir).
SARA ARIAS BLANCO 2 También haber otras características deseadas Para más tarde confirmar un 100% de la secuencia nucleotídica, habrá que hacer una secuenciación.
Marcadores para la selección de los recombinantes y por ejemplo tener también un TAG (fragmentos de 6 a 8 aa) para la solubilidad.
2.2 2.2.1 Tipos de vectores: Plásmidos Los plásmidos son los más utilizados y más sencillos de manipular. Son moléculas de DNA circular de doble cadena y su replicación es independiente de la replicación del cromosoma bacteriano. Se pueden transferir por puentes de conjugación entre bacterias. La mayoría son derivados de virus. Los que se venden son plásmidos sintéticos, ya manipulados para clonar.
El número de copias define el origen de replicación del plásmido.
Se puede dar un fenómeno de incompatibilidad plasmídica: se pueden introducir dos plásmidos diferentes a la vez en una bacteria • • Incompatibles si tienen el mismo origen de replicación, de forma que después de muchas replicaciones quedan colonias con un plásmido u otro Si tienen diferentes orígenes de replicación, serán compatibles, puestos que cada origen hará su cuenta por separado, de forma que ambos plásmidos podrán coexistir en la misma bacteria.
Hay vectores plasmídicos que se usan solo para el clonaje, otros que también para la expresión de proteínas, y otros que tienen más de un origen de replicación llamados Shuttle Vectors (para replicarse en diferentes tipos de organismos).
2.2.1.1 Vectores de clonaje Un vector muy típico es el llamado T vector, que tiene una T en cada uno de los extremos. Alternativa a la digestión normal. El vector pUC18 tiene un promotor muy débil (Lac) que no da mucho rendimiento así que no es el ideal para usar.
2.2.1.2 Vectores de expresión Se necesita un casete; señales necesarias para expresar el gen que he clonado en ese vector.
La RNAP se une al promotor, y este es el que va a decir si se va a transcribir mucho o poco. Si el promotor es regulable (inducible como Lac), la expresión de los vectores puede ser controlada.
Necesitamos un sitio de unión al ribosoma, RBS (procariotas). Es la secuencia complementaria al rRNA del 16S, y posiciona al mRNA en la subunidad pequeña del ribosoma.
En el caso de eucariotas la secuencia análoga es TATA box.
Un vector típico de la expresión de proteínas es el promotor T7 (el más fuerte), regulado por el operador Lac. Esto quiere decir que podemos inducir la expresión de este gen con IPTG (del operador Lac).
2.2.1.3 Vectores lanzadera Nos permiten usar al mismo tiempo el mismo vector en diferentes organismos. El OriP es un origen para células de mamíferos. Manipulamos y amplificamos el vector en bacterias, que es más rápido, y después vemos la expresión en eucariotas.
2.2.2 Bacteriófagos Son virus que infectan a las bacterias. Pueden ser líticos (empiezan a replicarse hasta que rompen la pared bacteriana) o lisogénicos.
2.2.2.1 Bacteriófago 𝜆 Cuando está en forma lineal tiene sitios Host en cada extemo; tienen un extremo que permite que se formen multímetros de bacteriófago y el empaquetamiento del DNA viral en la cápside.
SARA ARIAS BLANCO 3 A partir de este bacteriófago tenemos el vector de inserción y el de emplazamiento. El bacteriófago se puede empaquetar de manera eficiente entre un 70-110% de su tamaño (se elimina DNA no necesario y se puede añadir un 10% más hasta llegar al 100 o 110 por ciento del tamaño de ese vector). El vector de reemplazamiento tiene un DNA cualquiera entre dos sitios de restricción que aportan el tamaño suficiente para poder empaquetar el DNA de ese virus, y que se puede reemplazar por fragmentos de DNA deseado.
2.2.3 Cósmido Se puede clonar en él más cantidad de DNA. Cuando infecta a las bacterias se convierte en plásmido y ya no se replica como un virus. No tiene los genes necesarios para el empaquetamiento, sino que hay que hacerlo in vitro.
2.2.4 Fagémidos Nos permiten ssDNA a partir de la replicación del bacteriófago M13. Tienen el origen del bacteriófago normal y el del m13.
Pueden incorporar la cantidad de DNA normal.
2.2.5 BACs Los cromosomas artificiales de bacterias: son vectores que pueden incorporar mucho más DNA. Una o dos copias por célula, y este número está regulado por el origen de replicación y por los genes BAC. Aseguran la partición de ese vector.
2.2.6 YACs Los cromosomas artificiales de levaduras: estos son lineales, tienen centrómero, dos telómeros y generalmente dos marcadores de selección. Solo va crecer el vector que se haya reconstituido completo y que tenga ambos marcadores de selección. Este tipo de vectores puede alojar desde 150k de pares de bases hasta 1 Mb. Sirve para optimizar el número de clones.
3 3.1 ORGANISMOS HOSPEDERO: E. Coli K12 Se han obtenido cepas con mutaciones que nos permiten realizar procesos de clonaje. También tenemos el desarrollo de múltiples plásmidos para diferentes aplicaciones.
Crece fácilmente en cultivo, es relativamente barato e inocuo y fácil de transformar.
4 INSERCIÓN DEL DNA Los principales métodos para introducir el DNA en una célula hospedero: 4.1 Transformación Implica el paso del DNA a través de la membrana celular. La transformación de las cepas bacterianas puede ser natural (células naturalmente competentes) o inducida (tratamiento con CaCl2, que provoca permeabilización de la membrana.
Para que entre el plásmido después se realiza un shock térmico). Para seleccionar las células que tengan el plásmido me fijo en el marcador de selección que tiene el vector.
En el caso de que el DNA incorporado es exógeno se usan varios controles: 1. Control de viabilidad: las células están vivas. Las células se hacen crecer en un medio sin presión selectiva, para saber solo si están vivas después del tratamiento para inducir el estado de competencia. SI todo está bien deberemos obtener una placa llena de célula porque todas deben crecer en un medio no selectivo: césped bacteriano.
2. Control de contaminación: para saber si hay resistencia al medio que estoy utilizando. Las células sin DNA exógeno en medio selectivo. Si todo está bien la placa debe estar vacía.
SARA ARIAS BLANCO 4 3. Control de transformación: nos sirve para saber cuántas colonias puedo obtener de todas las células que yo tenía.
Se calcula la frecuencia de transformación, que es el número de colonias por ug de DNA. Usando el método del CaCl2 la frecuencia varía entre 10^6 y 10^8.
4. Vector digerido y refosforilado ligado. Para saber la cantidad de vector religado. En esta placa se esperan menos colonias que en el control de transformación.
5. Transformar la ligación.
Plásmidos de conjugación: permite la transferencia horizontal de DNA entre ambas células. Es un fenómeno natural que apenas se usa en el laboratorio.
4.2 Transducción También se pueden añadir de mamíferos, pero con virus.
4.3 Electroporación Se introduce DNA mediante pulso eléctrico. Se puede hacer con cualquier tipo de células. Se pueden electroporar moléculas más grandes que lo que se consigue mediante la transformación. Las sales (del tampón de ligación) deben de haberse eliminado del medio de cultivo de las células y de la ligación para que no se estropee el quipo. Después se deben volver a añadir las sales y generalmente obtenemos una mayor frecuencia de transformación que con el control de transformación 4.4 Transfección Traspaso de DNA a la célula por método no viral. El método más común es el del fosfato de calcio (se forman precipitados del fosfato con DNA y estos se añaden gota a gota sobre las células).
5 IDENTIFICACIÓN Ahora sí son capaces de crecer en el medio selectivo. Para identificar hay métodos que dependen del tipo de vector utilizado y que solo se pueden aplicar para ciertos vectores.
De las metodologías que nos permiten analizar cualquier proceso de clonaje: • • Unas dependen del tipo de vector: análisis mediante restricción y electroforesis, técnicas de hibridación y PCR.
Otras dependen del inserto clonado: función proteica (mirando por ejemplo a ver si se ha degradado un sustrato) o la detección de las colonias selectivas usando anticuerpos específicos contra la proteína que he clonado.
Solo puedo asegurar que el 100% de la secuencia es el correcto si pasa por la secuenciación. Después de haber identificado los recombinantes.
5.1 5.1.1 Métodos de selección de los recombinantes Inactivación insercional Se necesita que en el vector haya dos genes de resistencia. Para seleccionar las bacterias.
5.1.2 Alfa-Complementación o identificación por blancas y azules Usa el gen de la beta galactosidasa.
Se basa en que la beta galactosidasa puede obtenerse de manera funcional complementando dos fragmentos y se componen de sustratos que son metabolizados por este enzima y dan un color azul.
Se ha diseñado un vector que tiene uno de los dos fragmentos de la galactosidasa puesto para expresarse a partir del promotor.
El fragmento alfa se sitúa en el plásmido porque ha de estar incluido en el vector. El otro se encuentra en el cromosoma o en el plasmido F.
SARA ARIAS BLANCO 5 Tenemos el plasmido, RERE y el fragmento alfa. Se interrumpe el fragmento alfa con el producto de clonaje, no se complementara con la b galactosidasa, no se degrada el xgal y obtenemos una colonia blanca. Cuando se llega a producir como proteína, se complementa con omega y obtenemos una colonia azul.
Cuando hay fragmentos pequeños la idea es que si se sigue expresando algo que se trunque.
5.1.3 Método enzimas de restricción y electroforesis (de los más utilizados) Donde dice U es el vector sin digerir, hay más de una banda porque es un plásmido y entonces tiene superfalksdfahd estamos viendo el DNA superenrollado y el relajado.
Hemos digerido con el enzima E, que lo convierte en un DNA lineal, es la banda única que corresponde con el tamaño del vector.
El enzima S se usa para saber la orientación relativa El número de clones de una genética depende del tamaño del inserto (viene determinado por el vector) y el tamaño del genoma (determinado por la especie).
En las librerías genómicas, escogemos enzimas de restricción de 4 bases, porque una diana más corta implica muchos más sitios de reconocimiento por probabilidades. Se hace una digestión parcial de esos sitios (con muy poca cantidad de enzima) para hacer una fragmentación limitada del genoma.
SARA ARIAS BLANCO 6 ...