Tema 4.Sistemes en estat estacionari (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Biologia de sistemes
Año del apunte 2014
Páginas 14
Fecha de subida 15/03/2016
Descargas 6
Subido por

Vista previa del texto

BS- Tema 4 mfiguls TEMA 4: SISTEMES EN ESTAT ESTACIONARI 11/3/15 Els sistemes en estat estacionari són els més simples. Però en general, els sistemes tendeixen a estabilitzar-se, quan això passa, hi ha una velocitat de creixement constant, les entrades i sortides són constants, i els fluxos també.
Per poder ajustar la recta a un sistema, hem de tenir sempre més punts experimentals que paràmetres.
• Una de les maneres de comprovar si es pot fer és calculant els graus de llibertat: 𝒈𝒍 = 𝒏º 𝒅𝒆 𝒑𝒖𝒏𝒕𝒔 − 𝒏º 𝒑𝒂𝒓à𝒎𝒆𝒕𝒓𝒆𝒔 A partir de les diverses fonts d’informació disponibles es poden construir models estequiomètrics per estudiar el metabolisme, generalment seguint un procés iteratiu.
Normalment, tenim anotats els enzims del sistema (i per tant, la seva funció), perquè tenim anotat el genoma. La informació que ens anem guardant és: - Existeix l’enzim? Presència. Aquesta informació la obtenim de l’anotació del genoma.
- Quina és la seva estequiometria? - Existeixen cofactors? - Es mira la termodinàmica, que ens diu si l’equació és reversible o no i si esta al voltant de l’equilibri o no en condicions normals.
- Reversibilitat - Localització del metabolisme. Un mateix enzim pot estar al citoplasma i la mitocòndria, nucli... els diferents compartiments fan que el model sigui més complicat.
- Quan es te la xarxa construïda, s’ha de calcular el que gasta cada cèl·lula. El que es fa es agafar una cèl·lula i veure quants aminoàcids hi ha una cèl·lula, així doncs, això ens dona una idea del que gastarà la cèl·lula per fer un gram de biomassa (per exemple, per cada gram de biomassa, quant es gasta d’alanina).
- Requeriments d’ATP. Podem calcular el nombre d’ATPs necessaris a les equacions.
Però la cèl·lula a més, gasta energia per altres funcions. Sabent quan ATP s’obté podem fer una estimació 1 BS- Tema 4 mfiguls La manera senzilla de representar un sistema és mitjançant matrius. En aquestes, posarem estequiomètricament els valors per cada reacció. Es faran uns càlculs per mirar si quadra o no. Si no quadra, és perquè ens falta algun pas Quan el sistema arriba a l’estat estacionari totes les velocitats, tant d’entrada/sortida com les de les reaccions de dins el sistema, són constants. I per tant, com que son constants i estan multiplicant-se per una matriu, podrem formar un sistema lineal que ens serveix per explicar aquest punt estacionari (per la resta d’estats no serveix). Al ser constant, les derivades (dx/dt) seran 0, tenim un sistema lineal.
Tipus d’estudis habituals depenent de la informació disponible i els objectius Només amb l’estudi d’aquest sistema lineal ja podem saber coses. Com que el sistema de l’exemple està subdeterminat, ens donarà un “null space” que seran els Kernel.
(Ull! En aquest exemple, la matriu esta posada diferent: metabòlits àcolumnes i estequiometria per files).
- Particular solutions (solucions particulars) o Com que el sistema és lineal, Per veure si puc trobar totes les solucions particulars aplico àlgebra lineal.
o Si no es pot aplicar un sistema lineal, podem fer tècniques que ens permeten saber en quin rang estem.
o Solució experimental: afegim C13 per marcar molècules i, podem mesurar la diferència de carbonis a les reaccions per linealitzar el sistema.
- Analysis of the pathway structure (estructura del sistema) o Elementary flux modes determinats per anàlisis convex: una vegada tenim un kernel, que ens permet obtenir un conjunt de solucions, podem fer una rutina que ens maximitzi o minimitzi tal paràmetre.
o Base vectors of the null space 2 BS- Tema 4 mfiguls Les xarxes metabòliques es defineixen a partir dels seus constituents fonamentals: les reaccions.
Anem a les bases de dades i busquem l’enzim de la via, com pot ser la catalasa. Que te la reacció que es mostra a continuació: Normalment, l’equació (estequiometria) es reordena de manera que ens quedi: 0 = 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑒𝑠 – 𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑠 A mes, els noms dels enzims és habitual que s’abreugin.
L’equació, estequiomètricament, si la multipliquem o dividim per un numero es el mateix. El que canviarà serà la velocitat final. Normalment les equacions es simplifiquen de forma que les molècules ens quedin enteres (per exemple, que no ens quedi 0.5 C). També hi ha una altra manera, que es dividint cada molècula per nombre de carbonis que té (carbonMol), però aquest sistema és més complicat.
Reescalar, per tant, no invalida l’estequiometria.
La reacció es reversible per tant, la podríem haver escrit al revés.
3 BS- Tema 4 mfiguls Conceptes bàsics a recordar: • • • • • • Els coeficients estequiomètrics relacionen el nombre de molècules que intervenen. Es poden escalar mantenint la proporcionalitat.
Els signes dels coeficients depenen de la direcció escollida.
Les reaccions son reversibles i avancen cap a l’equilibri.
A l’equilibri les velocitats directa e inversa són iguals Els enzims acceleren la reacció però no poden canviar les condicions d’equilibri.
Les reaccions molt desplaçades cap a productes es poden considerar a la pràctica com a irreversibles. Fer-les anar a la inversa requeriria un subministrament d’energia que la cèl·lula no pot aportar.
Tenim una sola reacció (r1) i tres reaccions de transport (t1, t2, t3). Per cada component de la reacció hem de fer una equació de balanç.
Posem l’acumulació sempre a l’esquerra, que és la que té les derivades. Tenim una part de la generació i un altre mòdul d’entrada i sortida.
Com ja hem vist en tots els sistemes vius es compleix el principi de conservació de la matèria que es pot representar com: Acumulació = Generació + Entrada - Sortida Es pot escriure una equació de conservació o balanç per cada metabòlit, per ex.: Per treballar amb un sistema és convenient expressar-ho com matrius i vectors: En la reacció anterior farem un balanç en el qual posem la reacció en columna (r1). Els coeficients estequiomètrics desapareixen però es s’ha de tenir en compte l’entrada (t1) i la sortida (t3). Les t estan posades perquè a cada balanç hi ha un transport.
Al final, combinem totes les reaccions (fila) en una sola matriu, multiplicada per un vector amb un sol valor.
4 BS- Tema 4 mfiguls Cada fila de la matriu estequiomètrica representa un balanç a cada metabòlit intern i representa una restricció que s’ha de complir.
Per a molts estudis només és necessari tenir en compte les concentracions internes i llavors només mirem la part superior de la matriu.
Si es tenen en compte totes les reaccions, fins i tot les que hi ha fora: A la matriu que es presenta a continuació (a dalt) tindríem dalt un balanç per a les reaccions que estan dins i un altre a baix per les que estan a fora.
Però la diferència entre ambdues és que el balanç a dintre es 0 però a fora no, perquè s’estan produint o consumint.
El que succeeix és que normalment els coeficients de la matriu són senzills (0, 1 o -1). Per tant, si de fora hem mesurat que estan desapareixent X mols, podem saber directament que la velocitat de reacció t1 és una determinada.
Així doncs, podem estalviar-nos la matriu de baix i posar que t1 es tal.
Els metabòlits que estan a fora es poden mesurar i, això ens facilita la resolució del sistema per obtenir els de dins. Per això ens quedem amb el bloc en què el balanç ens dona igual a 0. El balanç representa la suma de cadascun dels components (suma de cada coeficient estequiomètric* velocitat) quan ho fem ens adonem que hi ha un terme que es la velocitat de 5 BS- Tema 4 mfiguls dissolució, la qual depèn de la mu. Aquest terme, però, no es té en compte perquè la resta dels fluxos són més grans i aquest pot obviar-se.
16/3/15 D’aquesta manera queda descrit de forma general un sistema de qualsevol grandària Si tenim Si metabolits i els seus corresponents coeficients estequiomètrics nij per cada reacció j llavors tindrem: • • En aquests casos assumirem que el canvi de concentració de metabòlits només depèn de les reaccions expressades i no d’altres factors com la difusió (sistema homogeni.
Conc. igual a tot arreu). És a dir, que l’efecte de la difusió es poc, perquè s’homogeneïtza ràpid.
Per als casos senzills també considerarem que la dilució deguda al creixement cel·lular és negligible (mu · d) respecte al canvi degut a les reaccions (efecte de les reaccions entre 100 i 1000 vegades més gran.
Turnover – o taxa de recanvi - elevat).
Per tant en no tenir-se en compte tot això, ens quedem amb matrius com les que s’han expressat abans.
6 BS- Tema 4 mfiguls En forma de matrius i vectors: Un estat que interessa és l’estat estacionari. És a dir, aquell estat dinàmic en que les variables (concentracions de metabòlits ) no canvien amb el temps à ds/dt=0 Si les variables que descriuen el sistema no varien -> la derivada és zero En un estat metabòlic estacionari anomenarem flux metabòlic (J) a: Quan un sistema s’ha estabilitzat, al conjunt de velocitats de reacció, que són constants, les anomenem J (flux).
En un cas general l’equació: • • • • És un sistema d'equacions habitualment no lineal on les velocitats de cada reacció depenen de les cinètiques de cada enzim.
A la majoria de casos aquests sistemes no tenen solució analítica i s’ha de recórrer a buscar una solució numèrica.
En un cas en estat estacionari ideal, ds/dt=0, les concentracions de metabòlits no varien i els fluxos són constants.
En aquest cas els fluxos es poden determinar si es disposa d’una informació mínima.
La matriu N conté informació de totes les vies metabòliques considerades i delimita les solucions possibles. El seu estudi ja dona informació valuosa 7 BS- Tema 4 mfiguls Per estudiar un sistema ens interessa fer-ho en estat estacionari perquè és més fàcil. El sistema també té altres estats, però molt més complicats.
Anàlisi de la distribució del flux (Metabolic Flux Analysis) Les matrius que anem construint sempre són més grans i es van fent més complexes.
El metabolisme central (glucòlisi, via pentoses fosfat, cicle Krebs) és important estudiar-lo. Tot i que el metabolisme és una xarxa complexa, moltes vegades n’hi ha prou considerant el metabolisme central. (sempre que transporti la major part del carboni) Hi ha una dotzena del metabolisme central precursors de la resta de coses, de manera que si partim de tants grams en pes sec d’aquests precursors i mesurem el pes sec de proteïnes, podem saber més o menys quan s’ha gastat per fer X grams de proteïna.
De la mateixa manera, podem calcular la velocitat a la que es sintetitza un aminoàcid En molts casos interessa calcular la distribució de fluxos metabòlics d’una xarxa, donat que es troben directament relacionats amb el seu estat fisiològic. Per determinar-los es necessiten mesures experimentals. Podem reformular el sistema inicial tal com: Agrupant les reaccions en dues matrius que inclouen respectivament, els fluxos calculats i els mesurats.
Depenent del sistema i del nombre de mesures hi ha 3 possibilitats • Sistema completament determinat: nombre d'incògnites =nombre files de Nc =rang(NC) • Sistema sobredeterminat: nombre d'incògnites <nombre equacions (assumint nombre d'incògnites =rang(NC) • Sistema subdeterminat: nombre d'incògnites > nombre equacions (lin. ind.) 8 BS- Tema 4 mfiguls Exemple: Sistema determinatà incògnites = rang (NC) Tenim una via, de la qual en fem la matriu estequiomètrica (columnes-reaccions, filesmetabòlits: A, B...).
Suposant aquest exemple, ens fixarem en quantes coses hem de mesurar. La matriu té 6 columnes i 4 files. Per tant, tenim dos graus de llibertat, de manera que mesurant dues coses el sistema hauria de ser determinat.
v1= 10 v2=2 La columna de v1 i v5 les posem juntes perquè son les que hem mesurat (Nm) i s’han de multiplicar per les seves velocitats (vm).. Igual per a la resta de valors, que seran els calculats (Nc ·vc) Així doncs, per resoldre el sistema passem Nm·Vm a l’altra banda restant, de manera que ens queda un sistema lineal. Al multiplicar Nm·Vm ens quedarà b (canviat de signe).
Una vegada tenim això, ens queda que Nc·vc=b. Així doncs, per resoldre el sistema fem la inversa de Nc-> vc=Nc-1·b 9 BS- Tema 4 mfiguls Hem mesurat dues variables (v1 i v2) perquè tenim dos graus de llibertat.
18/3/15 A continuació parlarem de sistemes subdeterminats i sobredeterminats.
Exemple: Sistema sobredeterminatà nombre d’incògnites < nombre d’equacions Tant en un sistema sobredeterminat com subdeterminat, la matriu Nc no és quadrada, el que significa que en principi Nc no es pot invertir.
Una possible solució seria reduir la matriu Nc fins a quedar un sistema determinat i fer servir les altres equacions per verificar la consistència de les dades.
Una solució alternativa és fer servir la pseudoinversa (preferentment la de MoorePenrose), que és equivalent a una solució per mínims quadrats.
10 BS- Tema 4 mfiguls Exemple: Sistema subdeterminatà nombre d’incògnites > nombre d’equacions En aquest cas, com en el sistema sobredeterminat, la matriu tampoc és quadrada.
Per tant la solució serà resoldre’l a través del mètode de la pseudoinversa, que ens donarà una solució, però no serà la única.
Tot i això, no totes les solucions són possibles. Per poder escanejar totes les possibles solucions tenim 3 mètodes: • • • Fer servir el kernel i un criteri d’optimització per seleccionar-ne una.
Afegir informació experimental (habitualment basada en marcatge amb 13C ) c c Afegir noves restriccions ..
Amb el mètode dels Kernels, el que farem serà sumar a la solució particular la solució homogènia pel Kernel: El kernel de la matriu es un valor de l’espai nul de la matriu que, al multiplicar-lo per un vector alfa (que té tantes files com graus de llibertat), podem anar buscant totes les possibles solucions.
11 BS- Tema 4 mfiguls Exemple d'utilització del càlcul de fluxos: Síntesi de lisina a C.glutamicum Per comparar sistemes comparem una soca que està produint amb una soca que no està produint, així podem veure si el model és correcte. Els paràmetres mesurats, es reescalen a 100,el que fa més fàcil el càlcul.
En aquest cas, es mostra la glucòlisi, via de pentoses fosfat, el cicle de Krebs..
El primer que es veu és que quan entra la glucosa, es divideix en dues vies: glucòlisi i via de pentoses fosfat.
En aquests sistemes el és que mirava era què passaa si s’alterava un punt del sistema. A partir dels resultats, podem determinar que té un tipus de node o altre: - Node rígid: quan una branca es distribueix en més branques (node) però es mantenen les proporcions al canviar les condicions.
- Node flexible: quan una branca es distribueix en més branques (node) i canvien les proporcions al canviar les condicions.
El fet de veure com reacciona al sistema al posar-li un metabòlit o altre ens indica si el node és més rígid o no (té mes o menys regulació).
12 BS- Tema 4 mfiguls Exemples de comparació de fluxos i efecte de condicions El gruix de la línia indica la grandària del flux metabòlic.
(veure apunts Ari) Dependent del sistema que tinguem, tindrem mes o menys informació.
Si no hi ha prou informació per resoldre la Xarxa metabòlica, s’obté més informació per mitjà de la tècnica de marcatge amb 13C. ( 13C Metabòlic flux anàlisis). Que consisteix en marcar un carboni de la glucosa, que estem afegint nosaltres.
Com que en cada reacció sabem on va el carboni marcat, es pot fer un model de la distribució de carbonis. Aquest model i els altres que teníem abans, ens permeten saber molta informació i resoldre sistemes matricials.
Normalment, en les pentoses, el primer carboni que es perd es l’1, de manera que els components que venen de la via pentosa fosfat no tindran el C1 marcat mentre que els venen de la glucòlisi si que tenen el C1 marcat.
(veure apunts Ari) 13 BS- Tema 4 mfiguls 23/3/15 Si el sistema no es pot resoldre a partir de les dades que tenim, necessitarem una font extra d’informació, com ho és per exemple marcar un carboni.
Podem marcar de 1 a 6 carbonis, de manera que tenim 26 possibles combinacions de carbonis, per tant, 64 reaccions possibles diferents. Aquestes 64 equacions les podrem resoldre per un sistema lineal, però haurà augmentat molt la quantitat d’informació.
Per veure si un component està marcat en 1,2,3,4,5 o 6 carbonis ho podem veure per: - espectrometria de masses: però només ens diu si un carboni està marcat o no, no en quina posició - Ressonància magnètica nuclear (NMR): Ens diu si el carboni del costat d’un està marcat, però no detecta els carbonis no marcats. Es podria arribar a veure la distribució de marques.
El metabòlit marcat s’afegeix quan el sistema està estabilitzat, així doncs, la distribució de les marques dependrà de com siguin els fluxos en aquell sistema. Així podríem veure, per exemple, bypass, és a dir, vies paral·leles que van a parar al mateix lloc.
14 ...