Tema 9: Caracterització estructural de macromolècules (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 1º curso
Asignatura Estructura i funció de biomolècules
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 28/04/2016
Descargas 26
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 9: CARACTERITZACIÓ ESTRUCTURAL DE MACROMOLÈCULES Mètodes espectroscòpics i les seves aplicacions Espectroscòpia: estudi de les interaccions entre la radiació, generalment electromagnètica (llum), i la matèria com a funció de longitud d’ona (λ).
La matèria seria la nostra mostra.
La interacció de la radiació amb la matèria pot resultar en diferents fenòmens que poden ser observats i seguits de diferents maneres.
El terme spectrometria és emprat per a descriure les tècniques espectroscòpiques usades per a avaluar la quantitat d’una espècie química determinada.
L’espectre electromagnètic i detall de la zona visible L’espectre electromagnètic té diferents regions de les quals nosaltres, només estem familiaritzats amb les visibles que van des de 380 fins a 750nm, per o a part té altres zones que tenen una longitud d’ona més petita (que permetran obtenir majors resolucions) fins a zones amb longituds d’ona més grans que ja no s’estudien.
Aleshores podré intentar acotar resolucions més globals o detallades en funció de l’espectre.
Aleshores els mètodes espectroscòpics són mètodes que consisteixen en incidir un feix de llum contra la matèria (mostra que vull analitzar) i quan xoquen contra aquesta generen un canvi en la radiació, i així puc obtenir diferents tipus de fenòmens o d’informacions, com la longitud d’ona o l’absorbància.
I com més baixa és la longitud d’ona de la mostra major resolució em dóna en l’estudi que jo faig del procés. Per exemple, no puc obtenir informació sobre com interacciona un aminoàcid amb un altre aminoàcid, perquè es mouen en longituds d’ona que no estan en l’ordre dels Armstrongs, n’hauré d’agafar de més baixes. Per tant, hi ha d’haver concordança entre l’espectre i el que jo espero obtenir.
Principi bàsic de l’espectroscòpia d’absorció Podem fer servir l’estructura aromàtica dels aa per mesurar la absorbància de les molècules, a unes longituds d’ona determinades. Però no totes les molècules absorbeixen, ni totes a les mateixes longituds d’ona. Aleshores quan vols fer servir l’absorbància per predir concentracions, he de saber on té el seu màxim (a quina λ té el màxim d’abs), i per això es va variant la longitud d’ona per anar observant i poder trobar on hi ha el màxim d’absorbància, i un cop s’obté es treballa amb aquest màxim d’absorció de la molècula que estem seguint. Ens permet un seguiment de la concentració.
I ho fem per la llei de lambert Beer, en que hi ha una relació lineal entre la quantitat de llum que absorbeix una mostra i la seva concentració. Quanta més concentració més absorbància tinc, fins que això perd la linealitat a partir d’una determinada concentració en què per molt que augmenti, no serà proporcional a l’augment d’absorbància.
Amb els nucleòtids, les bases nitrogenades que són un dels components estructurals, són anells aromàtics amb molts dobles enllaços que aporten la capacitat d’absorbir en l’ultraviolat, com les proteïnes (màxim a 280) però el màxim d’aquests està desplaçat i es troba més aviat en el 260. En canvi les nostres cèl·lules de l’ull, veuen a longituds d’ona que corresponen a la regió del visible de l’espectre.
I aquestes característiques d’absorció a diferents longituds d’ona també es fan servir, a part de per calcular concentracions, per analitzar canvis estructurals, o la unió a lligands per exemple.
Espectroscòpia d’absorció contra fluorescència En espectroscòpia, els àtoms de la molècula quan incideixo un feix, pateixen i donen lloc a un procés d’excitació degut a l’absorbància de manera que els electrons pugen a un estat energètic del qual extraiem informació, com la longitud d’ona a la que han absorbit. Però en altres mètodes, després d’arribar a l’estat d’excitació retornen al seu estat basal, i aquest retorn pot ser de moltes maneres: en forma de calor, de moviment, de radiacions...però això sempre és perquè prèviament absorbeixen energia. I hi ha altres molècules que quan són excitades amb radiació absorbeixen, de manera que pugen a l’estat d’excitació major i quan han de relaxar-se per tornar al seu estat basal, la manera que tenen d’alliberar aquesta energia és donant llum, i si a sobre quan la radiació que excita també és llum i el retorn és amb llum això és característic del fenomen de fluorescència. Per tant, vindria a ser com un cas concret d’espectroscòpia d’absorció.
Exemples  Els senyals d’emergència que estan il·luminats, segueixen fenòmens de fosforescència, on la llum electromagnètica és la llum incident i també hi ha una excitació i retorn però aquest retorn és molt lent, i al ser molt lent parlem de fosforescència, no podem parlar d’un fenomen de fluorescència ja que en aquest el retorn a l’estat basal és molt ràpid, de l’ordre de picosegons.
 Les polseres dels concerts per exemple, que sembla que emeten fluorescència però es tracta d’un fenomen de quimioluminescència perquè NO hi ha una excitació que provingui un feix de llum, sinó que ve donada per reaccions químiques de molècules que quan reaccionen emeten fluorescència.
 La quitina, que és un dels components de la tònica, sí que provoca un fenomen de fluorescència, perquè amb la llum que posen en les discoteques (feix de llum incident) quan incideix en el gintònic, provoca un fenomen de retorn en forma de llum que fa que el gintònic es vegi blau. O el marfil de les nostres dents també és un exemple de fluorescència, en que a partir del feix de llum blava de les discoteques es veuen com blanques/blavoses, que emeten a la peça del blanc.
Aleshores en laboratoris hem agafat aquestes molècules que tenen aquest comportament fluorescent i les hem adaptat pel nostre ús diari, però en la vida quotidiana i en la natura no hi ha molècules fluorescents, no és un procés la fluorescència força habitual.
Tot i que va haver-hi un boom concret d’una d’aquestes proteïna fluorescents, la GFP, amb l’aparició duna medusa, que té la característica de ser una proteïna súper estable, ja que té una estructura de barril β, fulles beta organitzades formant un cilindre, que té un procés de maduració per ella mateixa, i detecta aminoàcids que queden propers dins d’aquest barril que pateixen modificacions i generen un agent fluorescent, un cromòfor, de manera que la proteïna emet llum quan és excitada que cau dins l’espectre del verd. I el procés d’obtenció del cromòfor és autosuficient, no necessita de res perquè la proteïna generi aquest element fluorescent.
La gent que va fer servir aquesta proteïna coma model cel·lular in vivo, als anys 2000, van obtenir el premi Nobel a l’any 2008, i actualment hi ha moltes modificacions d’aquesta proteïna, de manera que ara tenim molècules fluorescents dins la gamma del blau, del vermell, del groc, tot i que les que provenen de modificació de la GFP, són les cian, blaves, que provenen de la maduració de l’espectre del verd. La groga i la vermella provenen de altres molècules de crustacis. De manera que amb aquesta paleta de proteïnes fluorescents podem treballar in vitro.
Tot i que necessitem saber el màxim d’absorció de les proteïnes fluorescents, i també a quina longitud d’ona emet, perquè emeten llum, per tant en fluorescència necessitem saber aquets dos factors: màxim d’emissió i màxim d’absorció. I això ho obtindrem amb el fluorímetre, no amb l’espectrofotòmetre, que només recull l’absorbància.
FRET (Fluorescence resonance energy transfer) Un dels mètodes basats en la fluorescència és el FRET, que es fa servir com a mètode principalment per veure si dues proteïnes interaccionen de manera que agafen una proteïna i li enganxen un fluorofor determinat i a l’altar igual però amb un fluorofor diferent, i després es posen in vitro i s’observa si interaccionen. Si interaccionen el que passarà és que si excito el primer fluorofor s’excitarà la segona molècula fluorescent quan captarà la llum del primer, i la llum emesa del primer fluorofor ha d’estar dins del màxim d’absorció de l’altre fluorofor, i per això no veure la llum emesa d’aquesta primer molècula, sinó que veure la llum excitada provinent del segon fluorofor. I si per contra no estan prou properes veure la llum del primer fluorofor.
Una molècula fluorescent és excitada i pot emetre un fotó (a) o transferir la seva energia a una molècula veïna (b), la qual pot ara retornar al seu estat basal amb el seu procés de fluorescència Per exemple: si aquestes 2 proteïnes de al imatge no interaccionen, quan exciti llum en el cian donarà llum a 476, i per tant serà blau el que vegi, en canvi si les dues proteïnes interaccionen, com que la groga inclou el màxim del blau de 476, excitaré a 433, al blau, i aleshores la groga absorbirà aquesta energia i la farà servir per excitar el seu compost el seu fluorofor de manera que s’excitarà i quan retroni al seu estat basal emetrà llum groga. Si hi ha un fenómen de FRET per interacció, hi haurà llum groga. I per això, és molt important saber quin fluorofor has triat, l’espectre de la segona proteïna ha d’encabir dins de l’espectre del primer, sinó NO interaccionaran, i a més les dues proteïnes han de quedar prou properes en l’espai.
Per tant, el FRET és proporcional a la distància i proporcional al solapament dels pics d’emissió i d’excitació dels dos fluorofors triats.
Exemple 2: Si augmenta la concentració de AMP cíclic aquesta subunitat interacciona amb l’R i la senyal la veure blava (activat), i deixa de ser verda (inactivat) per tant la intensitat de la senyal de color blau és proporcional a la concentració d’AMP cíclic.
BIFC (Biomolecular Fluorescent Complementation) Una altra variació del FRET és anar més enllà, com les BIFC que el què fan és aprofitar la aventatge de les GFP o altres cromòfors estables. I aquesta avantatge consisteix en que ja puc partir aquesta proteïna per la meitat i expressar la meitat dels aa per una banda, i els altres per l’altra, que si això ho barrejo es reconstitueix el barril β de la proteïna fluorescent i el cromòfor inicial sense cap alteració ni canvi.
Aleshores, a partir d’aquest fet, el que han fet han sigut variacions:  Vull saber si dos proteïnes interaccionen, doncs agafo una proteïna i li enganxo una meitat de la GFP i a l’altre, l’altra meitat de manera que interaccionen, emetran fluorescència de color verd.
 O també, podem agafar una meitat unida a la GFP(verd) i una meitat unida en la proteïna del cromòfor vermell o del groc, i anar veient quin de tots és el “partner” adient de la meitat, i en funció de la barreja de colors que es generi puc saber quin és el “partner” més habitual de la proteïna d’interès, jugant amb les combinacions de colors.
Espectroscòpia de Dicroïsme Circular (CD) Hi ha una tècnica en que la llum incident és llum polaritzada, que és llum on l’espectre té molts factors. Aleshores hi ha molècules (proteïnes) que tenen la propietat de desviar la llum incident quan és polaritzada, que s’anomenen cromòfors quirals, i aquests són els C quirals o C asimètrics de les proteïnes, de manera que les podem aprofitar.
La espectroscòpia de CD s’usa per a calcular el percentatge de cada tipus d’estructura secundària en una proteïna i per fer un seguiment dels canvis estructurals.
Hi ha unes sèrie d’aparells, els dicroismes circulars que permeten detectar aquesta desviació de la llum polaritzada Agafem la barreja de la proteïna la sotmetem a aquest tipus d’espectroscòpia, i dóna una informació de la seva estructura secundària en funció de la disposició dels aa específics dins la estructura secundària que absorbirà i difractarà d’una manera o altra la llum polaritzada, en funció del tipus d’estructura secundària que sigui.
I això ens permet veure canvis, i el contingut i tipus d’estructura secundària de la nostra mostra o molècula (proteïna o cromòfor), que s’analitzaran i reconeixeran seguint uns patrons. Per exemple, (EN LA IMATGE )el perfil blau és típic d’estructura secundària en hèlix alfa, on hi ha un mínim a 22 nm, i aquest patró serveix per saber que quan obtinguem un patró d’absorció semblant, aquella proteïna tindrà una estructura secundària en hèlix alfa, en canvi el vermell representa una estructura amb fulla beta.
Les plaques amiloides, per exemple són totes d’estructura beta. Aleshores tenim la proteïna quan no té cap problema, amb un plegament que pot ser tot amb hèlix alfa, però que pot acabar formant una placa amiloide, i aleshores observaríem la línia beta, amb un canvi en l’estructura secundària que veuríem a base de seguir els patrons.
Per tant amb aquesta tècnica es poden visualitzar canvis en el contingut d’estructures secundàries.
Espectroscòpia de masses És un mètode per a calcular la massa molecular de les macromolècules i per a la seqüenciació de proteïnes (‘Finger printing’).
I permet calcular la massa d’una macromolècula al detall, no com el gel filtració o la electroforesi. En aquest cas hi ha el MALDI-TOF, on el TOF detecta quant temps triga la mostra a arribar fins al detectors, i pot fer una relació del que pesa la mostra. És un mètode per analitzar amb molt detall masses i també permet fer seqüenciacions de proteïnes.
De manera que si tenim una barreja de proteïnes que no sabem que són, l’agafem i la sotmetem a digestió tríptica, enzimàtica, com per exemple amb tripsina o quimotripsina, que les coneixes i saps la seva especificitat de tall, i després sotmetent la barreja en un maldi-tof analitzem tots els pèptids que formaven la proteïna inicial. I la bateria de pèptids els sotmeten a una base dades que es dedica a analitzar totes les proteïnes de la base i comença a fer cerques de coincidències amb els pèptids obtinguts, i a la que troba una diana coincident amb el patró de pèptids obtingut, ho associa, i descobreix quins pèptids formen i què és la proteïna de barreja inicial que teníem. I això és el que es coneix com a Finger Printing, mètode per esbrinar la seqüenciació de proteïnes, per caracteritzar proteïnes desconegudes mitjançant les bases de dades.
A mes, l’alçada dels pics és informativa de quan pesa, però no és quantitatiu, no informa de la quantitat que hi ha de la molècula. Només informa cada pic en funció de si es mes alt o mes baix, de la capacitat que té la molècula per “volar”. El maldi per tant no és una tècnica quantitativa sinó qualitativa.
Cristal·lografia de proteïnes i difracció de raig X Última tècnica amb avantatges pots obtenir l’estructura tant de molècules petites com de grans complexos moleculars, tot i que necessites que l’estructura de la molècula que vols obtenir cristal·litzi, es formi un cristall i que una molècula cristal·litzi o no és pràcticament aleatori. Aleshores pot sortir o no.
Perquè en el fons, tens la molècula i li incideixes un feix de raigs X que quan impacta amb els electrons dels àtoms de la mostra una part l’absorbeixen i l’altre la dispersen, i el detector detecta la dispersió, però per això necessito una bona molècula cristall que impliqui que tinc tot de elements ordenats en la mateixa disposició de manera que quan incideixo el raig de llum, aquestes ones que generen la dispersió es sumen, la senyal d’intensitat augmenta, i llavors ja es pot detectar.
Per tant, podem cristal·lografiar pràcticament el que sigui que cristal·litzi, que tingui aquesta capacitat, per poder fer aquest afecte de zoom. Per tant, incidim el làser de raig X al cistell, que genera feixos de refracció pel contacte amb els àtoms, i el detectors obté el mapa de difracció, pel qual fan falta mètodes físics per extreure el patró de difracció generat com per exemple l’ajuda de que hi ha disponible l’estructura 3D d’una molècula que a nivell d’identitat seqüencial té més d’un 40% de “match” (correlació) amb la teva, el pas és molt més fàcil, per poder validar els punts trobats en el patró de difracció, punts que provenen de la difracció del cristall pel contacte del feix de llum amb cadascun dels àtoms.
...