T2. SISTEMATICA BACTERIANA (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 2º curso
Asignatura Diversitat procariotes
Año del apunte 2015
Páginas 9
Fecha de subida 17/03/2015
Descargas 3
Subido por

Descripción

T2. SISTEMATICA BACTERIANA

Vista previa del texto

TEMA 2. SISTEMÀTICA BACTERIANA L a sistemàtica és l'estudi de la diversitat dels organismes i les seves interrelacions. Associa la filogènia amb la taxonomia. Quan fem la taxonomia no només ens centrem en les característiques del grup, sinó també amb altres estudis com biològics, bioquímics, morfològics, epidemològics, etc.
L a taxonomia es defineix com la ciència de la classificació biològica. És una ciència artificial influida pels avanços tecnològics. La taxonomia s'articula ent tres eixos: classificació, nomenclatura i identificació.
1. Classificació: és l'ordenació dels microorganismes en grups o taxons en funció de semblances mútues o de parentiu evolutiu. Ha de ser un sistema de classificació estable, objectiu i predictiu.
2. Nomenclatura: és la branca de la taxonomia que socupa de l'assignació d'uns noms específics als grups taxonòmics d'acord a normes preestablertes.
3. Identificació: és la part pràctica que permet determinar si un organismes pertany a un taxó prèviament preestablert o és un de nou.
Classificació natural: – Agrupa els organismes en grups, els membres dels quals comparteixen moltes característiques.
– Aquesta aproximació no necessàriament proporciona informació sobre parentiu evolutiu.
Sistema de Linnaeus: Linné va assignar els organismes al regne animal o vegetal. Va subdividir cada categoria en categories més petites (espècie, gènere i regne). El rang bàsic de classificació era l'espècie. Es basava en les característiques anatòmiques. Fou el pare de la taxonomia moderna.
Sistemes de classificació: – Des d'Aristòtil a Linné → 2 regnes: vegetal i animal.
– Haeckel, 1866 → 3 regnes: organismes unicel·lulars (protists), vegetals i animals.
– Copeland, 1956 → 4 regnes: prcariotes (monera), protists, vegetals i animals.
– Whittaker, 1969 → 5 regnes. Tenia bastants problemes, es partia del regne monera, dos regnes molt diferenciats. La separació entre protistes, plantes i fongs no era molt clara.
– Woese, 1977 → 6 regnes. Es van diferenciar els procariotes en eubacteris i archaeobacteris.
No es correcte, s'ha de parlar de bacteris i d'arqueus.
– Cavalier – Smith, 1998 → 8 regnes. Van distingir 2 imperis. El de bacteris i el d'eucariotes.
Va intentar millorar el calaix de protistes de Whittaker.
Avui dia es parla de dominis no de regnes. Es veu l'arbre de la vida en forma de 3 dominis, 2 procariotes (bacteria i archaea) i 1 eucariota (eukarya). Van analitzar la seqüència del RNA 16S i van poder establir-ho.
Construcció d'arbres filogenètics. Dificultats: – La selecció de gens a comparar pot afectar a l'arbre resultant. Si s'utilitzen gens en l'emmagatzematge d'informació genètica surtiran un tipu d'arbres, si utilitzen gens metabòlics veuriem que determinats grups podríen assemblar-se quan en realitat no ho són.
– Duplicacions gèniques. Un mateix gen que s'ha duplicat i posteriorment ha patit una divergència evoluiva.
– Velocitats d'evolció desiguals.
– Transferència horitzontal o lateral de gens. Realment l'arbre és tant lineal o hauria d'haver-hi transferència de gens entre bacteris i arqueus, o bacteris i eucariotes. Els arbres podríen presentar altres línies dins del mateix de domini o entre dominis. Els virus juguen un paper fonamental en la transferència de gens (transferència horitzontal entre dominis i dins el mateix domini). Si aquest patró d'evolució no és tant lineal perquè mantenim aquest arbre? Encara que pot haver-hi una transferència, la intensitat de la mutació és més gran dins d'un mateix grup proper, dins del mateix domini, que entre dominis.
Taxonomia polifàsica: S'utilitza per determinar el gènere i l'espècie de cada nou procariota que es descobreix. Inocrpora informació que inclou característiques fenotípiques, genotípiques i filogenètiques.
1. Classificacio fenètica o fenotípica: agrupa els microorganismes en base a la similitud de les seves característiques fenotípiques. Poden revelar relacions evolutives però no depenen de les relacions evolutives (es comparen caràcters no ponderats).
2. Classificació genotípica: compara les similituds genètiques entre els organismes, ja siguin gens individuas o genomes complets. Des dels 70, s'accepta de forma general que els procariotes, els genomes dels quals tenen una homologia al meny dels 70%, pertanyen a la mateixa espècie.
3. Classificació filogenètica: el terme filogènia fa referència al desenvolupament evolutiu d'una espècie. Els sistemes de classificació filogenètics o filètics tractaven de comparar els microorganismes en base a les seves relacions evolutives. Habitualment, basada en la comparació directa del material genètic i els productes gènics. Més factible quan Woese i Fox van proposar la utilització de nucleòtids del rRNA per avaluar les relacions evolutives dels organismes.
Taxonomia numèrica: Ens interessa tenir classificacions fiables, objectives. Utilitzada per crear sistemes de classificació fenètics, permet estudiar molts trets a la vegada. És una taxonomia que treballa amb l'anàlisi i l'estadística. Procés de diferents fases: – Codificar la informació sobre propietats dels organismes (ex. 1= presenta la característica, 0= no presenta la característica).
– Utilització de programes informàtics per comparar els organismes (aconsellable >50 caràcters).
– Determinar el coeficient d'associació, proporció de caràcters que coincideixen amb independència de que l'atribut estigui present o no. El coeficient de Jaccard ignora aquells que en ambdós estan ausents.
– Construir una matriu de similitud.
– Identificar fenons i construir dendrogrames. Un fenó és un grup d'organismes de gran similitud (fenons amb >80% similitud = espècies bacterianes). Un dendrograma és un diagrama en forma d'arbre utilitzat per mostrar els resultats.
Rangs taxonòmics i noms: cada rang presenta unes característiques que tots els membres del grup han de respectar. Moltes vegades parlem de grups com els bacteris del sofre, però que filogenèticament inclou grups que són molt diferents (espècies de diferents phyla), és a dir, no tenen valor taxonòmic.
Nivells taxonòmics jeràrquics: Domini – fílum – classe – ordre – família – gènere – espècie.
Espècie procariota: no es pot utilitzar una definició basada en la possibilitat de creuar-se, ja que els procariotes no es reprodueixen sexualment. És una col·lecció de soques que comparteixen nombroses propietats estables i difereixen significativament d'altres grups de soques. També pot ser vàlid aquells que comparteixen les mateixes seqüències en els principals gens de manteniment cel·lular. Una soca és una població microbiana els descendents de la qual provenen d'un únic microorganisme. Poden variar entre elles de diferents maneres: – Biovarietats: difereixen bioquímicament i fisiològicament.
– Morfovarietats: difereixen morfològicament.
– Serovarietats: difereixen en les seves propietats antigèniques.
– Patovarietats: difereixen a nivell de patogenicitat.
– Fagovarietats: difereixen en la susceptibilitat a fags.
Type strain (soca de referència) → sol ser una de les primeres soques estudiades de l'espècie, així com la millor caracteritzada. No necessàriament és el membre més representatiu de l'espècie. És el tipus nomenclatural.
Gènere: grup ben definit d'una o més espècies. Clarament separat d'altres gèneres. Sovint no hi ha acord entre els taxònoms sobre l'assignació de les espècies als gèneres.
Nomenclatura binominal: Sistema per donar nom a tots els organismes (Linnaeus). A cada espècie se li dóna un nom de dues paraules en llatí. La primera paraula indica el gènere de l'organisme mentre que la segona és una paraula descriptiva i específica que indica l'espècie en particular.
Tècniques per determinar la taxonomia microbiana: Trobem les característiques clàssiques (morfològiques, fisiològiques, bioquímiques o metabòliques, ecològiques i genètiques). Trobem també l'aproximació molecular, la qual és molt important ja que els microorganismes pràcticament no han deixat registre fòssil. Permet obtenir un conjunt de dades precís i nombrós. A més, les inferències filogenètiques basades en plantejaments moleculars proporcionen l'anàlisi més sòlid actualment disponible de l'evolució microbiana.
Característiques moleculars: – Composició d'àcids nucleics – Hibridació d'àcids nucleics – Seqüenciació d'àcids nucleics – Genomic fingerprinting – Comparació de proteïnes El percentatge de GC del DNA el podem calcular a partir de l'espectrofotometria, fent una corba de fusió de DNA. És la forma més clàssica d'analitzar la composició d'àcids nucleics. El punt on el 50% està doblecatenari i monocatenari és la temperatura de fusió del DNA (Tm), la qual depèn del %GC. A major %GC, major Tm.
Depenent del tipus de microorganisme trobem diferències en el %GC. Si comparem un prostista amb un fong, veiem una aproximació del percentatge, això ens diu que no tenen que estar relacionats tot i presentar % similars. Si es diferèncien en més d'un 5% ja són diferents.
Hibridació DNA – DNA: Proporciona un índex aproximat de la similitud entre dos organismes. El protocol hauria de ser el següent: – Extreure DNA genòmic dels dos organismes.
– Digerir el DNA i marcar amb fòsfor radioactiu.
– Desnaturalitzem el DNA.
– Els juntem i els renaturalitzem (per evitar que renaturalitzi amb si mateix s'ha d'afegir més DNA de l'altre).
– Es mira el marcat que serà el que ha hibridat.
Primer es realitza amb un organisme i es considera la radiació que surt com a 100%. a partir d'aquí extrapolem a la recta el percentatge d'hibridació. Un valor superior al 70% suggereix que pertanyen a la mateixa espècie, i un valor superior al 25%, al mateix gènere.
És un mecanisme útil per diferenciar organismes molt similars.
Seqüenciació d'àcid nucleics: És el mètode més robust i directe per comparar genomes. Les seqüències de rRNA 16S i 18S són utilitzades molt sovint en estudis filogenètics. Ara es pot seqüenciar i comparar tot el DNA genòmic. S'ha proposat que un bacteri hauria de considerar-se una nova espècie si la sequència del seu rRNA 16S difereix més d'un 3% del d'una altra soca identificada, i un nou gènere si difereix més d'un 5%.
Anàlisi comparativa de seqüències de rRNA 16S: S'han descobert seqüències oligonucleotídiques signatura, és a dir, seqüències curtes i conservades específiques per un grup filogenèticament definit d'organismes. Són útils en la classificació i disseny de sondes d'àcids nucleics específiques. Es marca amb un fluorocrom i en funció de l'excitació específica es pot visualitzar el que s'ha marcat. És un marcatge inespecífic però específic per sondes. Si es vol conèixer el percentate del marcatge es pot utilitzar una tinció inespecífica.
DNA i fingerprinting: Caracteritzada per veure si dos organismes presenten el mateix patró gènic. Es pot utilitzar tècniques basades en un únic gen, en el genoma complet, en variacions de la seqüència del DNA del genoma complet i l'amplificació de regions mitjançant PCR. També es pot fer un perfil genètic a partir del polimorfisme d'un fragment generat a partir d'un enzim de restricció. Les dianes es poden guanyar o perdre segons les mutacions que s'han anat donant a través del procés evolutiu i això ens pot servir per relacionar filogenèticament als organismes. Es poden utilitzar diversos mètodes per generar patrons de fragments de DNA per l'anàlisi de similitud genotípica entre soques: – Basats en un únic gen: ribotipat – Basat en el genoma complet: PFGE – Basats en variacions de la seqüència del DNA del genoma complet i l'amplificació de regions: anàlisi de seqüències repetitives (PCR) i polimorfisme en la longitud de fragments amplificats (AFLP).
Patró de restricció: empremta genètica: Trobem enzims de restricció que poden tallar amb alta o baixa freqüència. Depenent del tipus de tall obtenim: • Ribotipat: alta freqüència de tall. Electroforesis en agarosa convencional.
• PFGE: baixa freqüència de tall. Electroforesis de camp pulsant en agarosa.
Ribotipat: 1. Extracció i digestió del DNA.
2. Electroforesis.
3. Transferència a una membrana de nilon.
4. Hibridació amb una sonda de l'operó rRNA.
5. Revelat.
6. Anàlisi comparativa dels patrons de bandes.
PFGE (Electroforesi en camp pulsant): Es treballa amb tot el genoma. En aquest cas tenim una suspensió del bacteri, es centrifuga i s'obté el pelet. S'introdueix aquest en un bloc d'agarosa i es produeix la lisi de la cèl·lula mitjançant enzims de restricció de baixa freqüència de tall. Es realitza una electrforesi o PFGE de camp pulsant, on el camp elèctric es va alternant, 120ºC cada 90 segons, fent que el seu recorregut es retardi i ens permeti veure fragments de gran tamany. Al final, s'obté aquest patró genètic a partir de tot el genoma i no del rRNA, com en el cas del ribotipat.
Les regions amplificades (diana): – Locus específics (ARDRA, amplifica el rRNA 16S).
– Regions arbitràries seleccionades (primers degenerats poc específics, com RADP, AP-PCR).
– Seqüències repetides del DNA (Rep-PCR, ERIC-PCR, BOX-PCR).
– Llocs de restricció (primers específics, com AFLP).
Amb aquestes metodologies de fingerprinting es poden comparar diferents organismes.
• Anàlisi de seqüències repetitives: Es disposen d'un primers específics per les seqüències repetitives, de manera que presentaran homologia i s'amplificarà. S'obtindran fragments de diferents mides en funció de la distribució de les zones. Es realitza un gel d'agarosa que ens separarà els fragments segons la mida i de cada soca obtindrem un patró genètic en funció dels fragments formats amb els primers. S'analitza amb un software i a partir de la taxonomia numèrica, s'analitza la presència o absència d'un caràcter o morfologia (anàlisi de clúster), per conèixer quins són més propers o quins més llunyans. En aquest cas no són caràcters, sinó posicions de bandes diferents.
• Llocs de restricció (AFLP): Es fa una amplificació de DNA i una digestió utilitzant uns enzims. Es realitza la lligació i s'utilitza un adaptador per a aquest seqüència, que tindran una unió amb els primers. D'aquesta manera es pot fer una PCR i fer un gel d'agarosa i comparar perfils electroforètics.
Seqüències multilocus (MLST): Un altre tipus de tècniques és utilitzar seqüències de DNA per determinar l'espècie i la soca.
Aquestes seqüències s'anomenen multilocus (MLST). S'utilitzen entre 5 i 7 gens bàsics de manteniment cel·lular, fet que ens permet obtenir uns resultats molt bons, si a més els organismes són molt propers entre sí.
S'utilitzen gens de manteniment cel·lular bàsic, s'amplifiquen i s'obtenen fragments d'aquests gens per tal de conèixer la seva seqüència. Es volen detectar les variacions, en aquest cas són variacions al·lèliques entre els organismes estudiats. S'utilitzen gens que evolucionin més ràpidament que els que codifiquen per rRNA. L'anàlisi simultani de gens es realitza per evitar resultats enganyosos a partir d'un anàlisi d'un gen (transferència lateral).
La diferència entre les tècniques de fingerprinting i MLST és que mentre en les primeres es treballa amb les bandes dels gels, en les últimes directament es treballa amb les seqüències.
Seqüenciació d'aminoàcids: Podem no estudiar els gens, sinó directament els seus productes. Aquestes seqüències són un reflex directe del mRNA i per tant del gen que codifica la proteïna.
La comparació de seqüències d'aminoàcids s'utilitzen proteïnes tals com citocroms, histones i proteïnes de xoc tèrmic han proporcionat una informació taxonòmica i filogenètica rellevant. No es poden utilitzar totes les proteïnes, ja que les proteïnes amb funcions diferents sovint canvien a diferents velocitats. La comparació de proteïnes es realitza mitjançant espectrometria de masses.
Es pot comparar la mobilitat electroforètica i utilitzar tècniques immunològiques.
Mètodes genotípics: Resolució taxonòmica de les tècniques moleculars: Manual Bergrey de Sistemàtica Bacteriana: David Bergrey fou un catedràtic de bacteriologia a la Universitat de Pennsylvania. Aquest manual conté una sistemàtica acceptada de taxonomia procariota. És un treball detallat que conté descripcions de totes les espècies procariotes identificades fins el moment de la seva publicació.
El Manual de Bacteriologia Determinativa va ser publicada per primer cop per Bergey i quatre colaboradors el 1923. L'organització del llibre és estrictament fenotípica on els bacteris estan dividits en 35 grups que no són rangs taxonòmics. La idea és que sigui útil per la identificació de microorganismes, a més d'incloure una clau d'identificació (fenotípica).
El Manual de Bacteriologia Sistemàtica va ser publicat el 1984-88, el qual constava de 4 volums (gramnegatius, grampositius, arqueobacteris i actinomicets). Els bacteris es distribueixen en seccions, les quals es van construir en base a caràcters descriptius morfològics i metabòlics.
La segona edició s'està publicant en 5 volums (arqueus, proteobacteris, fimicutes, tenericuts i altres, actinobacteris). En aquesta edició els procariotes s'agrupen en base a característiques filogenètiques, no fenètiques.
Descripció d'un nou organisme: – Assignació d'un nom científic: la nomenclatura està regulada per l'ICSP (International Committee on Systematics of Prokaryotes) a través de l'ICNB (International Code on Nomenclature of Bacteria). La llista aprovada de denominacions bacterianes es publica i actualitza periòdicament des de 1980 a la revista IJSEM (International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology). L'assignació del nom científic ve donat per característiques morfològiques, fisiològiques i ecològiques; el lloc de procedència i en reconeixements a científics.
– Publicació científica: IJSEM → ICSP → Approppiate Subcomittee on taxonomy → Manual de Bacteriologia Sistemàtica de Bergrey.
– Dipòsit en col·leccions de cultius: CECT (Colección Española de Cultivos Tipo), KACC (Korean Agricultural Culture Collection), ATCC (American Type Culture Collection).
...