Tema 16 Métodos en patología molecular (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Patología celular y molecular
Año del apunte 2015
Páginas 14
Fecha de subida 03/05/2016
Descargas 2
Subido por

Vista previa del texto

2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV PATOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR TEMA 16. Métodos en patología molecular (I) FISH, PCR y secuenciación La técnica estrella en patología molecular es la PCR o Reacción en Cadena de la Polimerasa que, además constituye la base de muchas otras técnicas diagnósticas  a menudo se emplea la PCR como técnica preparativa.
*Con una PCR pueden estudiarse incluso cambios epigenéticos - análisis de metilación, … Además, se han desarrollado multitud de variantes de esta técnica, aplicables en diferentes situaciones: - PCR convencional - PCR a tiempo real - PCR específica de alelo (ASO-PCR - para detección de mutaciones puntuales) - RFLP-PCR, empleada para el análisis de fragmentos de restricción.
- Transcripción Reversa PCR - MSP (methylattion specific PCR) Básicamente, para llevar a cabo una PCR es necesario: DNA molde, primers (forward y reverse), dNTPs, Taq Polimerasa.
Todos estos elementos se ponen en un TERMOCICLADOR, que aplica automáticamente ciclos de desnaturalización.
Mediante la modificación de la temperatura, se desnaturaliza y renaturaliza la doble cadena de DNA, haciendo que se anillen los primers con la secuencia.
1 Patología celular y molecular Se realiza una amplificación exponencial: a partir de unas pocas moléculas de DNA, puede obtenerse una gran cantidad del ácido nucleico. La PCR se satura llegado a un momento (se acaban los nucleótidos, …) Como resultado de la PCR, obtenemos amplicones, que habrá que analizar.
Para conocer la longitud de los amplicones se lleva a cabo una electroforesis. Los DNAs correrán en el gel según sea su peso molecular. Es necesario aplicar un marcador de peso molecular, para conocer la medida aproximada del producto de PCR.
Hoy en día, cada vez se utiliza más la técnica de la electroforesis capilar: se realiza en un capilar que tiene dentro un polímero por el que se hace pasar la muestra - el DNA migra hacia el polo positivo (ya que tiene carga negativa).
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Al final del capilar, hay una luz de excitación que excita al DNA que llega para que emita fluorescencia.
Para que el DNA emita fluorescencia, éste debe llevar un colorante. Cuanto más pequeño sea el DNA, antes llegará al final del capilar y antes emitirá fluorescencia.
Se irán produciendo picos de fluorescencia (los primeros corresponderán a los fragmentos de menor tamaño).
La PCR a tiempo real permite seguir en directo la amplificación. Aparte de los primers forward y reverse, es necesario utilizar sondas que reconozcan una región del DNA que se encuentre dentro del amplicón. Normalmente, la sonda tiene asociada una molécula fluorescente en la región 3' y un quencher en el otro extremo. El quencher impide que el fluorocromo emita luz.
Cuando hay reacción de amplificación, la polimerasa (que tiene actividad nucleasa 5'3') degrada los nucleótidos (de la sonda) que tienen el quencher (que se encuentra en el extremo 5'). El quencher se separa de la molécula de DNA, dejando libre el fluorocromo, que puede emitir fluorescencia. Por tanto, en la PCR a tiempo real se emite fluorescencia solo en fase de elongación (ya que, al final de la electroforesis, la polimerasa también degradará la parte de la sonda en la que se encuentra el fluorocromo).
3 Patología celular y molecular A la hora de interpretar la curva de amplificación a tiempo real, debe trabajarse siempre en la región de amplificación exponencial, que es cuando las PCR a tiempo real son cuantitativas.
Por ejemplo, tenemos una patología causada por el aumento del número de copias de un gen concreto. Hay que comparar la muestra que sospechamos que es patológica -Acon la muestra control -B.
La muestra patológica (A) comienza a amplificar antes que la muestra B (control). Esto significa que, efectivamente, en la muestra A había más DNA de partida.
Con una PCR a tiempo real puede estudiarse si hay más o menos copias de un gen (habrá más o menos DNA de partida). Si se quiere cuantificar en una PCR convencional, hay que vigilar el número de ciclos y parar la PCR antes de llegar a la saturación.
RT-PCR Permite realizar un análisis de mRNA. La Taq polimerasa solo puede amplificar a partir de DNA, por lo que para poder amplificar una región de RNA es necesario convertir el mRNA en DNA.
Pare llevar a cabo la RT-PCR se añaden primers complementarios de las colas de poliadenilación y se añade una transcriptasa reversa para obtener cDNA. A partir de esta molécula de cDNA se aplica el protocolo de PCR normal.
EJEMPLOS DE APLICACIÓN DIAGNÓSTICA DE LA PCR DIAGNÓSTICO DEL X FRÁGIL (patología causada por repeticiones de trinucleótidos) Deben emplearse un primer forward y un primer reverse que flanqueen la región de las repeticiones.
Con una PCR convencional es suficiente para saber cuántas repeticiones hay en la muestra, ya que los fragmentos de PCR variarán de tamaño en función del número de copias.
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV RIÑÓN POLIQUÍSTICO Se trata de una patología causada por mutaciones en pdk asociadas a microsatélites, que pueden tener longitudes diferentes. Se obtendrán distintos tamaños de bandas: las más grandes estarán asociadas al gen mutado.
Conociendo el peso molecular de los dos alelos, es posible realizar un genotipaje a partir de la PCR.
DETECCIÓN DE METILACIÓN DE PROMOTORES (cambios epigenéticos) Debe realizarse un tratamiento previo del DNA. Como ya sabemos, los promotores se metilan en las Islas CpG. Tras un tratamiento con bisulfito, las citosinas que no están metiladas se cambiarán por uracilos (cuando la citosina se encuentra metilada, no cambia). Al haber un cambio en la secuencia tras el tratamiento con el bisulfito, se puede hacer discriminación (las secuencias en las que se ha cambiado C por U no se unirán a los mismos primers que las secuencias en las que no se ha producido ningún cambio). Por tanto, se hace una PCR específica de metilación.
5 Patología celular y molecular ANÁLISIS DE CLONALIDAD El análisis de clonalidad se lleva a cabo para mirar el reordenamiento de las inmunoglobulinas en los linfocitos B. Un clon solo es capaz de generar un tipo de Ig, ya que se generan por reordenamientos cromosómicos. Se añade un cóctel de primers que permite identificar la mayoría de los reordenamientos cromosómicos y se lleva a cabo la PCR.
Mediante esta técnica puede, por ejemplo, diagnosticarse si el aumento del número de linfocitos se debe a un linfoma o a una infección. Esto se debe a que, en caso de linfoma, todos los linfocitos procederán de una misma célula y un linfocito solo puede presentar un tipo de reordenamiento  en un linfoma, hay un linfocito que está sobrepresentado, en cambio, en la infección los distintos tipos de clones están más equilibrados.
aumento del número de reordenamientos se debe a una patología infecciosa (hay una El población de cada reordenamiento).
Clones diferentes de linfocitos han proliferado con el fin de identificar antígenos diferentes.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV DETECCIÓN DE TRANSLOCACIONES CROMOSÓMICAS Es el caso de la detección del cromosoma Filadelfia  da lugar a una proteína aberrante que está en la base de muchos cánceres. Esta translocación puede detectarse con una PCR a tiempo real. A partir de mRNA de linfocitos se obtiene el cDNA. Después se diseñan los primers: uno que hibride con le región en la que se encuentra el gen Bcr y el otro que hibride con la región en la que está Abl. Así, solo se generará amplicón en caso de que se haya producido la translocación . Por el contrario cuando no hay translocación, los primers no quedarán nunca enfrentados, por lo que no habrá producto de PCR.
Partimos de mRNA (en lugar de partir de DNA) para comprobar si hay expresión y los niveles de ésta.
PCR ESPECÍFICA DE ALELO Se utiliza para diagnosticar mutaciones puntuales, por ejemplo, una mutación en la proteína JAK 2. Para detectar esta mutación se diseñan tres primers: uno de ellos homólogo a la secuencia de JAK 2 mutada (no reconoce al alelo wild type), un primer forward común (que hibride tanto si el gen está mutado como si no) y un primer reverse que detecte ambas formas.
7 Patología celular y molecular Hay dos amplicones posibles: - Amplificada con primers forward y reverse - amplifica el alelo mutante y el alelo wild type.
- Amplifica solo el alelo mutante.
En los individuos mutantes habrá dos bandas, ya que son reconocidos por ambos tipos de primers.
Se realiza de esta manera para asegurarse de que se realiza correctamente - cuando no hay resultado es porque no ha salido la PCR.
Para diseñar el primer que cubre la mutación, el último nucleótido de la mutación (el del extremo 3') debe ser el último del primer - es el nucleótido crítico para que comience la PCR. Para evitar que el primer se aparee con el alelo wild type hay que tener muy controladas las temperaturas (ya que las secuencias no son los suficientemente distintas - solo cambia un nucleótido).
Además, muchas veces, en lugar de poner un solo nucleótido de diferencia entre la secuencia mutante y la secuencia wild type (la mutación a evaluar) se ponen dos nucleótidos de diferencia, es decir, que haya un nucleótido que no es complementario con ninguna de las dos secuencias. Esto se hace para que no se produzcan errores de apareamiento y asegurarnos de que el primer no se aparee con el alelo wild type.
DIAGNÓSTICO DE HEMOCROMATOSIS La enfermedad se presenta con las dos mutaciones que aparecen en rojo en la imagen.
Esta patología se diagnostica mediante PCR - se amplifica el fragmento que puede tener estas mutaciones.
La mutación genera sitios de corte para enzimas de restricción que no están en la secuencia wild type.
Se expone el fragmento de PCR a la enzima de restricción, en este caso Rsa 1  si no hay alelo mutado, no hay lugar de restricción y la enzima o corta.
Por el contrario, cuando hay mutación, la enzima reconoce el sitio de restricción y corta.
Después se hace una PCR y se observan los resultados con electroforesis. Actualmente, se utilizan PCR que marcan fluorescencia - electroforesis capilar.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV HIBRIDACIÓN IN SITU Esta técnica permite la detección de ácidos nucleicos sin extraerlos de la célula o del tejido.
Puede aplicarse en una única célula o sobre un corte histológico y permite detectar DNA o mRNA.
En general se diseñan sondas de nucleótidos complementarias a la secuencia que queremos detectar marcadas con algo que podamos detectar.
Dos tipos: Cromogénica - CISH. La sonda se marca con un hapteno.
Fluorescente - FISH. La sonda se marca con un fluorocromo.
La sonda se pone en contacto con la muestra y se une al lugar donde encuentra complementariedad (hibridación).
9 Patología celular y molecular En CISH Se pone sobre la muestra el sustrato de la enzima conjugado con un anticuerpo que detecta el hapteno.
1º Sonda con el hapteno.
2º Anticuerpo conjugado con la enzima.
3º Sustrato de la enzima - habrá reacción donde se haya unido el anticuerpo con la enzima.
El tejido puede ser de muestras parafinadas o de muestras congeladas - se usan preferentemente las muestras congeladas.
Es posible detectar diferentes tipos de ácidos nucleicos. Por ejemplo, para detectar si un tejido está infectado por patógenos se emplea una sonda complementaria con el ácido nucleico del patógeno.
Se usa con citomegalovirus, HPV (papiloma virus).
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV FISH Las sondas se marcan con fluorocromo - hay una gran lista de fluorocromos actualmente.
Pueden marcarse sondas con diferentes fluorocromos para realizar detección simultánea (marcando cada sonda con un fluorocromo diferente).
En un CISH no es posible la detección simultánea.
Por ejemplo se emplea para el genotipaje de tumores.
Detección de Trisomía del 21 - se utiliza una sonda complementaria a una secuencia del cromosoma 21. En los casos en los que se da está patología, aparecen tres señales en lugar de dos.
Hay que poner controles para saber si el FISH es específico del cromosoma 21; para ello se añade una sonda control que hibride con otro cromosoma (en CISH no es posible poner sondas). Además, la adición de esta sonda control también permite ver si estás viendo la célula aislada (y que las señales de más no se corresponden a células superpuestas).
FISH también se emplea para aplicaciones pronósticas, como es el caso de la trisomía del 12 en leucemia mieloide crónica  las leucemias con esta trisomía presentan un pronósitco intermedio.
Aplicación de FISH al tratamiento: HER 2 está muy frecuentemente amplificado en cáncer de mama, es decir, suele aparecer un número de copias del gen mayor.
Cuando no hay amplificación, en el FISH vemos dos copias de Her2 y dos copias del control. En cambio, en los casos en los que se ha producido la amplificación aparecen más copias de FISH.
Estos resultados tienen una aplicación: las pacientes con amplificación de Her 2 se benefician del tratamiento con Herceptina que, en otras mutaciones que provocan cáncer de mama, no sirve.
11 Patología celular y molecular Para detectar deleciones de brazos cromosómicos, como es el caso del glioblastoma, se pone una sonda que reconozca específicamente la zona delecionada.
Esto tiene aplicación pronóstica y terapéutica: estos glioblastomas son sensibles a quimioterapia y tienen mejor pronóstico.
Translocaciones - por ejemplo, el cromosoma Filadelfia, formado a partir de los cromosomas 9 y 22 y que se relaciona con la leucemia mieloide crónica.
Para detectar esta translocación, se pone una sonda para el cromosoma 9 y otra sonda para el cromosoma 22. Cuando está presente el cromosoma Filadelfia, en los resultados del FISH puede verse dos cromosomas que tienen los colores de las sondas.
FISH también puede usarse en la técnica SKY: se pueden diseñar sondas específicas contra cada uno de los cromosomas, cada sonda marcada con un fluorocromo distinto.
Esta técnica permite ver las alteraciones genómicas y aberraciones cromosómicas en todos los cromosomas a la vez.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV OTROS ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS TÉCNICA DE CAPTURA HÍBRIDA  es una técnica de diagnóstico basada en la hibridación. Se usa por ejemplo para determinar las diferentes variables del papiloma virus. Cada variable se asocia con distinto riesgo de carcinoma de cérvix (alto, medio, bajo).
Se diseñan sondas para todas las variantes del virus. En cada pocillo se añade una sonda diferente.
Cuando hay hibridación DNAvírico-RNAsonda, estos híbridos se detectan con anticuerpos conjugados.
Se puede identificar la variable del HPV en función de qué pocillo da señal.
SECUENCIACIÓN DIRECTA Es una técnica muy empleada en diagnóstico.
Hasta ahora, para secuenciar se ha usado el método Sanger, que se realiza de forma automatizada. El problema de Sanger es que permite secuenciar muy pocos genes.
Basado en PCR  se añade un solo primer y nucleótidos marcados con fluorocromo . Al final se obtiene un cromatograma de la secuencia. Hoy en día, todavía se continúa usando para diagnosticar.
13 Patología celular y molecular SECUENCIACIÓN MASIVA DE DNA - NEXT GENERATION SEQUENCING Aumenta mucho la cantidad que se puede secuenciar, así como la calidad de la secuenciación.
Además, se trata de un método que, normalmente es cuantitativo, es decir, permite saber cuántas copias hay de un gen.
Las distintas casa comerciales han sacado al mercado distintas plataformas, aunque básicamente todas ofrecen: - Secuenciación del genoma entero, que permite realizar pocas muestras a la semana. Sirve para hacer screenings genéticos.
- Secuenciación dirigida: se secuencian menos genes en un número mayor de muestras. Puede hacerse cuando se conocen las mutaciones que causan una patología - cada mutación tiene su tasa de secuenciación y se suelen secuenciar las más frecuentes en cada patología.
* El genoma humano tiene aproximadamente 30 gigas.
Aplicaciones de las plataformas de Next Generation Sequencing 14 ...