8. Plasmids (2012)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biología molecular de procariotas
Año del apunte 2012
Páginas 3
Fecha de subida 07/11/2014
Descargas 1
Subido por

Vista previa del texto

TEMA  8:  PLÀSMIDS     BMP   -­‐  CARACTERÍSTIQUES   Els  plàsmids  són  material  genètic  extracromosòmic  de  mida  variable  que  no  codifiquen   funcions  essencials.  Normalment  circulars  de  doble  cadena,  tot  i  que  n’hi  ha  de  lineals,   anomenats   plàsmids   críptics,   ja   que   no   donen   un   fenotip   diferencial   sinó   que   tenen   gens   necessaris   per   la   replicació.   El   nombre   de   còpies   és   variable,   així   com   el   seu   espectre  d’hoste.  A  més,  alguns  són  incompatibles  amb  altres  plàsmids.   La   nomenclatura   per   identificar   els   plàsmids   naturals   depèn   de   les   característiques   que   donen,   mentre   que   els   plàsmids   artificials   s’identifiquen   amb   una   p   minúscula   seguida  de  lletres  (identifiquen  el  responsable)  i  nombres  (identifiquen  el  contingut).   -­‐  PROPIETATS   Entre   les   propietats   que   els   plàsmids   poden   conferir   als   seus   hostes,   destaquen   les   resistències  a  antibiòtics,  la  capacitat  de  metabolitzar  certs  components  o  la  virulència.   -­‐  ESTRUCTURA   1.  OriV:  és  imprescindible,  ja  que  és  l’origen  de  replicació  del  plàsmid.   2.  Funcions  de  transferència:  operó  Tra  per  la  conjugació  i  OriT.   3.  Multicloning  sites:  regió  amb  dianes  d’enzims  de  restricció  (plàsmids  artificials).   4.  Gens  de  resistència:  característics  dels  plàsmids.   -­‐  REPLICACIÓ  DELS  PLÀSMIDS  CIRCULARS   1.  Replicació  Theta   És  la  majoritària  i  pot  ser  unidireccional  o  bidireccional.   2.  Replicació  del  cercle  rodant   És   un   tipus   de   replicació   unidireccional   que   dóna   lloc   a   un   plàsmid   bicatenari   i   a   un   de   monocatenari.   La   proteïna   Rep   talla   una   de   les   cadenes   del   plàsmid   a   la   regió   DSO   (origen  de  replicació  del  dsDNA)  i  s’uneix  a  l’extrem5’  resultant,  mentre  que  l’extrem  3’   serveix   de   primer   per   a   la   replicació   de   la   cadena.   Un   cop   replicada,   la   proteïna   Rep   talla  un  altre  cop  la  cadena  i  una  lligasa  uneix  els  fragments,  donant  lloc  a  un  plàsmid   monocatenari  que  es  replicarà  a  partir  del  SSO  (origen  de  replicació  del  ssDNA).         1   TEMA  8:  PLÀSMIDS     BMP   -­‐  MECANISMES  DE  CONTROL  DE  LA  REPLICACIÓ  DELS  PLÀSMIDS  CIRCULARS   1.  Regulació  mitjançant  RNA  antisentit  (plàsmids  ColE1  i  derivats)   No   hi   ha   proteïna   Rep,   enlloc   d’això   es   forma   un   híbrid   RNA   II   –   DNA   a   l’OriV.   Una   RNasa   H  trenca  el  RNA  II,  alliberant  un  extrem  3’-­‐OH  que  permet  la  replicació.  Quan   augmenta  la  quantitat  de  RNA  I,  aquest  s’uneix  al  RNA  II,  evitant  la  replicació.   2.  Regulació  mitjançant  proteïnes   Per   replicar-­‐se,   els   plàsmids   necessiten   DnaA   i   RepA   de   l’hospedador.   A   l’OriV   hi   ha   iterons   (seqüències   repetitives   directes)   on   s’hi   uneix   RepA.   Si   no   hi   ha   prou   RepA   unida  als  iterons,  el  plàsmid  no  es  replica,  així,  quan  hi  ha  moltes  còpies  del  plàsmid,   cal  més  RepA  i  la  replicació  s’atura.   En  cas  dels  plàsmids  RK6,  la  proteïna  de  replicació  no  és  RepA  sinó  π,  pròpia  del  fag  λ.   Per  tant,  les  cèl·∙lules  que  tinguin  el  fag  integrat  podran  mantenir  RK6  estable,  mentre   que  en  aquelles  cèl·∙lules  on  no  hi  ha  el  fag,  el  plàsmid  serà  un  vector  suïcida.   *  Vector  suïcida:  OriV  no  funcional  en  unes  determinades  condicions.   *  Vector  condicional:  plàsmid  amb  replicació  termosensible.   -­‐  REPLICACIÓ  DE  PLÀSMIDS  LINEALS   Tenen  l’OriC  al  centre  i  replicació  bidireccional.  Tenen  un  loop  als  extrems  per  evitar   ser  degradats.  Un  cop  replicats,  es  produeix  un  tall  a  cada  extrem.             -­‐  NOMBRE  DE  CÒPIES  D’UN  PLÀSMID   Segons  el  nombre  de  còpies  d’un  plàsmid  després  de  la  divisió  cel·∙lular  distingim:     a)  Plàsmids  relaxats:  mínim  40  còpies  per  cèl·∙lula.     b)  Plàsmids  estrictes:  1-­‐2  còpies  per  cèl·∙lula.   El  nombre  de  còpies  està  associada  a  la  mida  dels  plàsmids  (més  mida,  menys  còpies)  i   als  mecanismes  de  regulació  de  la  replicació  ja  esmentats.   -­‐ ESTABILITAT  DELS  PLÀSMIDS   Estabilitat  es  refereix  a  les  probabilitats  de  que  el  plàsmid  es  mantingui  a  les  següents   generacions   cel·∙lulars.  Com  més  nombre  de  còpies  hi  hagi  a  la  cèl·∙lula,  més  fàcil  és  que   ambdues  cèl·∙lules  filles  rebin  almenys  una  còpia.       2   TEMA  8:  PLÀSMIDS     BMP   -­‐  MECANISMES  DE  SEGREGACIÓ   Els   plàsmids   relaxats   no   necessiten   una   segregació   específica   per   assegurar-­‐ne   el   manteniment  a  les  cèl·∙lules  filles,  però  sí  els  plàsmids  estrictes:   1.  Mecanisme  mediat  per  Par:   El  plàsmid  es  replica  i  queda  unit  al  complex  de  partició  (al  mig  de  la  cèl·∙lula).  Als  pols   d’aquest  complex  filamenten  les  proteïnes  ATP-­‐ParM,  que  asseguren  la  segregació  de   les  còpies  del  plàsmid  a  pols  oposats.   2.  Sistema  toxina  –  antitoxina:   El   plàsmid   codifica   una   toxina   que   actua   sobre   la   cèl·∙lula   hoste   i   una   antitoxina   que   actua  sobre  la  toxina,  tot  i  que  és  inestable.  Ambdues  substàncies  es  troben  a  tota  la   descendència,  però  si  no  hi  ha  plàsmid,  la  antitoxina  es  degrada  amb  el  temps  al  ser   inestable.  Així,  la  cèl·∙lula  que  no  rebi  cap  plàsmid  acabarà  morint  per  acció  de  la  toxina,   mentre  que  la  que  tingui  plàsmid  viurà  degut  a  la  síntesi  d’antitoxines  del  plàsmid.   -­‐  CAMPATIBILITAT  I  INCOMPATIBILITAT  PLASMÍDICA   Dos  plàsmids  són  incompatibles  si  no  poden  trobar-­‐se  estables  en  una  mateixa  cèl·∙lula.   Hi  ha  dos  tipus  d’incompatibilitats  segons  el  nivell  al  que  es  doni  la  interferència:     a)   Interferència   a   la   replicació:   un   dels   plàsmids   té   una   afinitat   major   a   l’inductor  o  inhibidor  de  la  replicació,  podent  replicar-­‐se  només  un  d’ells.     b)   Interferència   a   la   segregació:   tot   dos   plàsmids   s’uneixen   al   mateix   lloc   del   replisoma,  podent  unint-­‐se  el  que  tingui  més  afinitat?   Per  saber  si  dos  plàsmids  són  incompatibles,  es  marquen  amb  una  resistència  diferent  i   s’insereixen   a   la   mateixa   cèl·∙lula.   Es   cultiven   amb   un   medi   selectiu   per   les   dues   resistències:  si  han  crescut  colònies,  són  compatibles.   *  Es  poden  donar  falsos  positius:  es  poden  formar  cointegrat  dels  dos  plàsmids  o  la  recombinació  amb  el   cromosoma.   La   formació   de   cointegrat   no   es   pot   evitar,   però   sí   la   recombinació   amb   el   cromosoma,   -­‐ usant  soques  RecA .   -­‐  ESPECTRE  D’HOSTE   Els   plàsmids   que   formen   part   del   mateix   grup   d’incompatibilitat   tenen   en   comú   el   mateix  espectre  d’hoste.  Podem  parlar  de:     a)  Espectre  ampli:  si  el  plàsmid  usa  el  mínim  la  maquinaria  cel·∙lular.     b)  Espectre  restringit:  si  el  plàsmid  usa  molta  maquinària  cel·∙lular,  contra  més   n’usi,  més  específica  serà  i,  per  tant,  més  restringit  l’espectre.   3   ...