DGM- Tema 5. PCR convencional (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 12
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 7
Subido por

Vista previa del texto

mfiguls DGM- Tema 5 TEMA 5: PCR CONVENCIONAL Com vam dir, les aproximacions pel genotipat són: - Hibridació: Southern, Northern, FISH...
- Clonació: desenvolupada per Kary Mullis à PCR / Clonació dins de cèl·lules PCR La PCR és una amplificació selectiva de seqüències de DNA realitzada en un sistema in vitro lliure de cèl·lules. Permet l’obtenció d’un elevat nombre de copies d’una seqüencia de DNA a partir de petites mostres i en mal estat de conservació. Aquest és un gran avantatge de la PCR vers la FISH.
El que requereix la PCR però, és que la seqüencia a amplificar estigui en bon estat.
Què necessitem? - DNA motlle - Polimerasa (Taq polimerasa) - Encebador, que ens marcarà el punt d’inici d’amplificació o Compte! Poden hibridar entre ells.
- dNTPs - Buffer Polimerases de DNA Klenow: polimerasa d’E- Coli en la qual s’ha eliminat l’activitat exonucleasa.
- Però aquesta polimerasa es desnaturalitza en desnaturalitzar-se el DNA. De manera que en cada cicle se n’hauria d’afegir de nova - És poc eficaç perquè funciona òptimament a 37 ºC, de manera que a aquesta temperatura, les condicions d’astringència són baixes i per tant l’especificitat serà baixa (s’amplifiquen moltes regions).
Taq polimerasa (Thermus aquaticus): es va començar a utilitzar al 1988 - és una polimerasa termostable, per tant, aguanta les condicions de temperatura a les que es sotmet el DNA. De manera que no s’ha d’anar renovant té una temperatura òptima de 95ºC, el que permet treballar a elevades temperatures, obtenint així una elevada especificitat.
1 DGM- Tema 5 mfiguls - - Que sigui termostable no vol dir que no es desnaturalitzi, al contrari, a mesura que es va augmentant la temperatura es va desnaturalitzant un percentatge d’enzim, per tant, si féssim molts cicles ens quedaríem sense. La taq, no obstant, té una vida mitja major que moltes altres polimerases.
La taq és bona però no serveix per amplificar seqüències grans (més enllà de 3-4 Kb), ja que no té correcció d’error. Si s’introdueix un error, la cadena es dissocia i la síntesi no pot continuar.
Característiques de les polimerases: - Vida mitja - Processivitat: és la llargada mitjana de la cadena sintetitzada sense dissociar-se l’enzim del DNA motlle.
- Magnesi: és un cofactor de totes les polimerases - Extension rate (temps d’extensió): quants nucleòtids pot afegir en un temps determinat.
- Activitat exonucleasa 3’à 5’ (proofreding): es pot utilitzar o no en funció de si ens interessa un enzim que repari.
- Taxa d’error per pb - Activitat retrotranscriptasa: precisa Manganès.
Long range PCR: Mescles d’enzims: Taq i una altra polimerasa amb correcció de prova Les cases comercials fan, doncs, barreges de polimerases: normalment la Taq amb alguna altra o més d’una amb capacitat de reparació.
Per tant, la Taq és la polimerasa general i la que fa la síntesi. Quan produeix un error, les cadenes de DNA es dissocien i els altres enzims amb capacitat de reparació arreglen el nucleòtid, el que baixa la processivitat (perquè aquests la tenen més baixa). Llavors quan aquesta polimerasa que té capacitat de reparació es dissocia del DNA, la taq pot continuar la síntesi.
- en general es poden aconseguir cadenes de 12-13 kB 2 DGM- Tema 5 mfiguls Buffer de la reacció de PCR, dNTP i magnesi - El buffer de la reacció de PCR sol contenir Tris-HCl i KCl El pH és de 8,3 a 25 ºC però en augmentar la temperatura baixa fins un 6,8 El Mg+2 és necessari per l’activitat de la Taq polimerasa. Però en general, les cases que venen l’enzim també venen el buffer, però aquest no conté magnesi.
Això és perquè el magnesi es un cofactor de la polimerasa i aquest necessita estar en una quantitat optima, per tant, l’haurem d’afegir nosaltres.
Però el magnesi és un ió bivalent, de manera que també es podrà unir als dNTPs, encebadors i DNA motlle.
- segons la quantitat de magnesi, se’n unirà més o menys - s’ha d’ajustar la seva quantitat de manera que obtinguem una concentració de Mg+2 lliure de al menys 1,2-1,3 mM o si hi ha menys magnesi à no hi ha amplificació (baixa eficàcia) o si hi ha més magnesià hi ha amplificació inespecífica.
Per tal de determinar la quantitat necessària de Mg+2 en cada cas, hem de fer un banc de dilucions fins que obtinguem la banda de l’amplicó sense soroll de fons. Per tant la seva concentració serà diferent per cada PCR.
A més, els dNTP competeixen pel Mg+2 en quantitat equimolar. Hi ha d’haver la mateixa concentració de cada un dels quatre dNTP (50-200mM) A més, al buffer es poden afegir additius, que serveixen per estabilitzar la Taq i així evitar interferències. Per exemple, amb additius podem eliminar les estructures secundàries que es formen en algunes seqüències de DNA.
- Ex/ DMSO: alhora però, és un inhibidor de la PCR, hem de trobar les condicions òptimes Inhibidors de la PCR 3 DGM- Tema 5 mfiguls Moltes vegades, si les mostres de DNA són brutes, contenen inhibidors de la PCR (SDS, àcid húmic,...) o alguns compostos que poden interferir negativament en la reacció.
Com que no hi ha problemes en que hi hagi menys DNA en la mostra, pot ser aconsellable diluir-la per tal de diluir aquests compostos.
19/3/15 Encebadors A la Polimerasa li hem d’indicar els punts d’inici i final de síntesi. Els encebadors, permeten definir els límits (extrems 5’ de cada un d’ells) de la seqüencia específica del DNA a amplificar, per tant, també la seva grandària.
Per tant, els encebadors han de ser per les dues cadenes (forward i reverse). Un cop dissenyats, baixem la temperatura de manera que els encebadors s’uniran a la cadena i ens definiran els extrems de la síntesi.
Per tant, els amplicons determinaran la regió que s’amplifica i la grandària dels amplicons.
Disseny d’encebadors 1. Llargada: • Entre uns 15-25 nt.
La llargada de l’encebador i la grandària són importants, no només per estimar la Tm, sinó també perquè determinant l’especificitat de l’hibridació.
La probabilitat de trobar una seqüencia en el gDNA depèn de: - la llargada de l’encebador - la llargada del genomaà com més gran sigui, hi ha mes probabilitats de trobar una seqüencia X - La probabilitat que un encebador de n nucleòtids hibridi al atzar amb una seqüencia de m nucleòtids de llargada és: Com més llarg sigui l’encebador, més específic serà.
4 DGM- Tema 5 mfiguls 2. Composició de bases: - Idealment, hi hauria d’haver una proporció semblant de cada un dels nucleòtids (1/4 ) però no és essencial - un contingut de G i C semblant en la parella d’encebadors o El contingut GC hauria d’estar entre 25-75%, ja que sinó els encebadors serien molt inespecífics.
- evitar repeticions i la possible formació d’estructures secundàries 3. Temperatura de fusió (Tm) - La Tm dels dos encebadors ha de ser el més igual possible.
Càlcul de la Tm: - Per a l’encebador, l’extrem 5’ no és essencial (fins i tot pot tenir una seqüencia que no correspongui a la del genoma a en qüestió). Al calcular la Tm de l’encebador, es calcula a partir de l’extrem 3’ de l’encebador que hibrida (l’afegit en 5’ no es té en compte en la Tm).
- Les A/T incrementen en 2ºC la Tm i les G/C en 4ºC (tot i que això és molt aproximat).
- La TM depèn del nombre de nucleòtids i a més, el tipus de nucleòtids (G/C són més estables que A/T). Però si tenim dos encebadors amb igual nombre de nucleòtids i igual composició de bases, no tindran la mateixa Tm, ja que aquesta també depèn del tipus de seqüencia.
§ Si els nucleòtids estan repartits de manera heterogènia à La Tm es mes baixa • Ex/ GCATTAGCCGTA § Si els nucleòtids d’un tipus estan junts, les zones riques en G/C estabilitzen molt à la Tm es més alta • Ex/ GGCCCGGATATATT 4. Extrem 3’: Dímers d’encebadors Els encebadors es poden complementar pels extrems 3’ i formar dímers d’encebadors. Si això ha succeït, en l’electroforesi, veurem bandes més difuses i més a baix. Si això ens apareix no és bo ja que estem perden quantitat d’encebadors i els dímers ens poden afectar al resultat.
5 DGM- Tema 5 mfiguls Per tant, s’ha d’evitar la formació de dímers d’encebadors. Per tant, pel que fa a l’extrem 3’ dels encebadors: - Assegurar-nos que els encebadors, en l’extrem 3’, siguin prou complementaris amb la seqüencia a amplificar - ens hem de fixar en l’extrem 3’ dels encebadors per si poden complementar entre ells.
o Disposem de programes que ens calculen si dos encebadors poden complementar entre ells.
Per tant, això pot implicar que una PCR múltiple sigui difícil.
La PCR és una reacció en cadena, de manera que s’aniran donant cicles de hibridació-extensiódesnaturalització.
La temperatura optima de la Taq està al voltant dels 72ºC, per tant, si volem que la PCR vagi ràpid la posarem a aquesta temperatura. Hem d’anar en compte amb això, ja que a aquesta temperatura els encebadors no hibridaran, de manera que hem de baixar la temperatura. Un cop han hibridat i s’ha iniciat la síntesi, ja la podem pujar perquè els amplicons en síntesi ja no es desnaturalitzaran: Això dona lloc a 3 fases: - Desnaturalització: 95ºC - Hibridació (dels encebadors): 55 ºC - Polimerització: 72ºC Depenent del termociclador, es tarda més o menys a canviar de temperatura. Això s’ha de tenir en compte i reajustar en cada termociclador. Sinó, pot ser que la PCR no funcioni.
6 DGM- Tema 5 mfiguls Primer, segon i tercer cicle de PCR En el primer cicle tindrem uns amplicons, que serviran com a motlle dels encebadors per al segon cicle.
Aquests, seran més llargs que la llargada que hauria de tenir l’amplicó (definida pels primers). Al segon cicle passarà el mateix, però seran més curts. Al tercer cicle ja aconseguirem amplicons de la llargada definida (fixa, determinada pels encebadors). No és fins al tercer cicle que no tenim aquestes cadenes de DNA que interessa amplificar.
à La llargada de l’amplicó es manté constant al llarg dels cicles, però el nombre de molècules creix exponencialment (teòricament) à També tindrem molècules de llargada intermitja i petita, que no afectaran.
7 DGM- Tema 5 mfiguls Per tant, en un nombre de cicles determinat, podem calcular el nombre d’amplicons que tindrem.
E: eficiència de la reacció: Sol ser entre 80-90% per tant, no tenim aquest increment exponencial m: nombre de molècules de les que partim, com major sigui, més molècules aconseguirem en n cicles n: nombre de cicles Fase final de la PCR L’increment del nombre de molècules de la PCR NO ES EXPONENCIAL perquè té un MÀXIM del que no es pot sobrepassar. Això és perquè s’esgoten: - els dNTPs - les unitats efectives de Taq. L’activitat de la Taq es veu reduïda en cada reacció com a conseqüència dels canvis de temperatura - quantitat d’encebadors lliures. Els encebadors formen part de les noves cadenes que s’han sintetitzat, de manera que ja no es poden utilitzar.
- les cadenes sintetitzades renaturalitzen.
Inespecificitats: Es quan ens apareixen bandes al gel que no esperàvem. Les inespecificitats es poden deure a diferents motius: - Off target site primer dímer: els encebadors han hibridat inespecíficament amb regions del genoma que no ens interessen (fora de la regió a amplificar).
A més, si un encebadors s’uneix inespecíficament a una regió i s’amplifica creant un lloc complementari a l’altre encebador, llavors s’hi uneix l’altre i haurem amplificat una regió que s’anirà amplificant al llarg de tots els cicles - Activitat de Taq fora la fase de polimerització: La taq té l’òptim a 72 ºC, però pot sintetitzar inespecíficament a temperatures més baixes si els encebadors han hibridat en regions inespecífiques i s’hagin estabilitzat (perquè hi ha temperatures baixes) Les inespecificitats es donen al principi de la PCR 8 mfiguls DGM- Tema 5 24/3/15 Mètodes per evitar inespecificitats degudes als primers cicles: - Touch down PCR: Reduir progressivament al llarg dels cicles la temperatura d’hibridació, fins arribar a 48 ºC (temperatura d’annealing). Amb això, les primeres seqüències que es sintetitzaran seran molt mes específiques perquè seran les que son complementàries amb l’encebador.
Això també implica que hem de programar el termociclador.
- Hot start PCR: començar la PCR en calent. Mesclar, introduir o activar la polimerasa de DNA en el moment de la primera desnaturalització.
Es la tècnica que s’utilitza més. El problema principal el tenim a l’inici, on es passa de temperatura ambient fins a temperatura d’hibridació, on es poden formar inespecificitats. L’ideal seria començar amb calent, és a dir, que la Taq sigui activa en el moment en que la temperatura és elevada.
La hot start es pot fer de diferents maneres: o Manual: Algun dels components que no s’introdueix del principi, com el magnesi o la polimerasa, s'afegeix quan la temperatura ja és superior a 70ºC.
§ Però això pot donar problemes, com per exemple, que se’ns evapora l’aigua.
Aquesta tècnica, actualment no es fa.
o Separació física: Els components de la reacció es divideixen en dues mescles separades per una barrera, com la cera. Quan es puja la temperatura, la cera es fon, i quan es refreda, solidifica i fa una capa. Llavors, sobre aquesta hi posarem la mescla amb la taq i pujarem la temperatura, de manera que la cera es fondrà i es barrejaran tots els components.
§ El problema es que quan acabem la PCR, en tots els eppendorfs tenim una barrera de cera que hem d’eliminar 9 DGM- Tema 5 mfiguls o - Utilitzar Hot-start Taq: polimerases termostables inactivades fins a una determinada temperatura. És molt aconsellable utilitzar aquestes Taq (treball DGM!!) § Anticossos: La polimerasa de DNA s’afegeix unida a anticossos inactivants termosensibles § Polimerases químicament modificades: La polimerasa de DNA s’afegeix unida a un grup químic bloquejant termosensible Nested PCR (PCR niuada): Es basa en fer una primera PCR normal, i després, realitzar una segona reacció de PCR amb encebadors interns del fragment amplificat en la primera PCR.
La Nested PCR ens soluciona dos problemes o Ens millora l’especificitat: A vegades a la PCR no apareix producte o n’apareix molt poc perquè s’ha partit d’un numero baix de còpies. Amb aquest mètode ho podem solucionar.
o Ens evita inespecificitats: Poden aparèixer inespecificitats, que amb aquest mètode es poden evitar.
10 DGM- Tema 5 mfiguls Per tant, si fem la Nested PCR hem de dissenyar 4 encebadors (2 dels extrems i 2 interns), Si ens volem estalviar diners podem fer una hemi-Nested (Seminiuada), és a dir, només s’utilitzen 3 encebadors (2 extrems i 1 intern). Llavors la primera reacció es farà amb els encebadors dels extrems i la segona amb un de l’extrem i un intern PCR a partir de petites quantitats de DNA Ens podem trobar en que partim de poques quantitats de DNA, això s’explica per dues raons: - Partim de DNA d’una o unes poques cèl·lules (DGP o DP no invasiu) - Poques molècules de DNA dintre d’una població major (infeccions, cèl·lules canceroses, trasplantament de moll d’os) o És la pitjor situació, perquè hi ha molt DNA estrany que pot generar inespecificitats En aquests casos, haurem de fer obligatòriament una Hot-start, i també podem fer una Nested-PCR.
11 DGM- Tema 5 mfiguls RT-PCR: Anàlisi de RNA per PCR - La PCR precisa un motlle de DNA: per tant no podem analitzar directament el RNA, sinó que primer l’hem de retrotrancriure obtenint així un cDNA que llavors s’amplificaràà RT-PCR La RT-PCR és una tècnica ràpida i sensible que permet analitzar RNA de petites mostres biològiques.
Aquesta tècnica té els següents passos: 1. Aïllem el RNA: utilitzant un kit que porti DNases que eliminen el DNA que pugui interferir 2. Retrotrasncripció a. M-MLV: Retrotranscriptasa del virus de la Leucèmia Murina b. AMV: Retrotrancriptasa del virus del Mieloblastosi Aviar c. Tth: DNA polimerasa de Thermus thermofilus. Aquesta, pot utilitzar tant DNA com RNA com a motlle, per tant, si la utilitzem podem fer la retrotranscripció i la PCR en una sola reacció, el que disminueix les probabilitats d’error.
• L'enzim replica el DNA a 74°C i té una vida mitjana de 20 minuts a 95°C.
• L’activitat polimeràsica de DNA depenent de DNA de Tth precisa magnesi i la depenent d’RNA de manganès.
3. PCR a partir del cDNA Encebadors per a la retrotranscripció: - Específics de seqüencia - OligoDT: per amplificar seqüències de mRNA de forma inespecífica - Hexàmers aleatoris Com distingir si hem amplificat bé el cDNA o bé hi ha DNA contaminant que hem amplificat? Imaginem que per la RT-PCR, hem dissenyat dos encebadors sobre exons diferents del gen, i que, per tant, estan presents tant en el cDNA com en el DNA del gen.
• Si s’ha amplificat el nostre cDNA (que no conté introns), al gel, la banda serà més petita. No obstant • Si s’ha amplificat el gen, és a dir, si hi ha contaminació per DNA, com que aquest conté introns, la seqüencia amplificada serà més gran, i veurem al gel una banda més gran.
Això nomes ho podem detectar si els encebadors estan dissenyats sobre exons diferents (i no sobre introns). A més, també és important tractar la mostra amb DNasa 12 ...