Biocatàlisi Tema 6 (Part 1) (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biocatàlisi
Año del apunte 2015
Páginas 6
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 14

Vista previa del texto

1 INTRODUCCIÓ: QUÈ SÓN ELS ENZIMS? 2 CLASSIFICACIÓ I NOMENCLATURA DELS ENZIMS.
3 CINÈTICA ENZIMÀTICA (I).
4 CINÈTICA ENZIMÀTICA (II).
5 CINÈTICA ENZIMÀTICA (III).
6 TEMA 6. INHIBICIÓ ENZIMÀTICA (I) 6.1 INTRODUCCIÓ A vegades és interessant analitzar la cinètica enzimàtica des del punt de vista de quin és l’efecte que poden produïr molècules que no participen directament a la reacció enzimàtica, que no estan a l’estequiometria, i que modifiquen l’activitat dels enzims. Nosaltres podem modificar les condicions de la reacció variant el pH, la temperatura, o precipitant l’enzim a fi de canviar-li l’activitat, però això no és inhibició. Considerem com a inhibidors aquelles molècules que per interacció afecten l’activitat dels enzims.
A nivell fisiològic, la inhibició és un dels sistemes de regulació enzimàtica més importants de la cèl·lula. Els avantatges que ens presenta el treball amb inhibidors és diferenciar entre diferents mecanismes enzimàtics, analitzar estructures tridimensionals, tenir informació del centre actiu... a més, també hi ha inhibidors amb aplicacions clíniques i industrials.
Ens centrarem a estudiar inhibidors, que com ja hem dit són molècules diferents del substrat o el producte.
Però abans recordarem que aquests dos elements també poden actuar com a inhibidors. La presència de producte a la reacció fa baixar-ne la velocitat: per tant podem dir que el producte actua com a un inhibidor de la reacció, això cal tenir-ho en compte a l’hora de decidir el disseny experimental. Imaginem que volem quantificar l’activitat de la glucosa 6 fosfatasa a pH 6,5. Per aconseguir aquest pH necessitem tampons; hem d’escollir-ne un sense fosfat perquè aquest inhibirà la reacció. Recordem que el producte d’una reacció catalitzada per una fosfatasa dóna com a producte el substrat desfosforil·lat i fosfat lliure.
6.2 INHIBICIÓ PER EXCÉS DE SUBSTRAT.
Quan utilitzem un substrat de baix pes molecular observem que quan n’augmentem molt la concentració aquest té un efecte inhibidor, és a dir, l’activitat enzimàtica és baixa a altes concentracions de substrat. L’explicació a aquest fenomen és que l’enzim, a més de tenir un centre actiu que interacciona amb el substrat, pot tenir un centre de fixació menys específic del substrat que s’ocupa només quan aquest es troba a altes concentracions. L’ompliment d’aquest centre té un efecte d’inhibidor.
6.3 CLASSIFICACIÓ DELS INHIBIDORS Tenim tres classes: reversibles, irreversibles i de fixació forta.
→Els inhibidors reversibles són molècules que interaccionen amb l’enzim de forma no covalent, de manera que la reacció és reversible i en funció de la concentració d’inhibidor la reacció estarà més desplaçada cap a un cantó o cap a l’altre. La velocitat de la reacció ve determinada per la constant d’equilibri de formació del complex enzim-inhibidor (EI). La velocitat d’inhibició és ràpida perquè ens trobem en un equilibri químic. In vitro podem eliminar l’efecte de l’inhibidor amb tècniques que en baixin la concentració (diàlisi). El sistema viu pot metabolitzar l’inhibidor per baixar-ne la concentració.
→La inhibició irreversible és aquella que implica la formació de complex enzim-inhibidor amb un enllaç covalent. En aquest cas l’activitat segueix un procés cinètic: hi ha una constant de velocitat k. La reacció és més lenta i in vitro no es pot revertir perquè hem modificat químicament l’enzim. El sistema viu elimina l’enzim modificat i en sintetitza de nou per regular-ne la concentració.
→Inhibidors “tight binding”. El complex EI es forma sense enllaços covalents. Tot i que hauria de ser reversoble, l’afinitat entre aquests dos és tan gran que no els podem dissociar. En essència és reversible però el comportament és irreversible. Un exemple són les estatines que regulen la biosíntesi del colesterol, antibiòtics com les beta-lactamases i inhibidors de proteases que s’utilitzen per tractar el VIH.
6.3.1 Inhibició reversible Dins de la inhibició reversible trobem tres subgrups, que classifiquem en funció del moment de la reacció en el qual interaccionen i l’intensitat.
Competitiva: l’inhibidor s’uneix a l’enzim lliure. Així, l’enzim formarà complex amb el substrat o amb l’inhibidor: el substrat i l’inhibidor competiran per unir-se a l’enzim. En aquest sistema hem de considerar la constant de la reacció de formació del complex EI (Ki). La velocitat d’inhibició depèn d’aquesta constant.
Acompetitiva: l’inhibidor només s’uneix al complex ES. Primer es forma ES, i després sobre aquest interacciona l’inhibidor. Es forma el complex ternari ESI. En aquest cas la velocitat d’inhibició ve determinada per la Ki’.
Mixta: l’inhibidor es pot unir a l’enzim lliure i després interacciona amb el substrat, o bé primer interaccionen l’enzim i el substrat i després intracciona amb l’inhibidor. En aquest procés tenim Ki o Ki’. En aquells casos on les dues constants siguin iguals ens trobarem davant d’un cas d’inhibició no competitiva. Un exemple bioquímic d’inhibició competitiva és el cas de la succinat DH del cicle de Krebs. Aquest enzim transforma el succinat en fumarat. Sabem que el malonat és reconegut per el centre actiu d’aquest enzim, i quan aquest es troba per sobre d’una concentració determinada el bloqueja. Hi ha competència entre el malonat i el succinat per interaccionar amb el CA.
En aquest cas, l’estructura de l’inhibidor s’assembla molt a la del substrat, però això no és necessari perquè “enganyi “ al centre actiu.
6.3.1.1 Inhibició competitiva La inhibició competitiva és aquell procés que fan els inhibidors que només poden unir-se a enzim lliure; aleshores les molècules d’inhibidor competeixen amb el substrat per unir-se al centre actiu de l’enzim. La força d’interacció d’un inhibidor ve determinada per la constant d’inhibició Ki. És la constant de dissociació del complex EI cap a E+I. Això ens porta a que com més petit és el valor de Ki més gran és l’afinitat. La constant d’inhibició la podem expressar en termes de concentració o en termes de constants de velocitat.
La velocitat depèn de la Ki de formació del complex multiplicat per la concentració d’enzim. Llavors la velocitat de dissociació serà En l’equilibri les dues velocitats s’igualen.
La inhibició competitiva ens diu que l’enzim s’uneix a S o a I. Això a nivell conceptual ens porta a que l’efecte de la inhibició és el resultat de l’equilibri entre la concentració de I i la de S. Si la concentració de I és gran hi haurà més tendència a que ocupi enzim i no deixi lloc al substrat. Si, per contra, tenim una concentració molt alta de substrat, aquest desplaçarà l’inhibidor. Un inhibidor competitiu no afecta a la velocitat màxima de la reacció, perquè a altes concentracions de substrat puc arribar a aquest valor.
Per deduïr l’equació de la velocitat de la reacció, utilitzem les premisses de l’estat estacionari de BriggsHaldane.
1 Apliquem l’equació de conservació de la matèria, tenint en compte en que la concentració total d’enzim també intervé el complex enzim-inhibidor.
2 Apliquem aquest terme a l’equació de l’estat estacionari i fem les mateixes transformacions que hem fet per Briggs-Haldane.
3 Substituïm 4 i obtenim 5 Substitueixo amb els termes de l’equació de conservació de la matèria .
6 Transformacions matemàtiques fins que arribo a una expressió de la concentració d’enzim lliure en termes de concentració d’enzim total, concentració d’inhibidor i concentració de substrat.
7 Substitueixo aquesta expressió a la de concentració de complex enzim-substrat.
→ 8 Reordeno i arribo a l’equació d’una hipèrbole però que introdueix l’efecte de la concentració d’inhibidor sobre la velocitat de la reacció.
9 Anomenem alfa al terme que està multiplicant la Km 10 Multiplicar la Km per alfa ens modifica el seu valor, que anomenem Km aparent. Aquesta sempre serà superior a la Km. El significat d’això és que l’afinitat de l’enzim pel substrat serà menor en presència de l’inhibidor.
Podem aplicar la linealització de Lineweaver-Burk a la hipèrbole de la fórmula que hem deduït, de la mateixa manera que ho vam fer amb l’equació de Micaelis-Menten. Obtenim una recta i veiem que té el punt de tall en l’eix d’ordenades en el mateix lloc que la equació linealitzada de Micaelis. Sabem que aquest valor es correspon a la inversa de la velocitat màxima de la reacció. En relació a la intersecció amb l’eix d’abscisses tenim que ens dóna el valor de la inversa negativa de la Km. El valor de la nostra recta és més propera a 0 que la de Micaelis: la Km és més gran i per tant l’afinitat més baixa. Km aparent depèn directament de la concentració d’inhibidor que tinc a l’assaig. A diferents concentracions d’inhibidor, tenim un perfil de gràfiques de lineweaverburk com el de la imatge. El pendent és la Km/vmàx: com més concentració d’inhibidor més gran serà la Km i per tant més pendent tindrà la recta.
Però l’aproximació lineal que hem fet estem calculant tota la inhibició a partir d’una sola concentració d’inhibidor, la qual cosa és poc precisa. Altres formes ens permeten analitzar les dades a diferents concentracions d’inhibidor. Els experiments que s’utilitzen consisteixen en, utilitzant diferents concentracions de substrat, veure l’efecte d’una concentració determinada d’inhibidor. Amb cada experiment obtindré un valor de Km aparent diferent. Amb els valors de I i Km aparent faig una recta. En el punt de tall amb l’eix d’abscisses la concentració d’inhibidor correspon a –Ki.
Mètode de Dixon. A partir de les rectes que he obtingut faig una gràfica secundària. Represento, per a diferents concentracions d’inhibidor, com afecta la velocitat a diferents concentracions de substrat, que anomeno S1 i S2. Quan hi hagi inhibició competitiva les dues rectes es creuaran.
...