Tema 6 (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Virologia
Año del apunte 2014
Páginas 18
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 55
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Tema 6. ORÍGEN I EVOLUCIÓ DELS VIRUS VARIABILITAT DELS VIRUS Al llarg del temps s’ha observat que canvien les característiques genètiques i fenotípiques dels virus. Una població d’individus d’un cert grau de variabilitat genètica amb un procés de selecció el que fan és impedir la multiplicació de la gran part dels individus de la població i alhora permet la multiplicació d’un cert grup o subgrup d’aquesta població.
Aquest és el fet més simple per imaginar una determinada evolució.
Fonts de variabilitat genètica La variabilitat genètica en virus pot provenir de tres fonts diferents:  Recombinació: la recombinació entre diferents genomes vírics es produeix quan aquests infecten una mateixa cèl·lula i a més, presenten una certa homologia, el que permet la formació de genomes híbrids o recombinants.
Aquest és un mecanisme que es produeix tant en virus de DNA com de RNA.
 Redistribució: aquest mecanisme només és aplicable a virus amb un genoma segmentat (com el virus de la grip) on sabem que en una infecció mixta (produïa per dos virus diferents) els fragments dels genomes s’organitzen de forma aleatòria i es poden produir encapsidacions anòmales de partícules víriques amb genomes híbrids. Aquest mecanisme és el responsable de l’antigènic shift en el virus de la grip.
 Mutació: entenem per mutació als errors que es generen en el procés de còpia dels genomes dintre d’una cèl·lula infectada, és a dir, a la substitució de nucleòtids puntuals per uns altres durant la replicació. Aquest és un mecanisme que es dona sobretot en virus de RNA.
La reorganització és estadísticament més factible que al recombinació, fins i tot els virus de RNA que no integren el seu genoma en la cèl·lula poden experimentar recombinació.
Aquesta recombinació es dóna amb un número tant elevat d’ocasions degut a la poca processivitat de les RNA – Poly víriques, que es desenganxen molt fàcilment del RNA, de manera que si la desunió es produeix quan està copiant el procés continuarà des d’una altra molècula de RNA, el que genera una recombinació.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Procés de selecció Observem en el següent gràfic com es confronta la càrrega vírica, que la entenem com la quantitat de partícules víriques que hi ha en el cos d’un individu infectat per un virus (en aquest VIH) enfront el temps. Així doncs, és tracta d’un exemple del virus del HIV en que la càrrega vírica és expressada com el número de còpies del genoma víric/ml de sang (hem de tenir present que aquesta es pot expressar en altres valors).
Quan a un individu afectat pel VIH se li administra un fàrmac antivíric (només 1 i no una barreja) la càrrega vírica acostuma a baixar si el fàrmac fa el seu efecte, com per exemple si és un inhibidor de la transcriptasa inversa o de la proteasa, de manera que la càrrega vírica disminueix ja que el fàrmac impedeix la multiplicació. Normalment, en un cer temps, aquesta càrrega vírica es recupera, torna al seu nivell original. Aquest aspecte és així perquè el fàrmac impedeix la replicació dels virus salvatges però permet la replicació d’aquells mutants que tenen canvis dins la diana del fàrmac, de manera que aquests, que no són sensibles al fàrmac, segueixen sent replicant-se. Així doncs, el fàrmac no indueix a l’adaptació del virus sinó que selecciona una subpoblació de genomes vírics que fenotípicament són capaços de multiplicar en presència del fàrmac.
Aquest és un exemple (observar al gràfic) molt senzill que il·lustra el funcionament de la variació del virus ja que a l’inici quasi tota la població és sensible mentre que al final trobem una nova població resistent. El fàrmac antivíric està creant un coll d’ampolla (terme microbiològic) en que es genera una pressió selectiva de manera que no tots els individus de la població poden passar aquesta pressió. Hem de tenir present que en la població original de virus ja existeixen aquells resistents, tot i que no s’administrés el fàrmac, és a dir, el fàrmac no provoca la seva aparició.
Els mutants esmentats anteriorment no existirien si tinguéssim una variabilitat genètica baixa, si tinguéssim un tamany de la població del virus baix (pocs individus) o bé que fessin falta un gran nombre de mutacions per escapar del fàrmac. Si, per contra, la variabilitat és alta, el tamany de la població és alt i el nombre de mutacions per escapar del fàrmac és baix, sigui quin sigui el fàrmac aquest mutant existirà en la població (amb un gran conjunt de mutants) 2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Factors que determinen l’evolució vírica Estudiarem els factors que determinen la capacitat del virus de tenir en la seva població un repertori de mutants prou elevat com perquè puguin escapar d’una pressió selectiva com la que genera un fàrmac.
Freqüència de mutació En quant a la freqüència de mutació en la replicació d’un genoma víric sabem que com més elevada sigui aquesta més variabilitat genètica hi haurà en la població.
Sabem que el VIH és un virus amb una alta tassa de mutació que depèn o que ve donada d’una retrotranscriptasa que no té el mecanisme de connexió de còpia com la que tenen les replicases de DNA. Sabem que les replicases de DNA presenten un sistema de correcció per l’activitat endonucleasa, fent que la freqüència de mutació de replicació del DNA sigui molt més baixa que en retrovirus o virus de RNA. Sabem, que la absència d’aquesta correcció provoca que la freqüència de mutació en aquest tipus de virus sigui extremadament alta.
En la següent taula observem les freqüències de mutació de virus -3 -4 de RNA, que generalment oscil·len entre valors de 10 i 10 de manera que, cada cop que la replicasa copia 10.0000 nucleòtids hi ha 1 que es col·loca incorrectament. Hem de tenir present que si durant la replicació hi ha un intermediari es produiran 2 mutacions per cada replicació, perquè el procés de la replicasa actua dues vegades. Aquests valors són mol més elevats que en virus de DNA, que la taxa de mutació es situa aproximadament a -8 10 .
Per concloure, també hem de tenir present que la longitud del genoma també condiciona la quantitat absoluta (no estadística) de mutacions que es poden produir en un genoma.
Quantes mutacions necessitem per provocar un canvi fenotípic en el virus? Generalment amb un nombre baix de mutacions (2/3 canvis) en la proteïna, com per exemple en el centre actiu de l’enzim ja són suficients per provocar que el virus guanyi o perdi virulència.
Hi ha pressions selectives que poden seleccionar mutants avantatjosos? Sí, constantment trobem que els virus estan exposats a pressions selectives que indueixen la prevalença dels mutants més adaptats, com per exemple el sistema immunitari de l’hoste.
És important tenir clar que els virus de DNA són menys adaptables als canvis que es provoquen en el seu entorn perquè són massa estables mentre que en el cas dels virus del RNA, si bé moltes mutacions poden ser deletèries (baixen la fitness relativa) i mortals, aquestes permeten alhora incorporar variabilitat, de manera que, si apareix una pressió electiva (com un fàrmac) les partícules víriques estan més preparades per sortir avantatjoses enfront aquest agent.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Tamany del genoma del virus Per una mateixa freqüència de mutació, sabem que com més gran sigui el virus més mutacions s’incorporaran. La major part dels virus de RNA tenen un tamany del seu genoma al voltant de 10.000 nucleòtids (els més grans són de 20.000 nucleòtids) mentre que els genomes de DNA són més grans (250.000-150.000 nucleòtids) ja que presenten més informació.
En els virus de RNA trobem aquells genomes de polaritat positiva, que són els capaços de infectar. Aquest es pot copiar per formar un intermediari, que es replicarà un altre cop i que serà de polaritat positiva i que serà encapsidat. En aquells genomes de polaritat positiva que abans de copiar-se passen a polaritat negativa hi ha un promig d’una mutació en cada replicació, de manera que, per passar de polaritat (+)(-) es genera una mutació i una altra per passar de polaritat (-)(+) perquè recordem que es tracta d’un virus de RNA de polaritat positiva i per tant, en la càpside s’ha d’incloure el genoma amb polaritat positiva, independentment del intermediari de replicació. Suposem que tenim un genoma amb 4 2·10 nucleòtids, aquest incorporarà de promig 4 mutacions respecte al parental.
Tamany de la població del virus El tamany de la població d’un virus és variable, però perquè tinguem algunes dades en el cas de l’hepatitis B estem parlant de 10 11 9 virus/població, mentre que en VIH és de 10 virus/població, de manera que observem, que la càrrega vírica durant una infecció és molt superior a la població humana sobre la terra.
El tamany de la població vírica sobre la qual s’aplica una pressió selectiva com l’administració d’un fàrmac és mol gran, ja que parlem d’un gran nombre 11 d’individus. De 10 individus, la probabilitat que 2 individus siguin genèticament iguals és molt aixa i per tant, essencialment tenim 10 11 individus genèticament diferents entre ells de manera que tenim, una gran quantitat de genomes vírics diferents durant la infecció. La probabilitat de trobar dos genomes vírics iguals és molt baixa, de manera que estem estudiant poblacions amb una variabilitat genètica molt alta.
El recanvi viral també és un aspecte molt important a considerar, en el vas del virus de l’hepatitis B es d’aproximadament el 50% mentre que el VIH és del 90%. La càrrega vírica es manté constant durant les fases asimptomàtiques de la infecció i cada dia, en el cas de l’hepatitis B la meitat dels virus són eliminats pel sistema immune i són recuperats com a conseqüència de la multiplicació vírica.
En aquests dos casos (hepatitis B i VIH) es genera una gran variabilitat genètica degut a la seva elevada freqüència de mutació, que sumat al seu recanvi permet que es fixin les poblacions resistents a la pressió que suposa el sistema immunitari. No obstant, hem de tenir present que aquest sistema també evoluciona de manera constant, és a dir, presenta una renovació.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Pressions selectives Les pressions selectives acostumen a estar presents gran part de temps i són les que ens permeten seleccionar aquells individus que són resistents a una determinada pressió, perquè són els únics capaços d’escapar del coll d’ampolla.
Impacte fenotípic L’impacte fenotípic són les mutacions que calen per escapar davant una pressió selectiva. Sabem que en el cas del VIH actualment es dóna un còctel de 3 fàrmacs dirigits cap a dianes diferents i específiques (un transcriptasa inversa, proteasa i una altre proteïna). Aquest còctel el que fa és disminuir la probabilitat estadística de que existeixi a la població del virus que infecta a l’individu un genoma víric resistent als 3 fàrmacs alhora de manera que, augmentem el nombre de mutacions necessàries per escapar d’un coll d’ampolla, el que provoca que baixi la possibilitat que el genoma víric estigui entre la població.
POBLACIÓ VÍRICA DES DEL PUNT DE VISTA GENÈTIC Si elaborem una experimentació, possiblement en una calba de lisi en una cambra de cultius cel·lulars podem tenir de 105 a 109 partícules víriques, que deriven la proliferació d’una única partícula vírica i per tant, d’un únic genoma víric.
Podríem considerar que aquesta és la població més homogènia que es pot concebre, no obstant això, tot i que estadísticament existeix la probabilitat que un genoma sigui igual al parental, aquest aspecte és poc probable de manera que, per molt homogènia que sigui mai no serà idèntica.
Mutacions neutrals Les mutacions neutrals són aquelles mutacions que no tenen un impacte fenotípic, en un genoma de DNA aquestes tenen sentit i generalment són neutrals mentre que es pensa que en un genoma de RNA les mutacions no són neutrals del tot.
Ara bé, en el genoma de virus de RNA que no afecti a la seqüència d’aminoàcids de la proteïna que codifica per un gen pot afectar a l’estructura secundària del RNA i tenir conseqüències en la càpside o replicació del virus, per això és difícil saber si es donen o no mutacions neutrals.
Mesura de la fintess Si assumim que no hi ha mutacions neutrals del tot, es pot determinar, per una espècie vírica en concret, si podria existir una seqüència genètica òptima de cara a l’eficiència biològica d’aquest virus. En termes de biologia evolutiva, l’eficàcia reproductiva (capacitat d’un virus de generar descendència productiva) és la fintess. En un entorn en concret que no varia, si no hi ha cap mutació neutral sabem que per mínima que sigui aquesta mutació canviarà la composició del virus de manera que, e virus no sempre donarà la màxima eficàcia en aquest entorn. Així doncs, sense mutacions neutrals, hi ha seqüències que són millors que altres respecte la capacitat de generar descendència.
La fintess és molt difícil de mesurar en virus, de quantificar des del punt de vista experimental. Podem entendre la fintess com el nombre de nous virions infectius que es produeixen per unitat de temps, i aquests, són molt difícils de determinar.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Des d’un punt de vista més abstracte es diu que aquesta seqüència que és òptima per un entorn concret té una fintess de 1, que és el màxim valor. Això vol dir, que si un genoma concret té fintess de 1 és que qualsevol mutant respecte aquest genoma víric tindrà una fintess més baixa, una mutació que no afecta quasi al genotip del virus però que rebaixa el valor de la seva fintess. Entenem que la fintess ens dóna informació sobre la capacitat de replicació també de manera que, en un genoma amb una mutació letal la seva fintess serà 0. Així doncs, dins d’una replicació vírica podem anar de 0-1 en els valors de la fintess, en que el 0 no permet generar descendència i 1 ens permet generar la màxima descendència (anomenada seqüència màster) Fintess i pressió selectiva Observem en la següent imatge que la població d’un virus té determinants genomes, situació (a), que si té una replicasa que mai no s’equivoca, tindrem que tots els genomes són idèntics. En la situació (b) en canvi trobem una població de virus que té una certa taxa d’error durant la seva replicació de manera que, tenim una variabilitat genètica alta i possiblement no hi ha cap genoma que sigui igual, és a dir, que serà estrany trobar dos genomes genèticament idèntics.
Imaginem que la seqüència de la situació (a) és l’òptima per la multiplicació dels virus en un entorn determinat. Si es produeix un canvi d’entorn la seqüència que abans era ideal (amb fintess 1) ara deixarà de ser-ho de manera que, presentarà una altra fintess.
Així doncs, el virus amb una fintess de 1 s’expandirà i colonitzarà a la perfecció, mentre que si tenim una freqüència de mutació x variable i una pressió selectiva trobarem que hi ha una seqüència que s’adapta millor a les condicions i per tant, les l’òptima per l’entorn, així doncs, qualsevol mutant respecte aquesta seqüència òptima inicia tindrà una fintess més baixa, hem de tenir present que tots els genomes fills no són tant bons com un genoma parental.
Segons la imatge, la eficàcia biològica és molt més elevada en la situació (a) que no pas en la (b).
Al realitzar un estudi és important saber que no totes les partícules víriques són capaces d’infectar, de manera que cal diferenciar entre el nombre total de partícules víriques i el nombre de partícules infectives. En que el quocient que ens interessa és de partícules infectives / partícules totals. En un virus de DNA és d’aproximadament de 1 mentre que en un -5 de RNA (com el TMV) és de 10 . Així doncs, els virus amb freqüència de mutació baixa tots els genomes són infectius mentre que en els de RNA, amb una freqüència més elevada no tots ho son. Així doncs, la població (b) sobreviu més al coll d’ampolla perquè segurament entre ells hi haurà un mutant que permeti la supervivència.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Suposem que podem regular la freqüència de mutació durant la replicació d’un virus i podem triar enter una mutació o una altra, sabem que a mesura que la freqüència de mutació puja es perd eficàcia biològica (situació a més eficaç que b) mentre que es guanya adaptabilitat (situació b sobreviu més a un coll d’ampolla que la situació a).
Mecanismes de pressió selectiva En la situació (b) sabem que el virus té una freqüència de mutació alta, de manera que, si apliquem una pressió selectiva i el mutant número té una sèrie de mutacions que li permeten passar el coll d’ampolla. Al administrar un fàrmac contra la població b sabem que s’innactivarà aquesta població, de manera que quedaran inhibides quasi totes les partícules víriques a excepció de la mutant 8, capaç d’escapar de la pressió selectiva. La fitness del genoma 8 en absència de fàrmac segurament seria amb un valor baix (perquè suposem que el fàrmac va dirigit contra la inhibició del centre actiu de la transcriptasa inversa, de manera que amb algues mutacions aquestes no funcionen molt bé i en condicions normals la replicació és difícil), però, amb el fàrmac en el medi, aquest és l’únic genoma capaç de multiplicar de manera, que esdevindrà el genoma amb fintess 1.
El genoma 8 formarà una altra població heterogènia, que a part de totes les mutacions que presentin noves, tenen aquelles que li permeten replicar-se en presència del fàrmac. Si nosaltres volem saber com és genèticament un virus que tenim en una població per exemple, per mitjà d’una mostra de sang necessitem d’un sequenciador de RNA, que ens permeti obtenir una seqüència de nucleòtids. La seqüència que obtenim és una seqüència consens, promig, de tota la població, és a dir, tenim la seqüència majoritària per cada posició del genoma víric, és aquella base que més es repeteix en tota la població. Així doncs, obtenir aquesta seqüència consens provoca una pèrdua de diversitat genòmica.
Seguint amb la imatge anterior, la seqüència consens de la situació (c) desprès de generar una nova població a partir del genoma 8 de la població (b) observem que es perd variabilitat entre les mostres, però que les seqüències consens de les situacions (b) i (c) no són les mateixes, de manera que, les mutacions que apareixen en la mostra (c) són mutacions fixades en el virus o en la població del virus ja que es fan majoritàries al llarg del temps.
Fenòmens fundacionals Podem entendre també la imatge anterior com mecanismes de pressió selectiva o bé fenòmens fundacionals, és a dir, que (b) és un individu infectat per un virus i que (c) s’infecta pel contagi amb (b). Hi ha algunes malalties que se sap que el contagi es dóna per un nombre molt baix de partícules víriques (en algun cas pot ser una única partícula). Imaginem que el genoma 8 és el genoma del virus que contagia a l’individu (c) de manera que hi ha una transmissió de b  c on les mutacions que presenta el genoma 8 són mutacions quasi neutrals, que afecten poc a la fintess de l’individu i per tant, aquest és viable (el genoma és viable) el que permet generar una nova població en l’individu (c).
Quan obtenim la seqüència consens de l’individu (c) veiem que s0han fixat per atzar, en aquest cas la fixació de les mutacions no es deu per atzar, els canvis no aporten cap avantatge fenotípic sinó que es troben per atzar en el virus que ha iniciat la infecció.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Conèixer la variabilitat interna Imaginem que d’una suspensió de partícules víriques volem conèixer la seva variabilitat interna, és a dir, com de diferents són els diferents genomes vírics que tenim en la mostra. El que volem saber són les seqüències individuals i com de diferents són entre elles Partim d’una suspensió de partícules víriques, que ens permetrà aïllar calbes individuals, extreure el RNA de cada calba per tal d’obtenir la seqüència consens d’una població petita. Seguint la imatge anterior, la seqüència consens de la calba (c) hauria de correspondre a la seqüència individual del genoma 8, de manera que aquest mètode el podem aplicar a totes les calbes aïllades que analitzem.
Hem de tenir present que en aquest tipus d’experimentació se’ns escaparien totes les seqüències mutants que tinguessin una fintess de 0 ja que no són viables i per tant, mai no donaran infecció.
ESPAI DE SEQÜÈNCIES Qualsevol població d’un virus RNA o DNA si és genèticament heterogènia, com podem definir la seqüència del genoma d’una espècie vírica? Cal tenir present que cada mostra té diferents seqüències consens i cadascuna és el promig de milions de seqüències que són diferents entre ells. Per poder determinar l’aspecte anterior cal que entenguem el concepte d’espai de seqüències.
Imaginem un virus de 10.000 nucleòtids, les poques seqüències per un genoma d’aquest tipus són totes les seqüències possibles que pot tenir un genoma d’aquesta longitud, així doncs, l’espai de seqüències queda definit com el conjunt de totes les seqüències possibles que pot tenir un genoma d’una determinada longitud.
Sabem que tenim 4 bases diferents i alternatives que poden ocupar cada posició del genoma del virus, de manera que tenim més de 4 5.000 seqüències diferents (no elevem a 10.000 perquè al fixar una seqüència, la contraria queda fixada), de manera que, de totes les seqüències, no tots els genomes tenen un sentit biològic sinó que la major part d’aquestes no codificaran per res i ni tant sols són viables. L’espai de seqüències s’utilitza molt per elaborar simulacions per computador i poder conèixer o simular l’evolució dels virus al llarg del temps i generalment s’utilitzen seqüències més simples a 10.000 nucleòtids.
Si observem l’esquema en la situació (a) és un hipotètic genoma de longitud 2 i per fer-ho més senzill en comptes de pensar que en cada posició tenim l’alternativa de 4 bases diferents, s’elabora amb 2 bases diferents, així doncs, podem utilitzar un sistema binari per determinar les possibles seqüències d’un genoma de 2 nucleòtids amb 2 bases alternatives a cada posició; 2 sabem que tenim 2 seqüències que són 00 01 10 11. En la situació (b) tenim una seqüència de 3 nucleòtids i seguiria el mateix esquema que anteriorment.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 El nombre de fletxes ens indica les mutacions que són necessàries per passar d’un genoma a un altre, de manera que per passar de 000 a 001 només necessitem 1 canvi, així doncs, l’espai de seqüències es dibuixa de tal manera que, com més juntes estan a l’espai dues seqüències més pròximes estan entre elles i més fàcil és passar d’una a l’altre.
L’espai de seqüències en el cas que el genoma sigui de longitud 2 nucleòtids és bidimensional (un pla) mentre que si és de 3 seqüències és tridimensional (cub) de tal manera que l’espai de seqüències té tantes dimensions com nucleòtids presenti el genoma en qüestió. Podem fer una projecció en un pla de seqüències simples, com en la situació (d) que es veu que com més propers estan dos gens entre ells més semblants són genèticament i per tant, més petita és la distància genètica que hi ha entre ells.
Una espècie vírica no es pot representar o definir per un punt únic, per una coordenada en l’espai de seqüències sinó que es defineix per una zona de l’espai en que s’engloba a un determinat nombre de seqüències (poden ser milions de seqüències), que són genèticament semblants entre elles. Els humans seguirien el mateix exemple, ja que no tots som idènticament semblants de manera que, es definirien per un conjunt de seqüències.
Així doncs, el VIH no ha aparegut sinó que en el conjunt de seqüències que el defineixen ja estaven en l’espai de seqüències, aquest espai ja el tenia en compte, independentment de si el virus està o no. El SIV està a prop en aquest espai de seqüències de manera que, el VIH apareix perquè el SID és capaç de colonitzar el nou espai de seqüències, així doncs, podem dir que apareix una nova espècie vírica quan un genoma víric entra en una nova zona de l’espai de seqüències que no estava ocupada en l’espai.
Hem de tenir clar que en l’espai de seqüències estant les seqüències dels virus coneguts com aquelles seqüències dels virus nous, els que poden aparèixer.
Concepte de quasiespècie Qualsevol espècie vírica no és una espècie en el sentit químic, no és una cosa definida sinó que són un conjunt de seqüències relacionades genèticament entre elles, que evolucionen o reben pressions selectives que provoquen l’evolució com un paquet de seqüències més que com un genoma individual. Així doncs, podem entendre una espècie vírica com un conjunt de seqüències que evolucionen alhora.
El terme de quasiespècie apareix al 1978 i no té res a veure amb taxonomia i es refereix que qualsevol població de genomes d’un virus de RNA o retrovirus està composat per una barreja molt heterogènia de genomes semblants entre ells. Aquesta heterogenicitat genètica li dona als virus RNA i retrovirus un potencial evolutiu que no presenten els virus de DNA.
Els virus de RNA són quasiespècies, però això no treu que no hi hagi espècies víriques; el terme de quasiespècie està referit que al analitzar una mostra de virus, sigui quina sigui la mostra, hem de tenir present que no tenim una espècie única sinó que tenim un conjunt d’espècies i totes elles en conjunt, donen una gamma d’oportunitats per escapar de pressions selectives (oportunitats que no presenten els virus de DNA).
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 SEQÜÈNCIA GENÒMICA DELS VIRUS DE RNA Una espècie d’un virus de RNA no es pot definir per a una única seqüència sinó que s’ha de definir per un conjunt de seqüències genètiques relacionades entre sí on totes elles formen l’espècie vírica.
Al 1978 es va publicar un article i es considera la primera referència de text científic en el qual es parla de la diversitat genètica dels virus de RNA i on s’introdueix el concepte de quasiespècie. En aquest assaig van analitzar la seqüència del fag Qβ per a E. Coli i van observar que es trobava en un equilibri dinàmic on hi ha mutants vírics que sorgeixen com a conseqüència de la elevada taxa d’error i que per una altra banda són fortament seleccionats per les pressions selectives i per tant, la població de virus de RNA és un conjunt, és a dir, un promig de seqüències. Cal tenir present que aquesta experimentació es va elaborar amb el fag qβ però les conclusions es poden aplicar a qualsevol virus de RNA. La estructura genètica dels virus es tan heterogènia que li dóna un ampli ventall en quant a seqüència i això és el que es coneix com a quasiespècie.
Els virus de RNA tenen espècies taxonòmiques com ara el virus de la polio, la grip... però el concepte de quasiespècie fa referència al fet que els virus de RNA no estan formats per una espècie genètica única sinó per una àmplia gamma de genomes molt semblants entre sí.
Per entendre-ho millor podem tractar l’espècie humana com una quasiespècie ja que no esta definida per un genoma únic ja que cada persona és genèticament diferent a les altres. Cal tenir present però, que únicament parlem de quasiespècie en els virus ja que la seva heterogeneïtat genètica és “especial”. Van haver de passar 8 milions d’anys per tal que els primats simis fessin un canvi en el 2% en la seqüència i esdevenir en humans; en canvi, calen només uns dies per tal que el virus de la polio canviï un 2%. Per tant, la heterogeneïtat genètica la trobem a totes les espècies però és més elevada en els virus de RNA ja que les mutacions es fixen més fàcilment. Un altre factor a tenir en compte és que les implicacions fenotípiques, en el cas dels virus, per un canvi en el genoma del 2% poden ser menors a les que trobem en altres espècies.
Als anys 70 va aparèixer una nova malaltia vírica en gossos, la parvovirosis. Aquesta és una malaltia important per la qual es vacuna i és deguda a un salt d’hoste d’un retrovirus que afectava als gats. El salt d’hoste va ser causat pel canvi en dos aminoàcids que trobem en la càpside del virus. Per tant, es va generar una nova espècie vírica estable que a més, era capaç de produir una malaltia en gossos amb uns efectes econòmics a nivell mundial.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 SIMULADORS PER COMPUTADORS Els simuladors per computadors són mètodes que han servit per entendre quin és el significat de quasiespècie i veure com aquest conjunt de mutants s’adapten a canvis de l’entorn. Cal tenir present que els estudis normalment no es fan amb genomes vírics naturals ja que seria un procés molt laboriós, per tant, amb aquest simuladors es generen genomes vírics senzills sobre els quals podem elaborar models d’evolució. Per exemple, podem veure com es mou la distribució de les diferents seqüències front una nova pressió selectiva, com podria ser una RNAasa.
A la imatge veiem una projecció en 2D d’un virus de RNA. Cada puntet del pla ens dóna la posició d’una seqüència completa i a l’eix d’ordenades es representa la proporció en tota la població de cadascun dels mutants o de les seqüències víriques que trobem a la població.
Observem que un genoma té una proporció superior a la resta i per tant podem suposar que aquest és més eficaç, és a dir, que té la fitness òptima en aquestes condicions.
Els valors de T són temps virtuals que fan servir a l’experiment. Si l’entorn no canvia, veiem un aspecte bastant semblant de la distribució dels virus, és a dir, trobem la proporció d’un genoma en particular més alta (fitness m és gran) i després altres que genomes al voltant que fluctuen (fitness més baixa). Si l’entorn canvia, és a dir, si s’aplica una pressió selectiva (RNAasa, augment de pressió, presència antivíric, presència hoste habitual...) el que passa és que el genoma amb una fitness més elevada es troba en un altre lloc de l’espai de seqüències. Així doncs, la població vírica s’adapta segons la pressió selectiva i el genoma amb una fitness més elevada es mou d’una zona de l’espai a una altra.
En aquest exemple en concret, es veu que a T = 700 s’aplica una pressió selectiva. En conseqüència, apareixen nous mutants vírics que en un principi no estaven i que generen una mena de població intermèdia que és inestable i que li permet al virus generar mutants que entrin a una zona òptima per aquestes noves condicions. Cal saber que tot i que la zona intermèdia sigui inestable conté genomes que són actius, és a dir, infectius.
Quan el virus s’ha adaptat al nou entorn i es troba a una altra part de l’espai de seqüències veiem que l’estructura que adopta la distribució és la mateixa: un genoma amb una fitness més elevada i un núvol de genomes amb fitness més baixes.
11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 HIV Aquest procés de moviment de poblacions víriques degut a una pressió selectiva ho hem vist en forma de model però cal saber que a la vida real hi ha exemples que ho demostren prou bé. Un d’aquests exemples és la infecció crònica pel virus de HIV.
Quan un ésser humà és infectat per HIV i no es tracta per fàrmacs antivírics, la càrrega vírica puja (aquest efecte el podem veure representat al gràfic). Després de la infecció hi ha una fase d’epidèmia curta, posteriorment baixa i manté uns nivells de càrrega vírica més o menys constants i que fa referència a la fase asimptomàtica de la malaltia.
Finalment hi ha una pujada irreversible de la càrrega vírica que coincideix amb una baixada irreversible dels limfòcits T (CD4+) A la fase asimptomàtica la càrrega vírica hem dit que es manté més o menys estable i això podria donar a entendre que es tracta d’una situació molt estable on el virus s’està multiplicant i no passa res. Realment, quan s’analitzen les seqüències consens d’aquesta fase asimptomàtica es veu que és de dinamisme extrem; la càrrega vírica baixa per la pressió que elabora la immunologia però hi ha alguns mutants vírics que són capaços de sobrepassar aquesta pressió (que observem com a pics). Per tant, aquesta fase es caracteritza per un dinamisme molt alt on el virus s’està desplaçant per l’espai de seqüències escapant a la pressió de la immunologia.
La immunodepressió és el que provoca que la càrrega vírica pugi. Els tractaments per aquest virus no cura la malaltia ja que el virus no es troba sempre en fase replicativa sinó que hi ha una acumulació de cèl·lules infectades pel virus que és insensible al tractament.
Les pressions selectives que actuen sobre el virus actuen quan el virus està multiplicant-se dintre del cos o bé durant la transmissió (radiació UV, pressió osmòtica, pH, temperatura...).
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 FREQÜÈNCIA DE MUTACIÓ I ADAPTABILITAT Si nosaltres poguéssim regular la freqüència de mutació d’un virus, pujant-la, podríem augmentar la seva adaptabilitat.
Aquesta idea és obvia ja que quan un compara la taxa de mutació d’un virus de RNA amb la d’un de DNA veu que és més gran en el cas del RNA i se sap que la seva adaptabilitat és més gran.
Cal tenir present que hi ha un punt en el qual no es pot pujar més la freqüència de mutació ja que l’adaptabilitat ha d’estar en equilibri amb l’eficàcia biològica. Així doncs, tenim dues opcions respecte aquest punt llindar: si estem per sobre del llindar el virus no serà viable; si estem molt per sota del llindar, no s’elaboraran les suficients mutacions com per poder viure a la pressió i per tant, el virus tampoc serà viable.
El llindar d’error fa referència a aquell punt en el qual si representem la fitness del virus respecte la mutació, la fitness baixa dràsticament ja que el virus no és capaç de mantenir la seva seqüència. Cal tenir present que a mesura que augmentem la taxa de mutació, la fitness va baixant lleugerament però l’adaptabilitat aguanta, és a dir, un factor es compensa amb l’altre fins que s’arriba al llindar d’error.
Experiment: Efecte de la ribavirina en poliovirus En aquest experiment es parteix d’un lisat de partícules víriques del qual s’extreu el RNA víric i es transfecta a un cultiu de cèl·lules susceptibles. Amb això obtenim cultius amb un nombre de calbes a partir de les quals, si elaborem recompte, obtindrem un valor representatiu de la fitness. Per una altra banda, si seqüenciem les seqüències consens dels clons i les comparem amb la del virus parental obtindrem la freqüència de mutació.
Els fàrmacs antivírics, com la ribavirina, tenen entre altres efectes l’augment de la freqüència de mutació durant la replicació del virus, és a dir, és una substància mutagènica pels virus. Per tant, nosaltres podem elaborar l’experiment, comptar calbes i mirar les seqüències consens, en presència i absència de ribavirina.
A l’esquema veiem la infectivitat del genoma víric en relació a les mutacions per genoma. El segon punt de la gràfica representa la transfecció feta per RNA víric en absència de ribavirina de manera que no hi ha mutacions extres.
Quan en una seqüència hi ha un promig de 2 mutacions per genoma es considera que el % del nombre de calbes que forma és del 100% (infectivitat màxima).
Els punts de la dreta de la gràfica fan referència a concentracions creixents de ribavirina. Per tant, veiem que un lleuger augment en la freqüència de mutació del virus, causat per dosis baixes de l’antivíric, fa baixar el nombre de calbes i en conseqüència, la fitness del virus. A mesura que la concentració augmenta, el nombre de calbes disminueix.
Aquest experiment ens demostra que els virus de RNA tenen una freqüència de mutació que es troba just en el llindar, és a dir, si aquesta augmenta una mica, la població vírica perd fitness de manera molt important. Podem concloure que els virus de RNA estan aprofitant al màxim la freqüència de mutació per tenir la màxima adaptabilitat i conservant una estabilitat genètica suficient com perquè el virus existeixi. La ribavirina actua com a força que empeny el virus més enllà del llindar d’error.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 A la gràfica veiem la distribució d’una població de virus de RNA que està replicant prop del llindar. El pic de la campana de Gauss està prop de les dues mutacions per genoma víric. Una proporció important dels genomes vírics són infectius però una altra petita part no ho son ja que tenen mutacions letals; aquesta fracció és suficientment petita com perquè el virus repliqui. Observem que si s’augmenta la freqüència de mutació hi ha un desplaçament cap a la dreta en l’eix de les X i en aquest cas, la major part de la població no és infectiva; pot quedar un petit romanent de partícules víriques que són infectives.
Un terme que s’usa molt en virologia evolutiva és la catàstrofe d’error que fa referència a l’extinció de l’efectivitat d’una població vírica degut a un augment, per sobre del llindar d’error, de la freqüència de mutació.
Experiment: patogenicitat de les quasiespècies Un exemple d’adaptabilitat és el salt d’hoste ja que el virus quan canvia d’hoste es troba en un entorn que no és el seu, no hi ha els teixits que acostuma a infectar i tot i això aconsegueix elaborar infecció. Moltes de les malalties víriques reemergents són virus de RNA ja que són els que millor adaptabilitat tenen.
Es va elaborar una experimentació que consisteix en mesurar el neurotropisme d’un mutant del virus de la polio. Sabem que aquest virus és entèric i que normalment replica a l’intestí però poden aparèixer mutants capaços d’infectar terminals nerviosos, viatjar de forma retrògrada al SNC i causar lesions. Aquesta neuroinvasivitat, mostren experimentalment que es perd en un mutant del virus que aïllen i que té una replicasa amb una fidelitat de còpia més elevada que la del virus salvatge. Per tant, un virus que guanya fidelitat en replicació, és a dir, perd freqüència de mutació, també perd la capacitat de ser neurotròpic.
Per tant, l’adaptabilitat que ha adquirit un virus per l’alt nombre de mutacions pot disminuir i concloure en una pèrdua de la capacitat adquirida. En el cas del virus de la polio, es perd la capacitat d’afectar el SNC.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 SEQÜÈNCIA CONSENS I COLLS D’AMPOLLA L’individu B està infectat per virus de RNA i aquest infecta a un individu C. L’individu A no presenta el virus. Quan nosaltres comparem les seqüències consens dels dos individus infectats veiem que canvien.
Imaginem que ens trobem en el començament d’un brot d’una malaltia vírica. Gràcies a això podem veure si la seqüència consens que s’obté al primer brot (temps = 0) coincideix amb les seqüències dels individus que van sent infectants. D’aquesta manera podem veure les mutacions d’una seqüència respecta l’altre.
FIXACIÓ DE LES MUTACIONS: EL RELLOTGE MOLECULAR Podem representar quin és el nombre de mutacions que es fixen en la població vírica respecte la primera seqüència consens al llarg del temps. Això ens permet veure com canvia el virus que circula en la població d’hostes durant un temps.
Al gràfic es representa això.
Normalment, en els brots d’una malaltia obtenim una representació gràfica on els punts s’ajusten bastant bé a una recta.
Per tant, podem dir que la fixació de mutacions de la seqüència consens té una evolució bastant lineal en els brots de la malaltia.
El pendent de la recta varia en funció del virus que s’estudia. En el fons, el pendent ens està donant una velocitat de fixació de mutacions i és el que normalment es dóna com a velocitat d’evolució d’un virus. Cal saber que aquesta velocitat es pot calcular per a un únic gen o bé pel genoma sencer del virus.
El fet que els núvols de punts d’aquesta velocitat d’evolució sigui més o menys constant, ens permet establir arbres filogenètics entre els virus. Normalment, s’elaboren arbres filogenètics entre espècies diferents gràcies a l’anàlisi del citocrom C ja que té una velocitat de mutació més o menys constant. Així doncs, aquestes relacions també es poden fer en els virus perquè com hem dit anteriorment, tot i que la velocitat de mutació sigui ràpida es manté constant.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Evolució en el virus de la grip El virus de la grip pateix canvis antigènics de dos tipus: antigènic shift i antigènic drift. L’últim és el resultat d’una deriva genètica en els gens estructurals i no estructurals que són deguts a mutacions que es donen i es fixen de manera progressiva en el temps.
El terme antigènic drift només s’utilitza pel virus de la grip però, cal tenir present que aquest fenomen es dóna en tots els virus.
Experiment evolució A meitats del segle XIX es va introduir a Austràlia una espècie de conills que no tenien depredadors de manera que es van reproduir fins el punt de causar una plaga i grans pèrdues econòmiques. Per tant, es trobaven en una situació descontrolada de proliferació de conills ja que per molt que matessin conills no aconseguien abaixar el cens.
El virus de la mixomatosi és un poxvirus i té una taxa de mortalitat per a aquest conill molt elevada, s’apropa al 100%. Per tant, van disseminar el virus per tal de reduir la població de conills. El primer any després de la introducció del virus, la mortalitat va ser del 99,88% però al segon any va baixar al 25% i als següents baixava cada cop més.
Si es fa una representació de la evolució de la població de l’hoste en el temps el que s’observa és que la taxa de resistència del conill puja. Podem dir que la baixada de la taxa de mortalitat ve donada per dos factors: 1.
La virulència del virus que circula és més baixa que la del virus original. Fins i tot, quan es posa en contacte amb conills que no havien estat en contacte, la infectivitat baixa.
2.
Els conills són més resistents al virus.
Així doncs, es produeix un fenomen de coevolució. Els descendents dels conills que són genèticament iguals als parentals donen una pujada en la població dels hostes.
Aquests resultats ens podien fer pensar si la virulència és una característica bona o dolenta pel virus, és a dir, si la selecció natural busca soques més o menys virulentes.
Cal tenir present que les taxes de mortalitat de tots els virus que salten de manera transitòria d’hoste són molt elevades.
Cada vegada que es dóna un salt d’hoste esdevé en una infecció molt agressiva. En canvi, si el virus està cooevolucionant amb el seu hoste, la infecció és menys virulenta (cas dels conills).
Per tant, com a idea general podem dir que la virulència és negativament seleccionada per la selecció natural. Aquest fet principalment dues causes: 1.
Si la virulència és molt gran, l’hoste pot morir en poc temps i per tant, redueix el període de transmissibilitat.
2.
Si té un impacte molt fort sobre l’hoste, aquest no es mourà geogràficament perquè no es troba bé i per tant, el virus no s’escampa tant.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Des d’un punt de vista evolutiu sembla que la poca virulència és un tret seleccionable per l’evolució. Però hem de tenir present que la virulència incrementada redueix la transmissibilitat de l’hoste i això no li afavoreix. Per tant, s’espera que els virus evolucionin de tal manera que siguin el màxim de transmissibles i el menys virulents possible.
Aquest fet no sempre es compleix, per exemple, trobem la verola que és un virus que porta multiplicant-se en l’espècie humana molt de temps i té un grau de virulència molt elevada, és a dir, una taxa de mortalitat molt gran. Així doncs, poden haver-hi casos de virus que funcionin molt bé inclús sent molt virulents. Es pot concloure que segurament, la virulència no és el que se selecciona negativament sinó que la transmissibilitat és seleccionada amb més tendència. Avui dia encara hi ha dubtes sobre aquest tema.
ORIGEN DELS VIRUS Hipòtesi progressiva o d’escapament Es creu que qualsevol espècie vírica que apareix, ho fa per evolució d’una altra espècie vírica o virus que ja han existit. Per exemple, el HiV prové del SiV o el parrovirus de gos prové del parrovirus de gat. Per una altra banda, es pot acceptar que quan l’espècie humana va aparèixer en el planeta, tots els tipus de virus que coneixem ja estaven aquí (virus DNA, RNA i retrovirus); per tant, tots els virus humans provenen de virus no humans.
Es pensa que els elements genètics com el RNA, plasmidis o retransposons, adquireixen una sèrie de capacitats per sortir físicament de la cèl·lula i elaborar part del seu cicle de replicació fora d’aquesta. Observem dos esquemes diferents: En el cas del retrotransposó l’hem d’entendre com un paquet de gens integrat a la cèl·lula que es transcriu, és a dir, es un mRNA que gràcies a una transcriptasa dona lloc a un DNA de doble cadena que s’integra en al cèl·lula novament.
El cicle del retrovirus és una mica més complex, la diferència fonamental és que hi ha la capsidació d’uns transcrits i la sortida de la cèl·lula es dóna per aquest punt. El cicle segueix a partir d’aquest punt, és a dir, quan l’agent entra en una nova cèl·lula. en aquest cas hi ha el guany d’una sèrie de propietats o característiques (proteïnes estructurals) que permeten que l’element genètic tingui una fase extracel·lular en el seu cicle de multiplicació. Un exemple és el epadnavirus.
Així doncs, podríem pensar que l’origen dels virus es situa a partir dels retrotransposons, plasmidis, retrovirus i mRNA.
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Virologia. T6 Hipòtesi regressiva Aquesta afirma que els virus podrien tenir l’origen en cèl·lules que a través d’un sistema de parasitisme estricte haurien perdut funcions. Encaixen en aquesta descripció aquells virus de DNA que són molt grans com la família poxiviridae o la família giant virus. Hi ha dues raons principalment per les qual encaixen en la hipòtesi:  Tenen una complexitat molt més gran del que els hi fa falta per ser un virus, com per exemple el mimivirus conté un repertori de gens associats a la traducció que no són necessaris i que podrien ser remanents d’un sistema de traducció original, restes d’informació genètica d’una cèl·lula.
 La partícula vírica en molts casos és molt complexa, té una doble envolta a la superfície del virió, que rodeja la zona nuclear i estructuralment no recorda a cap altre virus.
Hipòtesi del virus – first Amb aquest títol hauríem de pensar que aquesta hipòtesi proposa que els virus apareixen primer que els hostes però això no té sentit perquè tots els virus que coneixem són paràsits intracel·lular estrictes i per tant, no poden aparèixer si no tenen a ningú a qui parasitar.
Així doncs aquesta hipòtesi proposa que l’origen de la vida i la informació genètica podria estar més lligada al RNA que no pas al DNA perquè el RNA té una capacitat autoreplicativa, codificant i a diferència del DNA té una estructura secundària molt forta amb propietats catalítiques o enzimàtiques. De manera que, ens queda el DNA com a suport de la informació genètica perquè és una molècula molt més estable i que incorpora menys taxes de mutació.
La teoria afirma que d’alguna forma els virus actuals han coevolucionat amb els seus hostes des d’una manera de virosfera antiga (conjunt de molècules de RNA, DNA) que ja estaven presents a l’origen de la vida. A partir d’aquesta virosfera es van anar separant els tres regnes coneguts (bacteris, eucariotes i procariotes) i d’alguna manera també es van separar els precursors dels virus capaços d’infectar a cada regne. Així doncs, la hipòtesi afirma que en les primeres proves de la vida i al diferenciar-se els regnes ja existien els virus que els poden infectar, al voltant de cada regne.
D’aquesta manera, s’entén que els virus sempre han estat amb els seus hostes, que des que apareixen les cèl·lules també apareixen aquells organismes capaces d’infectar-les. Hem d’entendre la hipòtesi plantejada de manera que els virus apareixen com acompanyants des dels inicis cel·lulars.
18 ...