T.4, Mètodes d’estudi de les cèl·lules (I) (2013)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2013
Páginas 45
Fecha de subida 30/03/2015 (Actualizado: 30/03/2015)
Descargas 8
Subido por

Vista previa del texto

T. 4 Mètodes d’estudi de les cèl·lules (I) MICROSCÒPIA ÒPTICA INTRODUCCIÓ HISTÒRICA A L’ESTUDI DE LES CÈL·LULES Degut al petit tamany es necessiten tecnologies noves i instruments per al seu estudi.
El objectiu es descobrir les formes en que s’utilitzen les diverses tècniques i presentar exemples dels tipus d’informació que es poden obtenir mitjançant aquestes tècniques.
Microscopi: aparell d’augment que ens permeta veure allò que a simple vista no podem veure.
 ROBERT HOOKE (1665) - MICROSCOPI COMPOST (CÈL·LULES DEL SURO=CÈL·LULA) El 1665, Robert Hooke, al observar al microscopi, molt rudimentari en aquella època, un fragment de suro, descobreix que està composat per una sèrie d’estructures semblants a les cel·les dels panells de les abelles, per el que les va anomenar cèl·lules.
En 1966 publicà el llibre Micrographía, el relat de 50 observacions microscòpiques i telescòpiques amb detallats dibuixos.
Aquest llibre conté per primera vegada la paraula cèl·lula i en ell s’apunta una explicació plausible sobre els fòssils.
 ANTON VAN LEEUWENHOEK (1674) - MICROSCOPI SIMPLE (LUPA) Mentres desenvolupava el seu treball com comerciant de teles, va construir per a la observació de la qualitat de les teles LUPAS de millor qualitat que les que es podien aconseguir en aquell moment, després d’aprendre pel seu compte bufat i poliment de vidre.
Va fixar petites LENTS biconvexes muntant-les sobre platines de llautó com les ulleres actuals.
Va desenvolupar estructures en les quals es podien fixar tant la lent com l'objecte a observar.
Té dos lents: per on mirem i la que enfoca la mostra El més potent dels seus instruments conservats avui en dia té una taxa d'ampliació de 275 vegades i un poder de resolució de 1,4 micres.
No va deixar cap indicació sobre els seus mètodes de fabricació de les lents, i va haver d'esperar diverses dècades per disposar de nou d'aparells tan potents.
S'ignora com il·luminava els objectes observats i la seva potència.
Va construir instruments amb dos i amb tres lents.
Va ser probablement la primera persona a observar bacteris i microorganismes.
 – – MATHIAS SCHLEIDEN & THEODOR SCHWANN (1839) TEORIA CEL·LULAR: Tots els organismes estan compostos per cèl·lules La cèl·lula és la unitat estructural de la vida  – RUDOLF VIRCHOW (1855) COMPLETA LA TEORIA CEL·LULAR: Les cèl·lules només poden originar-se per divisió d’una cèl·lula preexistent Molts dels principis de microscòpia que s’establiren anys enrere s’han mantingut impertèrrits fins avui dia. Però la microscòpia òptica prompte es quedà curta i l’avenç tecnològic possibilità l’aparició de la microscòpia electrònica.
El microscopi ha servit per diferenciar la morfologia cel·lular (la forma d’una cèl·lula està adaptada a la seva funció).
CONCEPTES BÀSICS Resolució: és la capacitat de discriminar com entitats diferents dos punts molt junts.
Quanta més resolució, més capacitat per a distingir.
Límit de resolució (LR): mínima distància a la qual dos punts separats s'observen com unitats independents.
Com mes petit sigui millor, perquè voldrà dir que estic veien estructures que entre elles hi ha una distancia molt petita.
(Longitud d’ona) (Apertura numérica) Llum convencional: llum UV: LR= 0,2 µm LR= 0,1µm λ=500nm λ< 500nm Augment o magnificació: incrementa el diàmetre de les estructures. És la resolució existent entre la grandària real de l’objecte i la imatge produïda pel microscopi.
𝑴𝒆𝒔𝒖𝒓𝒂 𝒅𝒆 𝒍′ 𝒐𝒃𝒋𝒆𝒄𝒕𝒆 𝒆𝒏 𝒍𝒂 𝒇𝒐𝒕𝒐 𝑴𝒂𝒈𝒏𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂𝒄𝒊ó = 𝑴𝒆𝒔𝒖𝒓𝒂 𝒓𝒆𝒂𝒍 𝒅𝒆 𝒍′𝒐𝒃𝒋𝒆𝒄𝒕𝒆 Augment o magnificació útil: màxim augment d’un instrument òptic.
𝑴𝒂𝒈𝒏𝒊𝒇𝒊𝒄𝒂𝒄𝒊ó = 𝑷𝒐𝒅𝒆𝒓 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó 𝒅𝒆 𝒍′ 𝒖𝒍𝒍 𝒉𝒖𝒎à 𝑷𝒐𝒅𝒆𝒓 𝒅𝒆 𝒓𝒆𝒔𝒐𝒍𝒖𝒄𝒊ó 𝒅𝒆𝒍 𝒔𝒊𝒔𝒕𝒆𝒎𝒂 𝒅𝒆 𝒍𝒆𝒏𝒕𝒔 Augment total del microscopi: es pot calcular multiplicant els augments que indica l’ocular pels dels objectius de major augment i de major grandària del microscopi.
Augment total = A.Ocular · A.Màx. Obj.
Magnificació enfront a resolució: a) La transició de (a) a (b) proporciona al observador una major magnificació i resolució.
La transició de (b) a (c) només produeix una major magnificació (magnificació buida).
La qualitat de la imatge es deteriora conforme la magnificació buida augmenta.
Obertura numèrica: la llum s’enfoca en la mostra mitjançant la lent condensadora i es recull en la lent del objectiu del microscopi. L’obertura numèrica està determinada per l’angle del con de la llum que entra en l’objectiu de la lent (α) i per l’índex de refracció del medi (n) [aigua o oli] entre la lent i la mostra.
Expressa el diàmetre del feix lluminós que pot recollir l'objectiu (n • senα).
1,515 Diàmetre de la part de la preparació que se està veient en cada moment 76x26mm ESTRUCTURA DE LA LUPA BINOCULAR PART MECÀNICA I PART ÒPTICA molt semblants a les del microscopi. Més simple, però amb la mateixa forma de funcionar.
Els augments que tenen les lupes amb les que treballareu són:  Objectius: 2x i 4x  Oculars: 10x Els avantatges de la lupa binocular sobre el microscopi òptic són, principalment, que no es necessita una manipulació prèvia de la mostra i que el gruix d’aquesta no és un factor limitant.
Camp brillant: el con de llum es veu com un fons brillant contra el qual la imatge de l'espècimen cal contrastar.
Ideal per a mostres d'alt contrast.
Estereoscòpic: s'utilitza per oferir una imatge estereoscòpica (3D) de la mostra. Aquest tipus de microscopis permet que la distància entre la mostra i l'objectiu pugui anar des d'un parell de centímetres a desenes d'ells. → S’utilitza en cirurgia Ideal per observar objectes de grandàries relativament grans, de manera que no és necessari processar les mostres ni tampoc que la llum passi a través seu.
Invertit: són aquells en què el cos, objectiu i ocular es troben localitzats sota la platina, mentre que l'espècimen és il·luminat des de dalt.
Ideal per observar organismes o teixits en cultiu sense una preparació prèvia.
Camp fosc: és un microscopi òptic el sistema condensador ha estat modificat per dirigir la llum a la preparació des dels costats, de manera que només la llum difractada per la preparació passa a l'ocular i es fa visible. A causa d'aquesta disposició, la mostra en el preparat apareix il·luminada sobre un fons fosc.
Ideal per a l'observació en estat viu de partícules i cèl·lules que d'altra manera estarien per sota dels límits de resolució del microscopi òptic.
Contracti de fases: Converteix les diferències d'índex de refracció en diferències d'intensitat, brillantor i foscor, que són visibles a l'ull humà.
Ideal per a observació de mostres vives.
Contracti d'interferència diferencial: permet obtenir informació sobre la densitat òptica de la mostra i observar detalls que d'ordinari són invisibles. Els objectes es veuen foscos o clars en un fons gris, de manera semblant a les imatges del microscopi de contrast de fases, però sense halos de difracció. Dóna com a resultat una imatge de l'espècimen en 3D o relleus que corresponen a les variacions de la densitat òptica de la mostra amb èmfasi en línies i vores, com si la cèl·lula projectés ombres cap a un costat.
Ideal per a l'estudi de cèl·lules vives, no acolorides, espècimens una mica gruixuts que no permeten l'ús de contrast de fases i per a tractaments de fertilització in-vitro.
Microscopi de llum ultraviolada: utilitza com radiació la llum ultraviolada que, en tenir una longitud d'ona menor que la llum visible, proporciona un poder de resolució de fins a 0,1 micròmetres. Precisa lents de quars i la il·luminació per llums de mercuri. La mostra no es pot observar directament a través de l'ocular perquè la llum ultraviolada pot danyar la retina. La imatge es mostra amb fosforescència, en fotografia o amb un escàner electrònic. Ideal per detectar àcids nucleics, o proteïnes que contenen determinats aminoàcids. Mitjançant longituds d'ones específiques per a la il·luminació es pot obtenir mesuraments espectrofotomètriques per quantificar el DNA i el RNA de cada cèl·lula.
Fluorescència: permet observar la localització de determinats compostos (fluorocroms o fluoròfors) que absorbeixen radiació UV invisible i emeten porcions d'energia en longituds d'ona visibles i més llargues (fenomen que es coneix com fluorescència). Ideal per marcatge de molècules i teixits per a la seva caracterització i identificació.
Microscopi confocal: microscopi òptic que incorpora dues diafragmes: un diafragma d'il·luminació, generalment de mida invariable i localitzat després de la font lluminosa, i un diafragma de detecció, de mida variable situat davant del fotodetector. La utilitat d'aquest diafragma de detecció és eliminar la llum provinent de plans superiors i inferiors al pla focal, augmentant amb això la claredat i resolució de la imatge. Produeix una imatge d'un pla prim situat dins d'un espècimen molt més gruixut.
Ideal per seguir processos dinàmics i capturar la seqüències d'imatges en vídeo en cèl·lules vives.
Observació d’imatges en els diferents microscòpics Micrografies òptiques d'un protist ciliat tal com s'observa en un camp brillant (a), amb contrast de fase (b) i amb òptica de contrast per interferència diferencial (c).
Microscopi de fluorescència Ús de variants de GFP per seguir les interaccions dinàmiques entre neurones i les seves cèl·lules blanc in vivo (a) Porció de cervell d'un ratolí amb dos neurones fluorescents de colors diferents. Els ratolins s'obtenen mitjançant l'aparellament d'animals transgènics les neurones es marquen amb una o altra proteïna fluorescent.
(b) Micrografia amb fluorescència de porcions de dues neurones, una marcada amb YFP i una altra marcada amb CFP.
MICROSCOPI ÒPTIC Parts del microscopi L’objectiu 60X no és habitual, però la AN està molt propera a la unitat. Això s’aconsegueix fent objectius llargs i formats per 20 lents com a mínim Objectiu 100X, és l’únic on s’utilitza l’oli d’immersió ESTRUCTURA DEL MICROSCOPI ÒPTIC PART MECÀNICA Peu: sobre el que descansa el microscopi. Acostuma a portar una llum incorporada de baix voltatge, que pot ser fixa o variable. En els microscopis més senzills existeix un mirall mòbil que s’orienta cap a la llum fins aconseguir que la preparació quedi il·luminada. Aquest mirall té dues cares. Una cara plana que s’utilitza quan la llum és la d’una llum (llàntia) propera i una cara còncava per la llum neutral.
Platina: superfície on es col·loca la preparació. Per fixar-la s’utilitzen unes pinces. En alguns casos la platina porta incorporat un “carro mòbil” que ens permet desplaçar la preparació en els dos eixos de coordenades. Normalment conté una escala per conèixer quina part de la preparació s’està observant.
Tub ocular: es troba dins de l’ocular i el revòlver portaobjectius. Pot tenir longitud variable i aquesta pot aparèixer gravada a nivell de les anotacions de l’objectiu. La longitud més utilitzada és de 170mm. Constitueix el suport dels oculars i objectius.
Revòlver portaobjectius: dispositiu al que, per un sistema de rosca van adossats els diferents objectius. Si està ben construït proporciona parafocalitat (els objectius tenen tots la mateixa distància des de la rosca fins la mostra, de manera que al passar d’un a l’altre, no toquen la platina i la imatge està pràcticament enfocada, si ho estava amb el primer objectiu utilitzat).
Cargol macromètric i micromètric: s’utilitzen per enfocar la preparació. El macromètric serveix per realitzar el primer enfocament i el micromètric per acabar de corregir-lo.
Cargol macromètric: serveix per obtenir un primer enfocament a l’utilitzar-se l’objectiu de menor augment. Desplaça la platina verticalment de forma perceptible. Cargol micromètric: serveix per obtenir un enfocament precís de la mostra un cop s’ha realitzat l’enfocament primari amb el macromètric. També desplaça verticalment la platina però pràcticament de forma imperceptible. És l’únic cargol d’enfocament que s’utilitzarà en canviar a objectius de major augment un cop realitzat el primer enfocament.
PART ÒPTICA Ocular: sistema de lents situat a l’extrem superior del tub ocular. La senyal gravada, per exemple a 10x, indica l’augment de l’ocular. Aquesta dada multiplicada per l’augment de l’objectiu amb el que s’està treballant, ens indica l’augment amb el que estem observant la mostra. Depenent de si hi ha un o dos oculars, els microscopis són mono- o binoculars, respectivament.
Objectius: estan formats per un sistema de lents, el seu nombre varia depenent de l’augment i de la qualitat de l’objectiu. Els seus augments varien des de 3.2x (panoràmica), 10x, 25x, 40x, a 90x o a 100x (immersió). La utilització d’aquest últim comporta l’addició d’un oli especial (oli d’immersió) sobre la preparació. L’oli d’immersió té un índex de refracció semblant al del cristall, que fa que el nombre de raigs refractats per la mostra que penetren a l’objectiu sigui major, per tant, ens ofereix una major obertura numèrica i en conseqüència un major poder de resolució. Els objectius de 90 i 100x porten una indicació característica que correspon a la presència d’un cercle negre o l’anotació oil. L’objectiu proporciona una imatge real, invertida i ampliada de la preparació que observem. L’ocular actua com un microscopi simple (lupa) que rep la imatge de l’objectiu projectada entre el focus principal i la lent superior. El resultat que s’obté de l’acció dels dos és una imatge real, invertida i amplificada de l'objecte. En microcirurgia es treballa amb microscopis estereoscòpics formant la imatge per reflexió i evitant que aquesta s’invertisca (el límit de resolució és escàs).
Condensador: sistema de lents que concentra la llum sobre la preparació. Pot ser fixa o mòbil. En cas de ser mòbil, per augments petits, la posició ha de ser generalment baixa, però a majors augments ha d’apropar-se a la preparació, degut a la necessitat d’obtenir més llum.
El sistema d’il·luminació consta d’una font lluminosa, els seus raigs són concentrats i dirigits pel condensador cap a la preparació. La quantitat de llum que arriba es regula obrint i tancant el diafragma i pujant o baixant el condensador, en el cas que aquest sigui mòbil.
Diafragma o iris : sistema de làmines plegables que regula, amb el seu tancament o la seva obertura, la quantitat de llum que arriba a la preparació.
Transformador: ja que el voltatge de la bombeta és menor al de la xarxa elèctrica, és necessari subministrar el voltatge adequat. Alguns microscopis el porten incorporats al peu. A més a més, el transformador té un potenciòmetre per regular la intensitat de la llum.
L’augment és la resolució existent entre la grandària real de l’objecte i la imatge produïda pel microscopi. L’augment total del microscopi es pot calcular multiplicant els augments que indica l’ocular pel dels objectius de major augment i de major grandària del microscopi.
Formació de la imatge  Dos conjunts de rajos entren en el objectiu: 1. - Els que no modifica l'espècimen que correspon a la llum que prové del condensador que passa de manera directa a la lent de l'objectiu i constitueix la llum de fons.
2. - Els que altera l'espècimen i que la lent de l'objectiu enfoca per formar una imatge real i magnificada de l'objecte   Els raigs de llum de la mostra (2) s'enfoquen a la retina, mentre que els raigs del fons (1) estan fora de focus, de manera que es produeix un camp brillant difús.
El PR d'una lent d'objectiu és proporcional al sinus de α. Les lents amb major poder de resolució tenen longituds focals més curtes, el que significa que la mostra quan s'enfoca se situa més a prop de la lent d'objectiu.
L'objecte es col·loca a una distància de l'objectiu una mica més gran que la focal, produint-se la imatge real, invertida i amplificada entre l'ocular i el seu focus anterior. El ocular, que actua com una lupa observa aquesta imatge i produeix una altra, virtual, invertida i encara més ampliada.
Limitacions de les mostres biològiques per a la seva observació amb el microscopi òptic A) GRUIX: realització de talls, (0,10 – 0,15 µm), després d’un previ tractat de la mostra.
Excepcions: Cèl·lules sanguínies Extensions bacterianes Frotis testicle/ovari, estudi de l’esperma (espermograma) Cultius cel·lulars Consisteix en analitzar aspectes físics del semen com: el volum, pH, aparença i consistència; aspectes cel·lulars de l'espermatozoide en relació amb el nombre, mobilitat i morfologia, i la presència d'altres cèl·lules com leucòcits o eritròcits.
B) CONTRAST: Observació amb microscopis òptics especials que juguen amb la llum per colorar la mostra.
Tincions amb colorants vitals (preparacions temporals): → Per a cèl·lules vives Ex. Blau de Metilè, Vermell neutre, Verd Janus...
Tincions amb diferents colorants (preparacions permanents): Ex: Hematoxilina-Eosina… Tinció Hematoxilina-Eosina Quan es tenyeix una cèl·lula el nucli queda lila per la hematoxilina, i la resta com a mes rosa per la eosina.
La naturalesa de l’hematoxilina és bàsic i tenyeix el nucli ja que és àcid, i la de la eosina és àcida que tenyeix el citoplasma que és bàsic.
Extensió sanguínia: Fixador (alcohol) Colorant àcid Colorant bàsic Els eritròcits no tenen nucli i quan es tenyeixen la zona del centre queda més clara a causa de la seva forma Per fer una mostra d'extensió bacteriana: En un portaobjectes s'escalfen una mica els bacteris.
Utilització de la tinció de Gram: els bacteris que admeten la tinció de Gram apareixen al microscopi de color violeta clar i s’anomenen grampositius. Els que no admeten la tinció de Gram apareixen al microscopi de color morat fosc i s’anomenen gramnegatius.
Tipus de mostres VIVES: preparacions temporals. Solament haurem de corregir la limitació del contrast, perquè seran cèl·lules individuals. Ex.: Control de cultius cel·lulars, estudi de l’esperma etc.
1. Muntatge simple Porta/Cobre.
2. Utilització de M.O. especials (més avant els veurem).
3. Contrast amb colorants vitals: blau de metilé, solució de Lugol, índigocarmí, blau d’ Evans, etc.
MORTES: preparacions permanents. Solen sorgir complicacions.
Cèl·lules aïllades: fixació, tinció, muntatge.
Òrgans (biòpsies): 1. FIXACIÓ: consisteix en l’estabilització dels components de principals de la mostra mitjançant substàncies químiques com el formol 6% o el sèrum fisiològic.
2. (Deshidratació) INCLUSIÓ: endurirem la mostra amb parafina, però abans deshidratarem la mostra perquè la parafina és hidròfoba. Per deshidratar-la la clavarem en diferents dissolucions alcohòliques, cada vegada més concentrades, per aprofitar l’efecte osmòtic dels medis hipertònics sense destruir la mostra.
3. MICROTOMIA = TALL 4. (Rehidratació) TINCIÓ. Eliminem la parafina per poder tenyir amb colorants aquosos (en una estufa, la parafina es dissol i l’alcohol es volatilitza).
Rehidratem la mostra introduint alcohol cada vegada menys concentrat, paulatinament, perquè la cèl·lula és sensible a canvis osmòtics, fins arribar a l’aigua. Realitzem la tinció.
5. (Deshidratació) i MUNTATGE. Tornem a deshidratar la mostra d’alcohol poc concentrat a alcohol pur per muntar el cobre. Entre el cobre i el porta clavarem una substància apegalosa amb un índex de refracció d’1,515 (igual que el cobre, l’oli d’immersió i el porta), amb l’objectiu de fixar el porta sense perdre qualitat de visió.
Importància de matar les cèl·lules en el moment just (metafase) en el cas de l’estudi de Cromosomes = Cariotip TÈCNIQUES DE PREPARACIÓ DE MOSTRES La parafina es hidròfoba i la mostra es hidròfila perquè té formol.
Es va canviant la concentració d’alcohol fins que s’arriba a l’absolut.
Per endurir el teixit MICROTOMIA Rehidratació: va al inrevés de la deshidratació Deshidratació.
Muntar amb el cubre (micròtom) Preparació d’un cariotip humà Si volem estudiar els cromosomes (cariotip) d’un determinat tipus de cèl·lules, és imprescindible fixar les cèl·lules en el moment de metafase, ja que és el millor moment per observar amb major qualitat i diferenciació els cromosomes.
Colchicina/Colquicina: atura la divisió cel·lular en la metafase, que es quan el DNA està condensat formant els cromosomes.
En els embrions per poder fer el cariotip s’extreu líquid amniòtic.
Hi ha les tècniques de bandeix que ha partir de la marcació de les bandes permet reconèixer millor cada cromosoma i emparellar-lo.
Actualment tot això està automatitzat Exemple: Cas de la trisomia 21 → Síndrome de Down Espermatozous de rata MICROSCÒPIA ELECTRÒNICA El primer microscopi electrònic fou el de transmissió i va ser desenvolupat entre 1931 i 1933 per Ernst Ruska i els seus col·laboradors. L'òptica bàsica d'aquell primer microscopi electrònic es manté fins als nostres dies; els únics canvis en els microscopis moderns consistixen a addicionar més lents per a incrementar l'àmbit d'augments i donar-los major versatilitat. El primer microscopi electrònic de transmissió comercial el va construir Siemens en 1939.
CARACTERÍSTIQUES GENERALES: Són instruments estructural i funcionalment més complexos.
Els microscopis electrònics utilitzen com a “font d’il·luminació” un feix d’electrons en comptes de rajos de llum visible. Amb aquestos microscopis s’aconsegueix una resolució normal per als objectes biològics d’uns 0,2 nm, o siga, unes 1000 vegades major a la resolució del microscopi òptic. Aquest fet ha permès descobrir la ultraestructura cel·lular.
El microscopi òptic tenia un límit de resolució determinat per (0.61 λ) /AN. El mateix ocorre amb els electrònics, amb una diferència important: aquestos utilitzen la longitud d’ona dels electrons, molt menor que la dels fotons "visibles", augmentant en gran mesura el límit de resolució.
El canó electrònic presenta dos filaments de tungsté o wolframi, que augmentant la seva temperatura (emissió termoiònica), funcionaran, a mode de càtode, emetent electrons en un feix molt fi gràcies a una perforació carregada negativament perquè els electrons puguen circular. Aquestos seran atrets per un ànode, ja que juntament amb el càtode, crearà una diferència de potencial.
Les columnes dels microscopis electrònics presenten el seu interior buit de qualsevol contingut (aire, etc) per possibilitar el pas dels electrons. Aquest fet obligarà a utilitzar cèl·lules mortes deshidratades.
Tindrem camps electromagnètics que van a actuar com a lents. Parlarem d’una lent condensadora, d’una lent de l’objectiu i d’una lent projectora.
Els microscopis electrònics només es poden veure en blanc i negre, ja que no utilitzen la llum, però se li poden donar colors en l'ordinador.
Els materials que s’observen han de ser sotmesos a una sèrie de manipulacions: fixació, inclusió en resines dures per a poder fer seccions ultrafines de les cèl·lules utilitzant ultramicrotoms, tinció, deshidratació… FUNCIONAMENT GENERAL: Un microscopi electrònic funciona amb un feix d'electrons generats per un canó electrònic, accelerats per un alt voltatge i focalitzats per mitjà de lents magnètiques (tot açò a l'alt buit ja que els electrons són absorbits per l'aire) dirigits cap a la mostra que es vol observar. La resta del procés fins que la imatge es forme i ens arribe (incidència sobre la mostra, captació d’electrons per l’ànode, etc) es característic de cada un dels dos tipus de microscopi electrònic: MEB i MET INTRODUCCIÓ I COMPARACIÓ AMB EL MICROSCOPI ÒPTIC En els microscopis electrònics es treballa amb un raig d’electrons on la seva longitud d’ona (λ) es encara més petita que la de la llum.
Comparació entre instruments Característiques Font d’energia Longitud d’ona Tipus de lents Medi de treball Tipus de mostres Augments Límit de resolució (LR) MO ME Llum λ=500nm Vidre Aire Vives/Mortes X40 → x1000 0,1μm- 0,2μm Electrons λ=0,005nm Bovines electromagnètiques Buit Mortes X2000 → x1000000 0,2 nm–10 nm Esquema comparatiu entre MO, TEM y SEM El microscopi electrònic de transmissió manté la mateixa disposició de lents que l'MO, per tant ens donarà la mateixa informació morfològica però amb més resolució.
Comparació entre MET i MEB Microscopi electrònic de transmissió (MET) Feix d’electrons estable Feix d’electrons travessa la mostra (eprimaris) Imatge per transmissió (comparable a MO) K.V= 40-100 (K.V= Quilo voltatge) Augments (1.000 a 1.000.000) L.R= 0,2 nm - 1 nm Microscopi electrònic de rastreig (MEB) Feix d’electrons escombra la superfície de la mostra El feix d’electrons no travessa la mostra, interacciona amb la superfície ( e- secundaris) Imatge topogràfica (comparable a la lupa binocular) La imatge que ens dona es la que veuríem nosaltres a simple vista si tinguéssim la mateixa resolució K.V= 1-40 Augments (10 a 100.000) L.R.= 3,5 nm - 10 nm MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE TRANSMISSIÓ Configuració La retxa és de coure En el microscopi electrònic de transmissió, necessitem talls de 70 nm. Això s’aconsegueix amb fulles (“cuchillas”) de diamant.
El filament de tungstè es pot calentar fins 3000ºC sense fondre’s.
Les limitacions d’aquest microscopi són el gruix, ja que ha de ser molt petit, i el contrast.
En el microscopi òptic aquest problema s’arregla amb la tinció, però en el electrònic de transmissió els electrons no donen color, i el que es fa es ficar a la mostra UrAc o CPb, que són metalls pesats.
Si els àtoms reaccionen amb aquest metall pesat, formen una ombra perquè el raig d’electrons es desviat. Si els electrons no es desvien vol dir que no han interaccionat amb la mostra, per tant surt en blanc.
Formació de les imatges El MET manté la mateixa disposició de lents que el MO, per tant ens donarà la mateixa informació morfològica però amb més resolució.
Quan un electró amb una determinada velocitat (energia) xoca contra un objecte, o mostra, poden ocórrer diversos successos: 1. El electró travessa netament la mostra, sense interactuar amb els seus àtoms. Electrons no dispersats o transmesos.
Camp clar: forma normal de treball, s'observen els electrons no dispersats, els que no tenen interacció amb la mostra.
2. L'electró passa prou a prop del nucli com per ser atret per la seva càrrega positiva, patint una desviació de la seva trajectòria inicial.
- L'electró no perd velocitat (energia), no passa res més, però el canvi de rumb és conegut com dispersió elàstica (MET).
- L'electró perd velocitat i una pèrdua d'energia, és a dir, experimenta una dispersió inelàstica.
Camp fosc: S'observen els electrons dispersats (elàstica i inelàsticament) i s'eliminen els no dispersats. Utilitzat en mostres no tenyides (no contrastades) o en tinció negativa Característiques de la imatge •Imatge plana (x,y) •Imatge augmentada (1.000 a 1.000.000x) MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE RASTREIG Configuració El detector està carregat positivament, i capta els electrons despresos (electrons secundaris) Característiques de la imatge •Imatges en 3 dimensions •Mostres de gran volum •Profunditat de camp, varis mm Profunditat de camp: capacitat de veure enfocats simultàniament diferents plans de la preparació o mostra Formació de la imatge: - Imatge d'electrons secundaris - Imatge d'electrons retrodispersats Microanàlisi de raigs X Quantitatiu Qualitatiu El nombre d'electrons formats, varia directament amb el nombre atòmic (Z) de la mostra. Com més Z, major probabilitat de xoc, més resposta, més fosc.
L'electró que arriba íntima amb algun dels electrons locals dels orbitals interns i acaba expulsant l'àtom. Aquest electró expulsat s'anomena electró secundari (MEB) L'electró primari continua el seu camí, però alguna cosa desviat i debilitat i són la base d'una altra tècnica d'anàlisi EELS (Electron Energy Loss Spectrometry).
Imatge d’electrons secundaris Utilització: Informació de la superfície. Nomes veiem la capa superior (fins un grossor de 100Ȧ) L'electró passa prou a prop del nucli com per ser atret per la seva càrrega positiva, patint una desviació de la seva trajectòria inicial. Si la desviació és més gran de 90 º, l'electró torna a sortir de la mostra per on va entrar i es parla d'electrons retrodispersats (BSE). utilització: -Estudis Arqueològics -Estudis Mèdics Com més nombre atòmic major intensitat. Aquest fet permet distingir fases d'un material de diferent composició química. Les zones amb menor Z es veuran més clares que les zones que tenen major nombre atòmic.
MICROANÀLISIS En un MEB també es formen rajos X característics causats per la vacant electrònica dels electrons secundaris: un e- d'una capa superior de l'àtom omple el buit deixat per l’electro secundari. La pèrdua d'energia serà el RX característic. Així doncs, si tenim un analitzador especial per a analitzar l'energia dels rajos X, podrem: • Permet conèixer els elements químics presents en les diferents parts d'una mostra.
• Permet veure la distribució d'aquests elements, i fer la seva quantificació.
Els microscopis electronics que aprofiten aquestos rajos X s’anomenen MICROSCOPIS ELECTRÒNICS DE TRANSMISSIÓ I ESCOMBRATGE, METB, o Scanning Trasnmission Electron Microscope, STEM. Quan anem a utilitzar aquesta tècnica les mostres es contrasten amb carbó. Un METB que utilitza aquesta tècnica posseeix un braç lateral i contenidor extra de nitrogen líquid.
Alguns picosegons després que l'electró secundari ha deixat una vacant en l'àtom (l'ha ionitzat), un altre dels electrons locals d'algun orbital més extern es llança a ocupar el lloc del expulsat, més prop del nucli. Ara bé, aquesta reestructuració de plantilla deixa a l'àtom amb un excedent d'energia, que pot solucionar de dues maneres diferents: - L'àtom expulsa un electró de la capa externa que són utilitzats en una altra tècnica AES (Auger Electron Spectrometry).
- L'àtom emet un fotó de raigs X. (espectrometria per dispersió d'energies de raigs X: EDS, EDXRS, EDX o XDS).
L'energia dels fotons emesos està directament relacionada amb el pes atòmic de l'element emissor perquè la diferència d'energia entre orbitals augmenta segons ho fa el pes atòmic, a causa principalment de l'augment del nombre de protons en el nucli. D'aquesta manera podem associar cada valor d'energia emesa amb un element de la taula periòdica, així que mesurant amb un detector apropiat els fotons expulsats per la mostra podem esbrinar: a) per l'energia de cada fotó, com és l'element que ho està produint (anàlisi qualitativa).
b) pel nombre de fotons emès de cada energia, la quantitat relativa de cada element (anàlisi quantitativa).
Utilització-Raigs X: El microanàlisi pot ser qualitatiu i quantitatiu.
Ex.: degradació del cabell humà per fongs queratinofílics (Piedraia hortae). És una infecció endèmica en països tropicals i subtropicals que sense tractament pot persistir durant anys.
En aquesta patologia, no solament el sofre característic de la cisteïna que forma la queratina del cabell i les ungles serà predominant, apareixeran altres elements estranys que en circumstàncies normals no tindria un pèl en tals proporcions (Si, Al, P…).
TÈCNIQUES DE PREPARACIÓ DE MOSTRES Objectius: - Preservar l'estructura i la composició de la mostra en les condicions més pròximes a les vitals.
- Posar de manifest estructures, propietats o experimentacions.
- Evitar els artefactes Comparació entre les tècniques de preparació per MET i MEB MET MEB Fixació Deshidratació Fixació Deshidratació + Secat (Punt crític y crio dessecació) Inclusió Tall Contrast Conductivitat (Metal·lització amb Au, C)  Fixació: Mètodes químics: Utilització de solucions fixadores que estableixen ponts d’unió entre les molècules.
- Glutaraldehid (GA) i Paraformaldehid (PFA) [2%]: Fixen proteïnes Tassa de penetració a temperatura ambient = 0,7 mm/3h - Tetraòxid de Osmi, OsO4 [1%]: Fixa lípids Tassa de penetració a temperatura ambient Tenyeix les estructures de negre, degut al depòsit d’òxid d’osmi.
Mètodes físics: Utilització de baixes temperatures (a través de líquids criogènics: He, N, etc.) Solucions Buffer Solucions tampons mes utilitzades en MET - Buffer Fosfat - Buffer Citrat - Buffer Aconitat  Deshidratació: Comparat amb el microscopi òptic la progressió és mes lenta. Els canvis de concentració són més lents.
 Assecat: (En el MEB) L'assecat de punt crític és un mètode per assecar teixits sense que aquests col·lapsen o deformen la seva estructura original, és a dir, com quan es troben humits i són fràgils.
Aquest mètode és generalment parteix del procés de preparació de mostres per MEB.
És ben sabut que deixar assecar un teixit amb aire convencional o al buit (durant processos de metalització, per exemple), genera dany a la superfícies que es van a observar. La causa del per què les mostres de teixit es danyen quan s'assequen amb aire es basa en les forces de tensió que es creen per la pressió atmosfèrica en cavitats de petites dimensions on hi ha una interfase líquid/gas. Així doncs, la tècnica del punt crític evita això.
Consisteix a jugar amb que les substàncies depenent de la pressió i la temperatura poden trobar-se en diferents estats. Tenint en compte això, enganyarem a la cèl·lula. Una vegada introduïda aquesta en alcohol, després d'haver sigut deshidratada, li introduirem en el seu interior CO2 en estat líquid. A continuació, canviarem les condicions de pressió i temperatura perquè aquest CO2 s'evapora fàcil i ràpidament, a diferència de l'aigua.
L'assecat del punt crític ofereix l'avantatge que cada solvent té una temperatura i una pressió crítiques en què la densitat del vapor és igual a la densitat del líquid.
La transició de líquid a gas al punt crític ocorre sense una interfície perquè les densitats de líquid i gas són iguals en aquest punt.
Es submergeix el teixit totalment en un líquid per sota del seu punt crític.
S'evapora el líquid en ser portat a una temperatura i pressió per sobre del punt crític i per tant la mostra queda seca sense estar exposada a les forces de tensió de superfícies que pugui distorsionar la seva configuració tridimensional.
Criodessecació: consisteix en congelar la mostra amb substàncies ultracongelats, com el nitrogen líquid a -176ºC. Es sotmet el teixit a dos processos. El primer és la fixació instantània per congelació en nitrogen líquid. El segon dessecació per sublimació directa de l'aigua confiada a vapor en una bomba de buit. És un procés complicat i costós però té un avantatge molt important i és que en eliminar totalment l'aigua tissular, paralitza l’autòlisi i produeix una conservació indefinida. A més evita que es produïsquen enllaços químics entre el teixit i el fixador, conservant així l’estructura antigènica tissular.
  Inclusió: mitjançant resines epóxi (plàstics). Les resinas són líquides a temperatura ambient i quan les col·loquem a l’estufa, es tornen dures.
Tall Es realitza amb el micròtom, exactament amb el ultramicròtom, que les “cuchillas” són de vidre o de diamant.
 Montatge: Unió física i no només mecànica entre la mostra i el suport.
Adhesius de carbó, cinta adhesiva de doble cara, plata o carbó col·loïdal, plastilina de carboni Plàstic termo fusible, araldite Connexió a toma de terra de l'equip.
Suports: Stubs d'alumini, suports de carboni, portaobjectes, filtres de policarbonat, mica exfoliada ...
 Tinció: Per al MET En els microscopis electrònics no es realitza tinció, sinó contrast amb sals de metalls pesats: - Solució d’acetat de Uracil (UrAc) - Solució de Citrat de Plom(CPb) Quan realitzem la fixació amb el osmi, aquest ja afavoreix en el contrast perquè també es un metall pesant.
Les reixetes amb els talls ultrafí es dipositen surant sobre gotes d'aquests reactius durant uns minuts. Després d'aquest temps, es renten i poden ser observades. De vegades es recorre a dobles contrastos mitjançant combinació seqüencial de citrat de plom i d'acetat d'uranil.
Les sals de plom són verinoses i l'acetat d'uranil és radioactiu, per la qual cosa es requereix utilitzar les mesures de precaució adequades per a la seva manipulació.
Per al MEB Les mostres biològiques estan formades per àtoms que poden despendre electrons. El problema que aquests àtoms tenen poc electrons, per tant se’n poden despendre pocs. El que es fa es cobrir la mostra amb or (Au), ja que el seu nombre atòmic es elevat, o amb C.
Per tant, la mostra a observar ha de ser conductora, en cas contrari l’impacte del feix d'electrons sobre la mostra faria que aquesta es carregués negativament, provocant distorsió en la formació de la imatge (la mostra pot ser com un mirall per als electrons) - Ion sputtering Consisteix en recobrir la mostra (20nm) amb un element metàl·lic (Au, Au-Pd, Pt Ag.) Evaporació de carboni S'escalfa el fil de carboni per sobre del seu punt de fusió, s'evapora i cau damunt de la mostra, que en estar freda es condensa i forma una pel·lícula contínua En el MEB No es realitza ni la inclusió ni el tall.
 Observació: Preparació de mostres per MET Tècniques especials  Tinció negativa Els dipòsits de metalls pesants s'acumulen a tota la reixeta de l'espècimen, excepte on hi ha partícules.
La mostra apareix més brillant.
Apropiada per observar partícules molt petites (virus, ribosomes, complexos proteics, elements del citosquelet i fins i tot proteïnes individuals i àcids nucleics) (Acido Fosfotúngstico, (FTA) H3PO4. 12 WO3. 24 H2O)  Tècnica de ombrejat La reixeta amb els espècimens es col·loquen en una cambra segellada on es pràctica el buit La càmera conté un filament de metall pesat (Pt-C) que s'escalfa fins evaporar El metall es diposita en les superfícies que queden enfront del filament, mentre que les superfícies oposades de les partícules i l'espai entre la reixeta que queda sota la seva ombra queden sense coberta Les àrees d'ombra es veuen brillants i les cobertes amb metall obscures, relació que s'inverteix en la placa fotogràfica (negatiu de la imatge)  Tècnica de la criofractura - Es col·loquen petits fragments de teixit en un disc metàl·lic - Se congelen amb rapidesa amb N2 líquid - Es munta el disc sobre una placa freda dins d'una cambra de buit - Se colpeja amb la vora d'una navalla i el pla de fractura s'estén dividint el teixit en dues parts - Sobre la superfície de fractura es diposita una capa de metall pesat amb angle per produir ombres - Depòsit d'una capa de carboni perpendicularment que pegui els pegats de metall en una capa sòlida - Es descongela i destrueix el teixit restant - La rèplica metall-caboni es col·loca en la graella i es visualitza ...