Tema 6 - Anàlisi productes PCR (III) - Detecció de metilacions per PCR (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 11/04/2016
Descargas 21
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 DETECCIÓ DE METILACIONS PER PCR També podem analitzar metilacions que afecten a les bases de la seqüencia estudiada (del fragment amplificat), això si, d’una manera diferent al que fem per Southern blot.
Ens interessa saber si s’ha donat algun canvi en el patró de metilació en la seqüència promotora del gen que estudiem. Per Southern utilitzàvem una parella d’enzims de restricció, però per PCR es fa diferent.
Per PCR analitzem el DNA amplificat sense metilacions, aquestes es perden (la Taq només amplifica, no metila les seqüències de nou). El que es fa en aquestes PCRs és tractar el DNA genòmic amb disulfit sòdic, un fort mutagen que alterarà el DNA utilitzat com a motlle per fer la PCR.
Un cop tractat amb disulfit sòdic, tenim diferents mètodes per analitzar el DNA: - COBRA Metilació específica PCR Seqüenciació bisulfit MassArray MALDI – TOF Piroseqüenciació 163 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 SEQÜENCIACIÓ / BISULFIT SÒDIC El tractament del DNA amb bisulfit sòdic provoca els canvis de citosines a uracils per desaminació; fa que la citosina perdi el grup amino i es torni uracil. Per tant, quan amplifiquem sobre aquest motlle, en el producte amplificat tindrem Timines en lloc de Citosines (Uracils no perquè estem sintetitzant DNA). Passem de tenir C no metilades a tenir Timines.
Les citosines metilades (5-metilcitosina) són resistents al tractament amb disulfit; aquest no les modifica, es mantenen com a citosina en el producte amplificat.
Després d’un tractament amb bisulfit sòdic tindrem: - - Citosina  Uracil.
Citosina metilada  Citosina.
A partir d’aquí analitzem el producte. Nosaltres amplifiquem determinades seqüències de regions promotores susceptibles al silenciament per metilació, les seqüenciem i volem determinar l’estatus de metilació de les citosines.
164 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Després del tractament amb bisulfit seqüenciem el producte; si hi havia una citosina, aquesta com hem dit passarà a uracil si no està metilada, i si està metilada es mantindrà com a citosina.
Per tant, les citosines que resten seran les que ja estaven metilades.
La diferència de pics de timina (que aparella amb uracil) i citosines ens indicarà la proporció de citosines metilades en aquella posició. Si no tenim la seqüència de referència, no podrem diferenciar quina timina prové de citosina no metilada i quina era normal, no podem determinar quina proporció de citosines no metilades hi havia en el DNA.
És per això que mola tenir la referència, ja que llavors saps quantes T hi havia.
Ara bé, el disulfit no detecta les 5hmC (citosines hidroxi metilades). És a dir, que no diferencia les citosines metilades de les hidroxi metilades. Tant les 5mC com les 5hmC són resistents al tractament desaminant. Llavors hem d’oxidar el DNA perquè deixin d’estar d’aquesta forma.
Així doncs, fem els dos tractaments: un amb disulfit i un on aplicaríem desoxidant, després el disulfit sòdic i després seqüenciaríem. Comparem els resultats de les dues seqüenciacions (dels dos tipus de tractament).
Quan s’oxiden les citosines en forma de 5hmC, passem de tenir una C a un T. Així doncs, totes les T que ara t’apareixen en comparació a quan no havies oxidat el DNA són citosines que estaven hidroximetilades; ens apareixeran noves timines que eren 5fC.
165 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 MSP – PCR específica de metilació Dissenyem encebadors específics per una seqüència corresponent a regions metilades; un encebador tindrà G per les C, i un altre tindrà A pels uracils (C transfomred).
- Si amplifica l’encebador específic per la no metilació (els que porten G) voldrà dir que la regió del DNA no estava metilat.
Si amplifica l’encebador específic per metilació (els que porten A) voldrà dir que la regió del DNA sí estava metilat.
En aquest cas, l’estabilitat de l’encebador depèn de si el DNA està metilat o no.
Per exemple, en una mostra d’un pacient de tumor pulmonar, en l’encebador dissenyat per absència de metilació hi ha amplificació (el DNA no està metilat) i en l’encebador dissenyat per presència de metilació no n’hi ha. S’estan expressant els gens en el teixit tumoral.
COBRA – Combined bisulfite restriction analysis Es tracta d’utilitzar enzims de restricció que reconeguin la diana en la qual es troben les citosines metilades i les no metilades.
Com hem explicat, aïllem DNA genòmic, el tractem amb disulfit. I les C estan metilades, res; si no ho estan, es desaminen i es tornen Uracil. Llavors fem la PCR. En el motlle no modificat obtindrem C. En el motlle modificat obtindrem T enlloc de C.
166 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En COBRA, a més de disulfit i PCR, afegim enzims de restricció. La diana de restricció només es mantindrà en el cas que hi hagi metilació; sinó, la diana de restricció desapareix (la C ha passat a ser una T i la diana ja no la reconeix).
Digerim el producte amplificat amb BstUI (enzim de restricció); si la diana està present la tallarà i obtindrem la banda corresponent; si la diana ha desaparegut, no tallarà.
- Si hi ha digestió, obtenim dues bandes en el gel d’agarosa, i deduïm que les C estan metilades. La suma de les dues bandes és igual a la banda original.
Si només apareix una sola banda, correspon a la banda original, les C no estan metilades.
En els teixits tumorals, tindrem unes còpies metilades i unes no metilades, per tant ens poden sortir fins a 3 bandes, producte de l’amplificació del motlle no metilat i del sí metilat.
En funció de la intensitat de les bandes podrem saber quina proporció de còpies estan metilades o no. Comparem la intensitat de senyal de les bandes corresponents al DNA de les bandes digerides respecte el DNA amplificat per cadascun dels carrils.
A més % de metilació, la intensitat de les bandes petites és major, i disminueix la intensitat de la banda del producte sense digerir.
167 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 També tenim altres tècniques; les 3 que hem explicat són les més utilitzades. D’aquests 3, els 2 darrers són els més senzills i econòmics.
168 ...