Histologia 1r tema UAB (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Histologia
Año del apunte 2015
Páginas 15
Fecha de subida 22/02/2015
Descargas 10

Descripción

Primer tema d' histologia de 1r de medicina de la UAB

Vista previa del texto

Cristina Villalobos HISTOLOGIA TEMA 1 1.Classificació de teixits EPITELIAL revestiment glandular conjuntiu CONNECTIU sanguini addipós cartilaginós TEIXITS ossi llis MUSCULAR esqueletic cardiac NERVIÓS 1.
Teixit epitelial: revesteixen la superfície del cos, cavitats o formació de glàndules a) 1 epitelis de revestiment: pell, còrnia, llum de l’intestí,vasos… Tenen funció de protecció i absorció Cristina Villalobos b) epitelis glandulars: ex. recobriment del fetge. Secreten substàncies, per tant estan desenvolupats en cèl·lules amb orgànuls de secreció com RE i AG 2. Teixit connectiu: subjecten altres teixits bàsics, de manera estructural i funcional. Actuen com a “cement” a) Conjuntiu: format per diferents fibres de col·làgena,GAGs.. Que es troben a continuació d’un epiteli.
b) Sanguini: té com a funció el transport de substàncies. Format per eritròcits i plaquetes.
c) Adipós: actua com a reserva energètica d) Cartilaginós: agrupació de condròcits, és avascular 2 Cristina Villalobos e) Ossi: osteòcits 3. Teixit muscular: Cèl·lules contractils amb funció de moviment a) Muscular llis: contracció involuntària d’òrgans interns. Són cèl·lules petites amb un nucli central b) Muscular esquelètic/estriat: Té molts nuclis perifèrics i la contracció és voluntària.
c) Múscul cardíac: cèl·lules allargades però més curtes que el teixit esqueletic, té un o més nuclis centrals, la contracció és involuntària i és estriat 3 Cristina Villalobos 4. Teixit nerviós: rep, transmet i integra la informació de l’exterior cap a l’interior per a realitzar activitats de l’organisme.
a) SNC b) SNPerifèric 2.Tècniques histològiques Es fa el processament, depenent de la classificació i del tipus de microscopi: 1.Obtenció del teixit: pot ser vegetal o animal, viu o mort 2.Fixació: - Serveix perquè no es podreixi per l’acció bacteriana o a l’autòlisi.
- Endureix el teixit perquè es mantingui tal com està, manté l’estructura, és a dir, les molècules i estructures.
- Manté a lloc les molècules Els fixadors més utilitzats són: - aldehids,alcohols,mercuri,àcid pricric - barreges: ·Formol: formaldehid + metanol ·Parafolmaldehido: formaldehid en tampó fosfat ·Bouin: àcid pícric + formol + àcid acetic ·Karnoy: etanol + cloroform + àcid acetic 4 Cristina Villalobos Mètodes de fixació: A) fixació per immersió: submergim la mostra en el fixador. Aquest mètode té el problema de la penetrabilitat, quan un animal o persona mor, les cèl·lules canvien molt ràpidament, per exemple, les del cervell són molt susceptibles a la falta d’ oxigen, per aixó el mètode més utilitzat és el de la perfusió cardíaca, perquè no té aquest inconvenient.
Precaucions: · Mida de la mostra: si és massa gran, trigarà molt temps a fixar-se la part interna i es podrirà o degradarà abans de fixar-se · Volum del fixador: 10 o 20 vegades més gran que la peça que estem fixant · Temps · Osmolaritat: ben equilibrat entre teixit i solució · Ph: similar al fisiològic B) fixació per perfusió cardíaca consisteix en utilitzar el reg sanguini per a arribar als diferents òrgans i obtenir millors resultats.
S’introdueix el fixador a través del torrent sanguini, de manera que el fixador s’exten per la xarxa capil·lar i arriba a tots els òrgans.
S’utilitza en animals, ja que comporta la mort de l’animal.
La conservació és molt bona perquè passem d’un teixit viu a fixat, de manera que no hi ha necrosi.
Després de la fixació podem: - congelar: s’utilitza un anticongelant perquè no es formin cristalls de gel que trencarien el teixit. permet la obtenció de seccions que poden ser de 50 μm fins nm, per aquest mètode utilitzem micròtom de congelació, ultracriotom o el criostat - tallar amb un vibrotom ( seccions relativament gruixudes) - inclusió 3.Inclusió: Ficar el teixit en un material suficientment dur que permeti tallar-ne llesques. Per exemple es pot utilitzar parafina o resina A) Inclusió en parafina: Microscopia òptica La parafina és una substància formada per una barreja de hidrocarburs saturats ( cera d’ espelma), per això no es soluble en aigua. Com que tots els teixits estan formats principalment per aigua, i a més la majoria de fixadors estan fets de solucions aquoses, perquè la parafina líquida pugui penetrar completament el teixit, és necessari substituir l’ aigua per un solvent que si que sigui soluble. Per a aconseguir-ho utilitzem alcohol per a deshidratar el teixit abans de fer la inclusió amb parafina.
5 Cristina Villalobos Es fan talls amb el micròtom de 5-10 micres de gruix. Avegades es congela i es talla la mostra amb el criostat PROCEDIMENT 1. Fixació per immersió i perfusió 2. Deshidratació: primer amb alcohol de 70º i anar augmentant els graus fins als 100º 3. Immersió: en xilé (soluble en etanol i parafina) 4. Inclusió: en parafina liquida en un motllo on es dissol el xilé i així la parafina penetra el teixit. 3 banys de 10 min.
5. Elevar la temperatura: a 60ºc 6. Solidificació: es deixa refredar la mostra B) Inclusió en resines: Microscopia electrònica Les resines són més dures i així podem tallar la mostra més prima. S’acostumen a utilitzar resines epoxi ( són altament cancerígenes). No s’utilitza micròtom Procediment: ( similar a parafines) 1. Fixació per immersió i perfusió 2. Rentats en solució tamponant i postfixació de tetròxid d’ osmi, que assegura una fixació forta.
3. Deshidratació: primer amb alcohol de 70º i anar augmentant els graus fins als 100º 4. Immersió: òxid de propilé ( líquid intermediari) que dissol millor la resina 5. Inclusió: de la resina en el motlle 6. Polimerització 7. Elevar la temperatura: a 60ºc durant 48 hores 6 Cristina Villalobos 4.Talls: A) Criostat: mètode de congelació, és un micròtom en una cambra de congelació i sovint s’utilitza en microscopia òptica.
B) Ultramicrotom: en resina. És més precís que el micròtom de parafina - Talls semifins ( 0,5μm-2μm) a microscopi optic - Talls ulltrafins ( 0,05μm) per microscopi electrònic, es fan talls amb una fulla de vidre. Aquests talls quan els tallem queden flotant sobre una bassa d’aigua que te la fulla de vidre i no es recullen sobre el portaobjectes, sinó directament sobre suports de niquel o coure, aquests s’ anomenen reixetes i ofereixen una elevada nitidesa de les imatges.
C) Micròtom: en parafina, mostres de 5 a 20μm, són per a microscopi òptic. es posa la mostra i amb una fulla i una maneta es talla i s’obté una tira de talls que es posen sobre l’aigua d’ on es recolliran amb el portaobjectes.
D) Vibròtom: curta material no inclòs, encara que si fixat o dur, a seccions de 30 a centenars de micres de gruix, per a observar amb el microscopi òptic.
7 Cristina Villalobos 5.Tincions i contrastos 1) Tincions topogràfiques o generals 2) Tècniques específiques 3) Tècniques histoquímiques 4) Tècniques immunocitoquímiques 1) TINCIONS TOPOGRÀFIQUES O GENERALS Serveixen per tenyir qualsevol estructura, estan basades en interaccions de colorants. Hi ha diferents tipus de colorants: - Iònics àcids: tenen afinitat per estructures tissulars amb càrrega positiva com estructures proteiques citoplasmàtiques o col·lagen de la matriu extracel. Ex: eosina, fuccina àcida, verd ràpid i taronja G.
- Iònics bàsics: tenen afinitat per estructures tisulars amb carrega negativa com DNA,RNA, glucosaminoglicans de la matriu extracel. Ex: Hematoxilina,tionina,safranina, blau toluidina, blau de metilè.
- Neutres: tenen una part àcida i una bàsica. Ex: eosinat de metilè * citoplasma: eosinofil i nucli: basofil Es poden utilitzar dos a la vegada, com la tinció hematoxilina- eosina: la hematoxilina tenyeix estructures basofiles en blau, és a dir, tenyeix estructures amb càrregues negatives, per això marca els nuclis perquè contenen DNA . La eosina tenyeix càrregues positives, és a dir, el citoplasma ( eosinofil) en rosa.
Tinció hematoxicilina-eosina: epiteli monoestratificat amb els citoplasmes ( roses) i els nuclis més foscos ( blau), el que no està tenyit no son estrucures ( hi ha ausència de la cel·lula).
8 Cristina Villalobos Procediment: · Agafem un portaobjectes amb la mostra · Desparafinat: elimina el medi d’inclusió ( parafina), ja que és hidròfoba i els colorants són solucions aquoses i per tant la hem d’eliminar amb Xilé o bencé.
· Hidratació: alcohols decreixents fins arrivar a aigua ·Tinció: acompanyada de rentats amb H2O destil·lada. ( hematoxilina + aigua + eosina+ aigua) · Deshidratació: amb alcohols creixents perquè el medi de montatge no sol ser hidrosoluble,sol ser una resina.
· Afegim Xilé ·Muntatge: Afegim un cobreobjectes i un medi de montatge ( pot ser hidrofil o hidrofob). Si utilitzem colorants que es dissolguin en aigua utilitzarem un medi hidròfob per a conservar la nostra mostra durant anys. En canvi, si utilitzem un medi soluble en aigua, aquest dissoldrà els colorants, de manera que al cap d’uns dies ja no estarà tenyit.
En aquest cas s’ ha utilitzat un medi de montatge hidròfob. per això es fa la deshidratació, sinó no caldria.
2) TÈCNIQUES ESPECÍFIQUES No ho tenyeixen tot, tenyeixen la molècula que ens interessa. Normalment es realitza una tinció especifica i després es fa una tinció de contrast topogràfica perquè tenyeixi tota la resta.
Ex: - Oli vermell: tenyeix lipids en vermell - Negre i vermell sudan: tenyeix lipids - Hematoxilina eosina: adipòcids 9 Cristina Villalobos *La hematoxilina eosina no tenyeix lipids perque no es específica per aquests i perque al haver estat tractat amb parafina els lipids han desaparegut.
*Si afegisim vermell sudan a la mostra de hematoxilina eosina no es tenyiria re ja que els lipids han desaparegut. No hi han mai lipids en mostres tractades amb parafina 2.1) TÈCNICA ESPECÍFICA DE TEIXITS CONJUNTIUS *Van gieson: el txt conjuntiu és el rosa.
*Tricromic de Masson: txt conjuntiu en verd - blau 2.2) TÈCNICA ESPECÍFICA DE MUCCINES *Blau alcian i Mucicarmin: tenyeix de blau * les glandules salivals tenen una porció serosa i una mucosa, si es tenyeixen vol dir que és mucosa 10 Cristina Villalobos 3) TÈCNIQUES HISTOQUÍMIQUES Impliquen una reacció química, és a dir, transformen un producte en un altre diferent amb característiques diferenciables.
Ex: ( PAS, LECTINES, TECNIQUES HISTOENZIMÀTIQUES) - PAS (àcid periòdic de Shiff): serveix per detectar carbohidrats. El teixit es tracta amb àcid periòdic i els transforma en aldehids que després reaccionen amb el colorant . Tenyeix polisacarids simples, mucopolisacarids neutres, glicoproteïnes i glucolipids: glucògen, membranes basals,muccines, glicocalix.
El resultat de la tinció és rosat.
* Els passos en verd són els específics per aquesta tinció.
* els grups aldehids si que tenen afinitat amb el colorant de shiff, no els carbohidrats.
* s'afageix hematoxilina per fer el contrast 11 Cristina Villalobos - LECTINES: proteïnes d’origen vegetal que detecten sucres o residus glucosilats. per exemple la lectina del tomaquet que serveix per tenyir del·lules de microglia del cervell.
Hi ha 5 grups de lectines que detecten: - Manosa - Galactosa/ N-acetil galactosamina - N-acetil -glucosamina/ N-acetil-lactosamina - Fucosa - Àcid sialic Revelat de lectines ( formes de veure les lectines): A. Lectines biotintades: Tinció de microglia.Tripsina o neurominadas per exposar els residus amagats.
Avidina peroxidasa. Revelat amb DAB.
· El cercle representa la cèl·lula a detectar que conté residus glucosilats (poli-N-acetillactosamina) · És detectat per la LT ( lectina) i s’hi uneix, però la lectina no té color, per això s’utilitza LT unida Biotina, tot i que tampoc té color.
· S’afegeix Avidina peroxidasa, que té gran afinitat per la biotina.Aquesta tampoc té color, però és un enzim que actua sobre el peroxid d’ hidrogen.
* les cel. tenyides de marró tindran residus glucosilats en la seva mb · Afegim aigua oxigenada i DAB ( són els substrats de la reacció de la peroxidasa), la peroxidasa oxida el DAB que s’uneix a l’O2 i dona DAB-O, un producte insoluble que precipita de color marró.
B. Lectines unides a fluorocroms: es poden observar amb el microscopi de fluorescencia - TECNIQUES HISTOENZIMÀTIQUES: Tenyeixen enzims degut al precipitat del producte de la reacció que produeixen els enzims Ex: - Nuclosidodifosfatasa: està en la mb plasmàtica de cels de microglia i vasos sanguinis. Actua sobre l’ ADP que produirà AMP i Pi.
Procediment: 1. Talls histològics obtinguts amb vibròtom ( talls gruixuts), si ho féssim amb parafina o per congelació al tractar-se d’enzims es farien malbé.
2. Afegim ADP a una solució que contingui tampó i la mostra. Allà on sigui l’enzim actuarà i transformarà AMP i Pi.
3. Afegim també Nitrat de plom i es produirà una reacció donant Fosfat de plom que té la particularitat que és insoluble en aigua i precipita. Tot i així no es veurà al microscopi perque és incolor.
4. Afegim Sulfur d’ amoni que desplaçarà el grup fosfat i es formarà sulfur de plom ( color marrò) i ara si que es veurà al microscopi ( si el volem en negre s’utilitza sulfat de plata) * En general: necessitem una sal que precipiti i una sal que tenyeixi.
* En aquest procés és necessària la prèvia fixació de la mostra, amb compte, no s’ha de fixar molt o no contactaran els enzims.
12 Cristina Villalobos 4) TÈCNIQUES INMUNOCITOQUÍMIQUES S’utilitzen anticossos* dirigits a epitops ( grups amb característiques antigèniques) concrets de molècules.
*Anticós: proteïna sèrica ( immunoglobulina) sintetitzada per cels citoplasmàtiques, derivats dels limfòcits B activats després de reconèixer un antigen estrany. se solen utilitzar IgG i IgM Hi ha dos tipus d’ anticossos: A. POLICLONALS: conjunt d’anticossos específics per un antigen, actuen sobre diferents regions, és a dir, diferents epitops d’una mateixa molècula. Reconeix un antigen que pot estar en diferents epitops B. MONOCLONALS: especific d’un epitop unic d’ un antigen Tècnica per a obenir anticossos policlonals i monoclonals Ex: Astròcids ( cel. cervell) Fabricació dels anticossos: 1. Agafar un tros de cervell humà i matxacar-lo 2. Extreure una proteïna GFAP ( proteïna àcida fibril·lar de glia que s’expressa exclusivament en els astròcids) 3. La introduïm en un conill, que fabricarà anticossos policlonals contra GFAP. Li extreiem sang al conill i obtenim anticossos policlonals contra GFAP Si volguesim anticossos monoclonals: un limfòcit nomes fabrica un tipus d’anticòs.
Aïllem un anticòs concret i així obtindrem un limfòcit monoclonal de GFAP Els anticossos no són visibles amb el microscopi així que s’hi uneixen altres molec que donguin una senyal visible. Aquestes molec poden ser de dos tipus: molècules fluorescents o enzims * Els anticossos policlonals són més economics i tenen més senyal, si la quantitat que tenim de proteïna és molt baixa utilitzem un policlonal 13 Cristina Villalobos * Immunofluorescència: es poden fer dobles i triples marcatges.
Ex: - GFAP I hsp 47(fluorocrom vermell): les cels que tinguin els dos anticossos ( verd + vermell) es veuran grogues.
- Triple tinció de lectina + fluorocrom blau + GFAP: gfap serà vermell ( astrocits), lectina en verd (vassos), i els nuclis blaus.
6. Observació Si observem a microscopi electrònic ni s’ha de tenyir la mostra, ja que fem servir el contrast, si el tall és semifí (0,5-2 micres) es veu l’interior del citoplasma, si són talls ultrafins es veu el nucli i els organuls de l’interior amb gran definició, per a fer-ho s'ha de fer amb un ultramicròtom. si s'utilitza amb fulla de diamant es d’ uns 50 nm 1.2 Tipus de microscopi A. MICROSCOPI ÒPTIC: Té una font d’il·luminació inferior per o surten fotons, la llum passa per l'objectiu va cap a l'ocular fins arribar a l'ull.
1.microscopi òptic de fluorescència: detecta molec amb fluorocrom. la llum ve d'un lateral,la font d’il·luminacio és una làmpada de mercuri amb un filtre d'exitació( deixa passar nomes el color que volem), el color arriba al mirall dicroic i reflecteix la llum cap abaix, pasa per l'objectiu i arriva a la mostra, es diu epiescopia.
Els fluorocroms tenen longitud d'ona diferent de la que absorbeix, pex: si emitím llum blava, el flurocrom donarà llum verda. aquesta llum va cap amunt atravesant el mirall. si ilumines amb verd el fluorocrom emet llum vermell.
2.microscopi confocal: micro de fluorescencia però amb llum laser, no amb mercuri. té la ventatja de que llegeix l'espessor del tall a diferents altures i amb un software reconstrueix la imatge a 3D 14 Cristina Villalobos 2.MICROSCOPI ELECTRÒNIC Emet electrons per incandescència d’un filament, els electrons després de passar pel txt són condensats per un condensador de bobines electromagnètiques i arriben a una pantalla fosforescent. els electrons no podran travessar mostres amb metalls pesats com l'urani. La imatge obtinguda és en blanc i negre.
A. ME de transmissió (TEM): • permet observar les característiques dels teixits.
• La font d’il·luminació es troba a dalt i és un filament. S’aplica una diferència de voltatge i es produeix un arc d’ electrons. Aquests electrons mitjançant condensadors electromagnètics són enfocats cap al teixit.
Els electrons que travessen la mostra incideixen sobre una pantalla fosforescent que emetrà llum quan rebin l’impacte d’ un electró.
• Es necessiten talls ultrafins.
• L’observador mira des de avall B. ME de rastreig (SEM) • Serveixen per a observar superfícies tissulars • Els electrons quan cauen a la mostra ( que pot estar sencera) alguns reboten i altres s'absorbeixen.
1.TEM.
2.SEM 15 ...