Tema 2. Hibridacions dels àcids nucleics (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 21
Fecha de subida 31/03/2016
Descargas 6
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 2. HIBRIDACIONS DELS ÀCIDS NUCLEICS 1. GENERALITATS La majoria de tècniques d’anàlisi dels àcids nucleics es basen en part a un fenomen principal: les hibridacions. S’entén hibridació com la capacitat que tenen els àcids nucleics de formar estructures híbrides, ja que al trobar-se en forma de doble cadena poden desnaturalitzar-se, passar a estructura de cadena senzilla i així hibridar amb sondes i formar estructures hibrides. Les estructures hibrides, doncs, estan formades per dues molècules d’origen diferent. Amb les hibridacions el que es fa és genotipar, és a dir, determinar el genotip de l’individu juntament amb les seves variants al·lèliques. Les tècniques de genotipar en general es basen en: • • Amplificacions de seqüències concretes. Detecció d’una seqüència determinada. Es pot detectar la presència d’una seqüència concreta en la mostra que estem analitzant basant-nos en la hibridació molecular o amplificant una seqüència pel seu posterior anàlisi. Per exemple, les PCRs es basen en mecanismes d’hibridació molecular, utilitzant sondes força llargues per tal que hibridin amb seqüències de gran longitud. Per tant, podríem considerar les hibridacions com una de les proves base que s’utilitzen en molts estudis. Els àcids nucleics sempre presenten estructures de doble cadena, tant el DNA com l’RNA. Diagnòstic genètic molecular Els RNAs són de cadena senzilla però presenten regions internes amb complementarietat, les quals es repleguen formant estructures de doble cadena internes. Aproximacions generals pel genotipat Diagnòstic genètic molecular Estructures de doble cadena en els àcids nucleics Hibridació molecular TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 1 Hibridació molecular Tant el DNA com l’RNA es formen per complementarietat. El DNA presenta bases nitrogenades hidrofòbiques protegides, a la part interna, del medi exterior. Aquestes bases nitrogenades es col·loquen cap a dins i complementen entre sí depenent de la seva estructura química. Aquesta estructura es manté gràcies als ponts d’hidrogen. Ara bé, aquesta estructura de doble cadena es pot desestabilitzar, de manera que amb aquesta desestabilització aconseguim que la molècula d’àcid nucleic desnaturalitzi i es quedi en forma de cadena senzilla. En aquesta situació, les bases nitrogenades s’orientaran cap a l’exterior, desestabilitzant la molècula i passant a cadena senzilla o a una molècula de RNA sense complementarietat interna. Per aconseguir aquesta desestabilització hem de jugar amb les condicions de severitat del medi, augmentant-les. Per tant, si augmentem la severitat, desestabilitzarem les molècules de doble cadena aconseguint que es quedin en forma de cadena senzilla. Per contra, si les disminuïm, es tornen a formar aquestes estructures de doble cadena, tant Diagnòstic genètic molecular si es tracta de DNA com de RNA. Per tant, si nosaltres desnaturalitzem in vitro i seguidament renaturalitzem, per canvis de SEVERITAT severitat, podrem donar opció a que es formin estructures hibrides: dues cadenes formant una estructura de doble cadena però cada cadena d’origen diferent. SEVERITAT Hibridació molecular Els híbrids es poden fer entre: • DNA-DNA. • DNA-RNA. • RNA-RNA. Diagnòstic genètic molecular Estructures híbrides La diferència entre aquestes unions recau en que el grup hidroxil en el carboni 2’ de l’RNA (és la diferència principal entre ribosa i desoxiribosa, la qual comporta que la primera sigui més estable) fa que les unions siguin més fortes. Per tant, això comporta que els híbrids de RNA siguin més Tipus d’estructures híbrides d’àcid nucleic estables que els de DNA. En conseqüència, molts Major força d’unió • RNA-RNA cops s’utilitzen sondes d’RNA per treballar, ja • DNA-RNA que la seva estabilitat és major que la del DNA. • DNA-DNA Menor força d’unió Hibridació molecular Per tant, els investigadors prefereixen utilitzar sondes de RNA, en lloc de DNA, per detectar DNA. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 2 2. TIPUS D’HIBRIDACIONS Trobem dos tipus d’hibridacions principals: • • Hibridacions en solució. Hibridacions en suport sòlid. 2.1. HIBRIDACIONS EN SOLUCIÓ En aquest cas, utilitzem dues molècules, una de cadena doble (DNA) i una de cadena senzilla (RNA). En incrementar la severitat, aquestes molècules d’àcids nucleics desnaturalitzen i seguidament, si reduïm la severitat es donarà la renaturalització. Un cop produït aquest procés, les molècules de RNA i DNA hibridaran. En aquest tipus d’hibridació s’ha de jugar amb les concentracions. La concentració de cada molècula ha de ser l’adequada i suficient, ja que si hi ha poca concentració d’àcid nucleic, això Diagnòstic genètic molecular comportarà que al renaturalitzar hi hagi més probabilitats que cada molècula ho faci amb Hibridació sobre un suport sòlid sí mateixa (i d’aquesta manera tornaríem a la situació inicial). Per tant, en el cas de la PCR, haurem de posar quantitats d’encebador força elevada. A més hem de tenir en compte que les de RNA tindran més mobilitat que les de DNA perquè seran més petites i això també facilita la formació d'estructures híbrides abans que normals en la renaturalització. 2.2. HIBRIDACIONS EN SUPORT SÒLID Hibridació molecular Per evitar el problema de les concentracions anteriors, es pot evitar que les molècules d’àcids nucleics renaturalitzin amb sí mateixes, fixant sobre suport sòlid aquests àcids nucleics desnaturalitzats. Per tant, si es fixa, es facilita que la molècula desitjada trobi la seva seqüència complementaria en aquesta molècula desnaturalitzada. Aleshores, la hibridació en suport sòlid facilita la formació d’estructures hibrides. Per tant, el que fem es passar el DNA sobre un portaobjectes i el fixem amb Carnoy per a evitar la renaturalització de la pròpia molècula. D'aquesta manera després, quan incubem DNA amb la seqüència que busquem prèviament senyalitzat (amb sondes de colors) sobre els nostres portaobjectes amb el DNA "problema" es produirà la hibridació per complementarietat. Si no fixéssim sobre el suport sòlid la tendència seria renaturalitzar amb sí mateixa i per tant, la sonda no trobaria les sondes complementaries amb les que hauria d’hibridar. Per tant, la hibridació sobre suport sòlid facilita la formació d’estructures hibrides amb mes facilitat. Algunes tècniques treballen amb hibridació sobre suport sòlid i altres amb TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 3 solució (nomes juguen amb concentracions per facilitar la hibridació). Hem de tenir en Diagnòstic genètic molecular concentracions d’àcids nucleics reduïdes, haurem de realitzar compte que si tenim hibridacions en suport sòlid abans que hibridacions en solució. Hibridació sobre un suport sòlid X Hibridació molecular 3. PROCÉS DE DESNATURALITZACIÓ: TEMPERATURA Un altre aspecte a tenir en compte és la temperatura de fusió o melting. Aquesta temperatura va associada a la desnaturalització i s’ha de jugar amb les seves variacions. Quan incrementem la severitat de les condicions en que es troben les molècules d’àcids nucleics de doble cadena, al passar a cadena senzilla, els ponts d’hidrogen es trenquen. Aquest fet es pot aconseguir variant diferents factors ambientals, com per exemple, la temperatura. Diagnòstic genètic molecular Temperatura Hibridació molecular TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 4 Si s’incrementa la temperatura, incrementa l’energia necessària que s’ha de donar a la molècula per desestabilitzar els ponts d’hidrogen i trencar l’estructura de doble cadena. Les bases nitrogenades com que estan orientades cap a l’interior de l’estructura, absorbeixen menys part de la llum UV que si es troben a l’exterior. Per tant, si tens la mateixa quantitat de DNA en doble cadena i en cadena senzilla, aquest últim absorbirà una quantitat de llum molt més elevada. Diagnòstic genètic molecular L’absorbància, per tant, depèn de l’estructura del DNA i de la quantitat que n’hi hagi (a més quantitat de DNA, més absorbància). Per tant, si el DNA es troba desnaturalitzat absorbirà més quantitat de llum UV. Temperatura Això ens serveix per detectar canvis de doble cadena a cadena senzilla mitjançant l’observació d’absorbància en el seu punt màxim (el DNA absorbeix una quantitat de llum UV major a 260 nm). Aleshores, si augmentem la Hibridació molecular temperatura, tindrem una absorbància determinada i al desnaturalitzar, aquesta absorbància augmenta. En conclusió, es pot fer un seguiment de l’estabilitat d’aquestes molècules mitjançant canvis d’absorbància. Es coneix com temperatura de fusió o melting aquell punt on es produeix el canvi d’absorbància de cadena doble a cadena senzilla. Trobem que hi ha un rang de temperatures on aquesta desnaturalització es dona de forma gradual (desnaturalització per blocs). És a dir, hi haurà estructures parcialment desnaturalitzades dins d’aquest rang de temperatures i si aturem el temps a una temperatura determinada, les molècules de DNA es trobaran parcialment desnaturalitzades. Podem dir que l’estabilitat dels àcids nucleics depèn bàsicament de la quantitat de ponts d’hidrogen que mantenen unides aquestes cadenes. Quant més rica en GC sigui la cadena, més ponts d’hidrogen hi haurà i per tant, la unió entre les dues cadenes serà major. Dues molècules de la mateixa llargada però amb diferent percentatge en GC, serà més estable la que tingui un percentatge en GC més elevat. Per tant, serà necessària més energia per trencar aquests ponts d’hidrogen. Diagnòstic genètic molecular La desnaturalització (separació de les dues cadenes) es dóna per blocs depenent del contingut amb GC de cada bloc Meitat del DNA en ss i l’altra meitat en ds Hibridació molecular TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 5 Aquest fet comporta que la desnaturalització es doni en blocs, primer es desnaturalitzaran les seqüències més riques en AT i després les més riques en GC (velocitats diferents de desnaturalització). Per tant, la temperatura de fusió o melting pot ser major o menor en funció de la composició de bases nitrogenades. La temperatura de fusió ens indica la temperatura a la qual trobem la meitat d’estructures de les molècules d’àcids nucleics de la solució igualment desnaturalitzades, és a dir, les molècules presentaran el mateix grau de desnaturalització. Aquest fet s’utilitza en tècniques d’anàlisi de mobilitat electroforètica, ja que depenen del grau de desnaturalització. 4. FACTORS QUE AFECTEN A LES HIBRIDACIONS DELS ÀCIDS NUCLEICS La majoria de tècniques d’hibridació es basen en la capacitat de poder obtenir estructures hibrides dels àcids nucleics. Ara bé, per que es doni aquesta hibridació, hem de tenir en compte una sèrie de característiques que ajudaran a millorar els resultats que obtinguem. L’anàlisi depèn dels següents factors: • • Característiques pròpies de les molècules. Característiques pròpies del medi en el que es troben aquestes molècules. 4.1. CARACTERÍSTIQUES MOLECULARS Les característiques moleculars implicades en la formació de les estructures híbrides estan relacionades directament amb la quantitat de ponts d’hidrogen (forces hidrofòbiques), les quals permeten que l’estructura hibrida sigui estable. Per tant, les característiques moleculars que juguen un paper fonamental en aquesta hibridació són les següents: • • • Llargada de la molècula (nombre de nucleòtids). Quant més gran sigui el nombre de pb implicats en la hibridació, en principi, la quantitat de ponts d’hidrogen que es formin serà major i per tant l’energia necessària per poder desnaturalitzar aquesta estructura també serà més elevada. Grau de complementarietat (seqüència). A major complementarietat també comportarà que hi hagi un nombre de ponts d’hidrogen més gran, i aleshores, l’estructura serà més estable. És a dir, quant major sigui el grau de mismatch (aparellaments erronis), menor serà l’estabilitat d’aquesta estructura degut a que disminuirà el nombre de ponts d’hidrogen. Composició (percentatge en GC). Les seqüències més riques en GC presentaran un nombre de ponts d’hidrogen més gran que les que són menys riques, per tant, a més contingut en GC l’estabilitat també serà major. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 6 Modificacions químiques. Podem utilitzar monòmers que tenen variacions químiques. Normalment s’utilitzen desoxinucleòtids o ribonucleòtids, ara bé, Diagnòstic genètic molecular podem introduir variants químiques. Els oligopèptids normalment se sintetitzen Factors que afecten a les hibridacions dels àcids nucleics químicament i es poden utilitzar monòmers que introdueixin bases nitrogenades a l’esquelet peptídic (PNA). Els àcids nucleics que Característiques de les Característiques de molècules l’ambient tenen aquests monòmers, al presentar un esquelet • Llargada de la molècula • Temperatura peptídic (càrrega neutre, per tant, no estan carregats) (nombre de nucleòtids) • pH s’eviten les càrregues negatives i es forma una • Complementarietat • Concentració salina (seqüència) (cations monovalents estructura hibrida molt estable. En conseqüència, • Composició (percentatge com el Na+) de GC) • Agents desnaturalitzants augmenta la temperatura de fusió o melting i la seva • Modificacions químiques (formamida, Quan major és el percentatge formaldehid, urea, ...) de especificitat. GC major és el nombre de ponts • d'hidrogen i major l’energia que cal per trencar-los Hibridació molecular Si treballem amb oligopèptids, encebadors o oligo-sondes (és a dir, tot allò que no siguin sondes grans) podrem jugar amb la llargada sobretot per dissenyar els encebadors per les PCR’s. Quan es dissenyen els encebadors ens podem desplaçar al llarg de la seqüència per variar la seva composició, jugant amb la seva llargada. Diagnòstic genètic molecular També podem utilitzar àcids nucleics bloquejats (ANB o LNA), els quals es basen en presentar la ribosa modificada. Aquesta ribosa té un enllaç metílic extra (pont extra) que que afecten lesla hibridacions dels modificació àcids nucleics uneix el Factors carboni 4’ amb l’oxigen ade posició 2’. Aquesta dóna menys flexibilitat però més estabilitat (per tant, també incrementa la Tm). Com hem dit abans, si treballem amb temperatures de fusió elevades aconseguim augmentar l’especificitat. Aquestes són les característiques moleculars principals que intervenen en l’estabilitat de les estructures hibrides. Hibridació molecular 4.2. CARACTERÍSTIQUES DE L’AMBIENT • Temperatura. És el factor que més s’utilitza. A major temperatura, més inestabilitat dels ponts d’hidrogen i per tant, deriva en la desestabilització de l’estructura. Per tant, a més temperatura, menys estabilitat. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 7 • • • pH. A pH elevats els ponts d’hidrogen es desestabilitzen i en conseqüència també ho fan les estructures hibrides. Concentració salina (cations monovalents com el Na+). Quan major sigui la concentració salina, l’estructura hibrida serà més estable. El DNA està carregat Diagnòstic genètic molecular negativament, i per tant, una elevada concentració salina compensa les Factors que més afecten a les hibridacions carregues. És a dir, a major quantitat de cations (concentració salina elevada), més estabilitat tenen les estructures de doble cadena. Agents desnaturalitzants (formamida, formaldehid, urea, etc). Característiques de les Ca Omolècules Els agents desnaturalitzants s’utilitzen perquè desestabilitzen H C les estructures hibrides. Aquesta desestabilització es pot fer • Llargada la molècula • Tem NHde 2 formamida de nucleòtids) augmentar la temperatura però si s’augmenta massa podem (nombre • pH arribar al punt de fer malbé la mostra (com per exemple les • Complementarietat • Con (seqüència) (cati proteïnes). Ens interessa utilitzar els àcids nucleics a N • ComposicióH 2(percentatge com C O temperatures relativament baixes per no fer-los malbé, per de GC) • Age H 2N tant, si volem que les temperatures siguin baixes haurem (form urea form d’utilitzar agents desnaturalitzants. Per tant, a més agents desnaturalitzants, menys temperatura de fusió. Hibridació molecular Per altra banda, també es poden fer rentats per eliminar sondes que no hagin hibridat correctament. A concentracions salines baixes fer diferents rentats facilita la deshibridació. Per tant, l’astringència del medi en el qual fem l’anàlisi depèn de factors que nosaltres podem controlar (com els explicats anteriorment). Diagnòstic genètic molecular A continuació tenim una taula amb les característiques ambientals necessàries per tenir una astringència baixa o una astringència elevada: Com podem veure, si volem una astringència baixa, hem de posar una concentració salina elevada, una temperatura baixa i un pH del medi lleugerament àcid (si és molt àcid Hibridació molecular s’hidrolitzen els enllaços glucosídics, es perden les bases nitrogenades deixant lliures llocs apurínics i apirimidínics). Per contra, si volem augmentar l’astringència haurem d’incrementar el ph, la temperatura i reduir la concentració salina. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 8 Diagnòstic genètic molecular 4. FACTORS QUE AFECTEN LA TEMPERATURA DE FUSIÓ Factors que afecten a la Tm Els principals factors que afecten la temperatura de fusió són els següents: • • • • • • Composició en GC. Longitud de l’híbrid. Concentració salina. Percentatge de pb en mismatch. Concentració de DNA. Agents desnaturalitzants. Hibridació molecular A longituds elevades no veurem diferències, per tant, aquesta regla (major temperatura de fusió a major longitud) només es pot aplicar a longituds menors de 500 pb. Per altra banda, la quantitat de DNA no afectarà per res a la temperatura de fusió però sí que afectarà la rapidesa a la que es formen les estructures híbrides i la seva eficàcia. Hi ha moltes fórmules que permeten estimar la temperatura de fusió de l’estructura hibrida. Quan treballem amb oligopèptids serà més senzill, la casa comercial ja ens dona Diagnòstic genètic molecular la temperatura de fusió estimada (no l’hem de calcular). Hibridació molecular TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 9 Diagnòstic genètic molecular 5. APROXIMACIONS GENERALS PEL GENOTIPAT Aproximacions generals pel genotipat La majoria de les tècniques d’anàlisi d’àcids nucleics que ens permeten determinar els genotips dels individus es basen en: • Amplificació específica de seqüències concretes. • Reconeixement de la presència d’aquestes seqüències mitjançant hibridacions. Bona part de les tècniques que utilitzen sondes (molècules d’àcids nucleics) permeten distingir la presència d’una seqüència determinada per complementarietat ja que es formen aquestes estructures híbrides: hibridacions in situ, arrays, etc. Hibridació molecular La complementarietat dóna informació sobre la presencia d’aquella seqüència en la mostra que s’està analitzant i inclús variacions dins de la mateixa seqüència, sense necessitat de seqüenciar aquell àcid nucleic. 6. SONDES D’ÀCIDS NUCLEICS Son àcids nucleics que utilitzarem per identificar, localitzar o quantificar seqüències concretes. En funció de la quantitat de senyal que dona la sonda també es pot quantificar. 6.1. ÚS DE LES SONDES Primer de tot hem d’agafat una mostra que contingui àcids nucleics i a continuació utilitzem sondes per detectar la seqüència de DNA en concret, veure la seva ubicació i quantes còpies n’hi ha. Per generar una estructura híbrida el que primer s’ha de fer es desnaturalitzar, tant la mostra com les sondes. Si estem treballant amb ribo-sondes (sondes de RNA) també les hem de desnaturalitzar perquè aquestes presenten estructures de doble cadena al seu interior (complementa amb sí mateixa, ja que els RNAs a temperatures baixes es repleguen). Un cop fet això, incubem conjuntament la sonda i la mostra desnaturalitzada, de manera que augmentem les condicions de severitat. Per renaturalitzar s’han de disminuir les condicions de severitat. Com tot el conjunt de sondes i àcids nucleics ha estat incubat conjuntament poden hibridar entre ells. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 10 Diagnòstic genètic molecular Ús de les sondes Concentracions baixes de sonda dificulten l’obtenció d’estructures híbrides (no per la temperatura de fusió, sinó per l’eficàcia per trobar la sonda). Si volem evitar que es doni la renaturalització d’una molècula d’àcid nucleic amb sí mateixa el que hem de fer és realitzar una hibridació en suport sòlid, ja que no donem lloc a que es donin fenòmens de complementarietat entre les mateixes molècules. Hibridació i sondes Per l’anàlisi, tota la sonda que s’hagi renaturalitzat o hibridat inespecíficament estarà generant una senyal que altera l’anàlisi, afectant als resultats. Per eliminar aquesta senyal hem de fer rentats. La major part de la sonda se’n va amb els rentats. Ara, els rentats són bàsics, si fallen els rentats tindrem una senyal de soroll de fons que no permetrà analitzar els resultats. Diagnòstic genètic molecular 6.2. TIPUS DE SONDES Tipus de sondes Hi ha tres tipus principals de sondes: DNA, RNA i oligopèptids. Tipus de sondes d’àcids nucleics TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 11 Les sondes poden contenir certes modificacions químiques per fer més efectiu l’anàlisi. Obtenció de cada tipus de sonda: • • • Sondes de DNA. Les obtenim de processos de clonatge o amplificant per PCR. Sondes de RNA. Les obtenim a partir d’un DNA clonat amb un vector mitjançant processos de transcripció. Sondes d’oligopèptids. La seva obtenció es basa en síntesi química o directament demanant-ne a cases comercials. 6.3. TIPUS DE MARCATGE Hi ha dos tipus de marcatge principals: I.
II.
Marcatge radioactiu. Es basa en marcar isòtops de forma radioactiva. Marcatge no radioactiu. Es basa en la utilització de fluorocroms que emeten florescència o modificacions estranyes (biotina, digoxigenina o fluoresceïna) als nucleòtids. La fluoresceïna és la més econòmica i la biotina molt sensible a la quantificació. Les característiques del marcatge radioactiu són les següents: • • • Major sensibilitat. És el millor marcat que hi ha per quantificar (quantifica amb molta precisió). Fins fa poc, tots els processos de quantificació passaven per marcatge radioactiu. Tot i tenir poca senyal, arriba un moment en que aquesta es posarà de manifest, però farà falta força temps. A vegades el procés de detecció de senyal pot portar varies setmanes d’exposició per detecció d’autoradiografia d’aquesta mateixa senyal. Les característiques del marcatge no radioactiu són les següents: • • • Més segur. Necessita menys temps de detecció. Més econòmic. Per fluorescència sí que podem aconseguir una certa fiabilitat però mitjançant altres marcatges no radioactius, no. Si detectem la presència de sonda per cromogenia no hem de quantificar, ja que aquesta tècnica se satura molt ràpid i la quantificació no seria viable. Modificacions als nucleòtids Totes aquestes modificacions (grups químics) estan separades del nucleòtid per un espaiador (spacer) per tal que no interfereixin en la síntesis del nucleòtid ni afecti negativament la seva estabilitat. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 12 6.4. SÍNTESIS DE SONDES DE RNA Si volem tenir ribo-sondes haurem de realitzar una transcripció in vitro. Aquest procés es basa en la inserció del motlle de DNA (foregin DNA insert) en un vector (bacteriòfag pSP64) a la regió on es troba el poly-linker o MCS (multiple cloning site). Un cop s’ha inserit la seqüència de DNA desitjada, aquesta estarà sota el promotor del bacteriòfag (SP6 promoter). El que hem de fer a continuació és linealitzar la molècula. Per poder fer això, hi haurà un enzim específic (PvuII) que tallarà la seqüència per un punt de tall determinat. Podem veure que aquest punt de tall sempre es trobarà fora del MCS. Un cop tenim les molècules linealitzades es pot començar el procés de transcripció. Per fer això, hem d’incubar el bacteriòfag (ja linealitzat) en presència de la RNA polimerasa. Per sintetitzar la sonda s’hauran d’afegir nucleòtids marcats (en aquest cas, el nucleòtid marcat és l’UTP). Aleshores, s’anirà produint el procés de transcripció i obtindrem les Diagnòstic genètic molecular sondes de RNA marcades (per tal de poder-les identificar). En conseqüència, obtindrem seqüències de llargades diferents. Marcat de sondes de RNA Marcat de les sondes Sondes de RNA sentit i anti-sentit Si hem d’analitzar un RNA, hem de saber quina seqüència s’ha de transcriure. A la transcripció nomes es transcriu una seqüència, però si volem transcriure les dues podem utilitzar vectors que tinguin dos promotors orientats de manera oposada, un en cada cadena. En aquest cas SP6 i el T7. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 13 Diagnòstic genètic molecular Marcat de les sondes Marcat de sondes de RNA Un promotor permet la transcripció d’una cadena i l’altre promotor s’encarrega de la transcripció de la cadena complementaria: obtenció de sondes sentit i anti-sentit. Normalment els vectors venuts per les cases comercials solen tenir dos promotors, un en cada cadena. 6.5. SÍNTESI DE SONDES DE DNA Per obtenir sondes de DNA hem d’utilitzar polimerases de DNA. Per obtenir-les es fan servir tres mètodes principals: • • • PCR. S’utilitza per obtenir sondes més petites, continues i amb la regió que ens Diagnòstic genètic molecular interessa marcada. Aquesta forma d’obtenció ens condueix a obtenir una gran quantitat de sonda i de bona qualitat. Marcat de les sondes Nick translation. Random primed. Nick translation Tant el procés de nick translation com el de random primed ens permeten obtenir sondes PCR més grans (tot i que el primer s’utilitza per marcar les sondes més grans de totes). Tots els laboratoris tenen termo-cicladors que permeten dur a terme aquests processos. Random primed Marcat de les sondes Marcat de sondes de DNA per PCR Podem marcar les sondes de dues formes: • • Directament sobre el DNA genòmic. Mitjançant un vector i la seva amplificació. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 14 Diagnòstic genètic molecular Hi ha vectors que tenen poly-linker amb seqüències que amplifiquen qualsevol Marcat de sondes de . DNA per PCR amplificador universal seqüència: És a dir, els amplificadors universals són vectors que serveixen per amplificar qualsevol tipus de sonda que hagis clonat en el vector. Mitjançant PCR obtenim una gran quantitat de sonda, no és un factor limitat i la síntesi es du a terme en sentit 5’-3’. L’inconvenient d’utilitzar PCR és que no pot marcar sondes de més de 50 kb. Marcat de les sondes Diagnòstic genètic molecular Nick translation Nick translation En aquest procés s’aplica DNAsa I pancreàtica, la qual presenta activitat hidrolasa sobre la nostra mostra. Aleshores es produeixen trencaments aleatoris (nicks) al llarg de tota la seqüència (deixant els extrems 3’-OH lliures) i aquests espais són els que s’utilitzaran per iniciar la síntesi de cadenes de DNA. A continuació es tracta amb reductasa i s’incuba amb la polimerasa de DNA I d’E. coli. Aquesta polimerasa presenta dues activitats: • • Activitat polimerasa en sentit 5’-3’. Marcat de les sondes Activitat exonucleasa en sentit 5’-3’. La polimerasa utilitzarà els grups hidroxil lliures que estan en posició 3’ (originats pels nicks) per iniciar la síntesi de la nova cadena i anirà degradant, gràcies a la capacitat exonucleasa, la cadena antiga (que esta davant), sempre en sentit 5’-3’ (de forma que sintetitza la cadena nova per darrera). Per tant, se substituirà tot el DNA inicial per DNA nou. Hem d’incubar en presència dels quatre dNTP’s, necessaris per la síntesi, marcats (se sol marcar només un dels quatre). En conseqüència, tota la cadena nova que se sintetitza incorporarà la marca. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 15 Tres aspectes a comentar: • • • No hi haurà problemes de grandària ja que partim de DNA molt gran. Les sondes estaran fragmentades, és a dir, no seran continues. Això comporta que el resultat final seran fragments del DNA de partida. No hi ha cap tipus d’amplificació: no s’aconsegueix més DNA marcat del que has partit. Random primed Aquest mètode és força econòmic. El que s’ha de fer és desnaturalitzar el DNA (mitjançant altes temperatures en un termociclador) i seguidament baixar-la en presència d’hexanucleòtids de seqüència aleatòria, els quals podran hibridar en múltiples posicions del motlle. Aquests hexanucleòtids s’utilitzaran com encebadors de l’extrem 3’. En aquest cas, en klenow és una modificació lloc d’utilitzar la DNA polimerasa I utilitzarem la klenow. La Diagnòstic genètic molecular d’aquesta polimerasa a la qual se l’extreu la subunitat encarregada de l’activitat exonucleasa, de manera que només tindrà activitat polimerasa. S’utilitza moltíssim en Random primed genètica molecular. Tot això es fa en presència dels 4 dNTP’s, un d’ells marcats. La klenow quan arriba als extrems 3’ lliures no digereix, sinó que s’atura: aconseguim fragments de DNA de diferents grandàries (tots marcats pels dNTP). s sondes En aquest cas tampoc hi ha amplificació i aconseguim com a molt, la mateixa quantitat de DNA marcat que el de partida. La sonda que s’obté està fragmentada. Aquests fragments, en el total, formen tota la seqüència. Al final obtindrem el mateix que amb els mètodes anteriors però de forma fragmentada. La hibridació serà la suma dels diferents fragments que s’hagin format. Si treballem amb hibridacions in situ fluorescents o pintats cromosòmics (tècniques citogenètiques), que pinten regions més grans, la forma més fàcil de cobrir totes aquestes regions és mitjançant nick translation. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 16 Diagnòstic genètic molecular 6.6. SÍNTESI DE SONDES D’OLIGOPÈPTIDS – END LABELLING End labeling Els oligopèptids se sintetitzen químicament o es demanen a cases comercials. Si els volem marcats, hem d’especificar a les cases comercials que ho facin, si no, ho haurem de fer nosaltres. kinases transferases lligases Marcat de les sondes l’intercanvi de Els processos d’obtenció de sondes d’oligopèptids marcades es basen en grups fosfats entre els diferents extrems. Aquests intercanvis els realitzen uns enzims en concret: kinases i transferases lligases. Com es poden marcar els dos extrems, diferenciem entre: • • 5’ end labeling. 3’ end labeling. 5’ end labeling És el marcatge més típic. Es basa en l’intercanvi de grups fosfats marcats radioactivament entre els extrems 5’. El que es fa és afegir ATP marcats amb isòtops radioactius del fòsfor (γ-32P), concretament al fosfat gamma. D’aquesta manera, les kinases s’encarregaran genètic molecular d’intercanviar aquest Diagnòstic grup fosfat marcat amb l’extrem 5’ de la seqüència de DNA. En conseqüència, l’ATP quedarà sense marcar i la seqüència de DNA quedarà marcada a 5’ End labeling l’extrem 5’ tal i com veiem a la imatge que hi ha a continuació: [ϒ-32P]ATP Bacteriophage T4 polynucleotide kinase Podem marcar oligonucleòtids, DNA i RNA Marcat de les sondes Encebador per PCR TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 17 D’aquesta manera ja tindrem l’oligonucleòtid marcat i el podrem utilitzar com a encebador. Si volem tenir una sonda petita marcada a l’extrem 5’, marquem els encebadors en 5’ i llavors amplifiquem. Això ens permet modificar tot el producte que amplifiquem mitjançant l’encebador. És a dir, qualsevol modificació es pot aconseguir, en molts casos, modificant l’encebador. Per contra, si volguéssim marcar radioactivament mitjançant random primed podríem utilitzar ATP, però en aquest cas hauríem de marcar el fosfat alfa (ja que es troba a la posició 3’, perquè es tracta del fosfat que forma part de la cadena que s’haurà de sintetitzar). Si només marquem un dels oligopèptids i l’altra no, tindrem una sonda d’una sola cadena. Per altra banda també es poden marcar dos encebadors de forma diferent, obtenint dues sondes, una per a cada cadena, distingibles pel seu marcat (ja que molts cops únicament ens interessa una de les dues cadenes). 3’ end labeling Diagnòstic genètic molecular També podem marcar l’extrem 3’. Per realitzar aquest marcatge utilitzem la transferasa 3’ End labeling terminal (TdT), la qual afegeix nucleòtids a l’extrem 3’ sense necessitat de cap motlle i per tant, només ens quedem amb uns quants nucleòtids marcats. Transferasa terminal (TdT) que afegeix nucleòtids a l’extrem 3’ del DNA Lligasa d’RNA terminal A part d’aquesta TdT, en alguns casos també s’utilitzen lligases d’RNA terminals, les quals permeten incorporar nucleòtids modificats a l’extrem 3’ (com la biotina), per tal que la sonda es fixi en un suport que la retingui. de les sondes Marcat TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 18 És interessant marcar l’extrem 3’, ja que hi ha diferents enzims que permeten continuar la síntesis d’aquest extrem sense necessitat d’un motlle. Si volem utilitzar els oligopèptids per crear encebadors han d’estar marcats a l’extrem 5’, però no al 3’ (punt més crític de l’encebador). Això és degut a que si no aparella bé, no hi haurà síntesi de DNA. Diagnòstic genètic molecular 3’ Fill-in end labeling 6.7. 3’ FILL-IN END LABELING Es tracta d’un procés més senzill. Partim d’una sonda clonada i alliberem el vector en un enzim que deixi els extrems cohesius lliures. És a dir, el primer que fem és digerir un insert amb enzims que deixin els extrems cohesius lliures (un exemple seria EcoRI). Per clonar-ho en un altre vector ens interessa deixar els extrems roms com a diana. ¿Com es deixen els extrems rom? Emplenem el tros que falta amb la Marcat de les sondespolimerasa klenow d’E. coli (la utilitzem per transformar els extrems cohesius en roms). A continuació el que es fa és ampliar amb aquesta polimerasa (una vegada havent alliberat els extrems) amb els nucleòtids que falten. Si sabem la seqüència que falta, el que fem és afegir els dNTP’s necessaris per sintetitzar el fragment en qüestió i d’aquesta forma els extrems 3’ quedaran marcats. Queden marcats els extrems 3’ perquè la polimerasa klenow sintetitza en sentit 5’-3’. Es tracta d’una manera molt senzilla i molt ràpida de marcar la sonda a l’extrem 3’. És a dir, s’utilitza aquesta polimerasa klenow per emplenar els extrems cohesius i transformar-los en extrem roms. Si hi ha una diana única a la part interna de la sonda haurem de digerir. Aleshores, dels dos fragments resultants, una cadena en una estarà marcada però en l’altra no, de manera que podrem tenir una sonda d’una cadena i una sonda de l’altre. Per tant, no detectarem la senyal de la sonda que no estigui marcada. Al final tindrem una sonda per cada cadena tot i que no seran complementaries perquè una estarà marcada i l’altra no. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 19 6.8. MÈTODES DE DETECCIÓ DE SONDES Podem detectar les sondes de forma: • • Directa. Marquem perquè volem detectar i la detecció dependrà de la marca. Si el marcat té algun tipus d’activitat pròpia que puguem detectar per algun mètode (com radioactivitat per fluorescència), la detecció es basarà en detectar aquesta activitat de forma directa. Diagnòstic genètic molecular Indirecta. Si utilitzéssim dinitrofenol, biotina o digoxigenina, com que no tenen una activitat determinada que permeti la seva identificació, el que es fa és una Detecció de les sondes detecció indirecta emprant anticossos o molècules afins per aquell grup químic (aquestes molècules afins presenten una activitat característica que es pot detectar). Directa • Radioactivitat • Fluorescència Major sensibilitat Pèrdua d’activitat Major cost Major preparació del personal (major risc) • Anticossos Indirecta • Molècules afins Menor sensibilitat Major duració Menor cost Menor preparació del personal (menor risc) Detecció de les sondes Mètodes indirectes Tindrem un grup químic que per sí no te activitat i per tant, després dels rentats posteriors a la hibridació no podrem passar directament a la detecció. Per aquest fet, haurem de fer noves incubacions. Això implica incubar en presencia d’un intermediari: • • Anticòs que reconeix aquests grups químics que nosaltres hem introduït amb la sonda Molècula amb elevada afinitat. Un anticòs tampoc te activitat per sí mateix, per tant haurem de conjugar aquest intermediari amb algun grup químic que tingui alguna activitat. Un exemple seria un fluorocrom que detecti la fluorescència. Per altra banda, també podem fer varies incubacions: anticòs contra el primer anticòs. D’aquesta forma podem obtenir varies capes de detecció i en conseqüència amplifiquem el senyal. Per tant, no sempre necessitem marcar directament la sonda. Un dels avantatges dels mètodes indirectes és que la detecció es pot fer quan es vulgui ja que sempre tindrem el fluorocrom en condicions i a més, podrem amplificar el senyal. TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 20 Ens podem trobar en el cas d’enzims que presentin grups químics amb activitat enzimàtica, com per exemple, la fosfatasa alcalina. Per detectar la presència de la fosfatasa alcalina hem de treballar en un medi on hi hagi substrat sobre el que actuï la fosfatasa alcalina. En aquests casos, si en el medi hi ha substrat ric en fosfat, quan es doni la reacció enzimàtica aquest es tornarà insoluble i precipitarà: detectarem per color del Diagnòstic genètic molecular precipitat. Mètodes indirectes Simplement, quan perd el grup fosfat emet un fotó de llum fluorescent o visible. Es pot detectar per llum fluorescent o luminescent. Després del rentat, passem a una o varies incubacions en funció dels intermediaris que hi intervinguin i dels respectius rentats de cada incubació. detecció fluorescent o luminescent es pot detectar. Després del rentat passem a una o varies incubacions en funció dels intermediaris i en funció dels respectius rentats de cada incubació. Incubacions de detecció Rentats Detecció de les sondes El soroll de fons mesura l’activitat del grup químic que nosaltres hem conjugat (anticòs) o el grup químic per afinitat pel marcat que hem utilitzat. Per tant, aquest fet allarga la detecció perquè implicarà successives incubacions i rentats posteriors. Per tant, s’augmentarà el temps necessari per dur a terme aquest mètode de detecció indirecte. 6.9. CARACTERÍSTIQUES DE LA DETECCIÓ PER LUMINSCÈNCIA La detecció per luminescència pot ser: Detecció per luminescència no radioactiva (quimioluminescència). Aquesta detecció dóna bons resultats en quant a precisió i sensibilitat, però no tant com radioactiva. El punt a favor d’aquesta detecció és el poc temps d’exposició Diagnòstic la genètic molecular necessari (en contraposició a les setmanes necessàries si es realitza detecció per luminescència radioactiva). • Detecció per luminescència radioactiva (autoradiografia). Aquesta detecció la utilitzem quan ens interessa obtenir una gran precisió i molta sensibilitat. • La detecció cromogènica no serveix per gran cosa, únicament per detectar la presència/absència del que estem analitzant. Detecció de les sondes TEMA 2. Hibridacions dels àcids nucleics 21 ...

Comprar Previsualizar