tema 2 javier (2) (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Santiago de Compostela
Grado Biología - 4º curso
Asignatura evolución humana y diversidad molecular
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 26/06/2017
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Este hueso probablemente tenga contaminación humana. Mezcla de ADN de diferentes tipos de procedencia. Lo primera hay que hacer un proceso de reparar los bordes y a partir de aquí se añaden los adaptadores, y lo que vamos a tener es una biblioteca de ADN (conjunto de fragmentos que hemos obtenido a partir de un resto biológico, lo ideal sería que procedan de un único individuo). A partir de esta biblioteca e puede realizar un proceso de secuenciación.
En muchos casos se hace previamente una amplificación de los fragmentos. A partir de aquí se van a obtener una serie de secuencias. Lo blanco es ADN no amplificado, lo gris con ADN microbiano, lo rojo con ADN contaminante y el azul con ADN neandertal NGS se refiere a secuenciación masiva (Next generatios sequency) Secuenciación de alto rendimiento de genomas antiguos ofrece ventajas considerables pero también limitaciones importantes  Ventajas: 1. No es necesario un paso previo de amplificación específica (PCR directa) El ADN extraído se transforma directamente en una biblioteca de fragmentos de ADN añadiendo adaptadores a cada extremo de los fragmentos  secuenciación 2. Se pueden utilizar adaptadores específicos para detectar contaminación de otras bibliotecas 3. Los adaptadores permite amplificación de la biblioteca de fragmentos antes de la secuenciación utilizando sitios de hibridación de primers de PCR presentan en los adaptadores secuenciación más eficaz 4. Reamplificación de alícuotas de la biblioteca fuente inagotable de ADN TEMA 2: ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) 5 5. Utilizando oligonucleótidos específicos pueden enriquecerse las librerías con ADN antiguo y secuenciarlas a continuación -> así se consiguen porcentajes mucho mayores de secuencias de fragmentos de ADN antiguo o De estas manera se han secuenciado genomas casi completos a partir de ADN antiguos, con menos de 50 mg de materias fósil o Para secuenciar unos cientos de bases de ADN-mt de Neandertal utilizando métodos previos se necesitó casi 1 gramo de hueso 6. La gran mayoría de ADN antiguo son demasiados cortos para ser utilizados en una secuenciación basada en PCR  pero son ideales para secuenciación de alto rendimiento ADN moderno tiene que ser fragmentado artificialmente  con ADN antiguo este paso puede ser omitido 7. Bajo tamaño de fragmentos de ADN antiguo  secuencias completas desde ambos extremos  se secuencias las dos cadenas  se reduce el nivel de errores en las secuencias 8. Fragmentos de ADN modernos contaminante con alto tamaño  se secuenciarán con menos eficacia durante la secuenciación de alto rendimiento 9. Se producen una gran cantidad de secuencias de fragmentos de ADN independientes (con diferentes puntos de inicio y final) que se solapan en posiciones concretas del genoma  fuente de información sobre posibles contaminación de ADN moderno  difícil de detectar por su similitud con ADN de humanos antiguos TEMA 2: ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) 6 o o o o Comparación ente la secuencia de ADN mt consenso humano y secuencias obtenidas a partir del ADN extraído de un humano hace 30.000 años (Konstenki, Rusia) Se identificaron posiciones en las cuales más del 99% de los humanos moderno presentan un nucleótido diferente a la secuencia consenso de Kosteenki Todas las secuencias de fragmentos de Kostenki que abarcan una de estas posiciones y que presentan un nucleótido diferente al consenso de Kostenki probablemente proceden de contaminación de ADN moderno En este caso 1/16 (1/77 para todas las secuencias de KostenKi)  bajo nivel de contaminación de ADN contemporáneo ADN mt se Neandertal difieren en al menos 133 posiciones de todos los ADN mt contemporáneos humanos Secuencias del genoma Neandertal  unos 27.000 fragmentos independientes de mtDNA abarcan al menos una de estas 133 posiciones  <0.2% coincidían con el nucleótido humano  estima muy precisa de la contaminación (muy baja) De manera similar, la detección de ADN de cromosoma Y en secuencias procedentes de muestras femeninas se puede utilizar para cuantificar la cantidad de contaminación por ADN moderno TEMA 2: ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) 7 Los genomas antiguos que se ha secuenciados hasta la fecha presentan estimas de contaminación < 1%, derivada de un elevado número de fragmentos informativos  estima fiable Conclusión: operarios humanos manejando restos antiguos  riesgo de contaminación  NGS proporciona medios para valorar el nivel de dicha contaminación  Limitaciones 1. Enorme variación del porcentaje de ADN endógeno que procede del organismo deseado  Incluso a partir de la misma excavación pueden existir variacioens desde cai el 100% a <0.1%  La cantidad de información obtenida a partir de diferentes restos puede varias en gran medida  Genoma de Mamut: se necesitaron 30 millones de fragmentos de restos con un porcentaje de ADN endógeno > 90%  Borrador del genoma del Neandertal: 1500 millones de fragmentos de restos con un porcentaje de ADN endógeno <5%  La alta calidad de los resultados de resto de permafrost (mamut , restos de equimales antiguos) sugieren que el frío mejora la obtención de ADN genómico antiguo 2. El ADN antiguo se ve afectado por daños químicos post-morten que cambian la estructura de la molécula de ADN e inducen la incorporación de nucleótidos erróneos durante el proceso de secuenciación  Daño principal: deaminación de la citosina (C U) -> las Cs se confunden con Ts  Hay que tener en cuenta estos errores sistemáticos en los modelos de análisis, para corregir estos cambios falsos en el ADN de organismos antiguos  Se pueden utilizar una polimerasa que no replica el uracilo, pero entonces de disperarián la mayoría de fragmentos de ADN antiguos que contiene U  problema en muestras con muy poco ADN  solución: reparación de las Us utilizando uracil DNA glicosilasa  elimina los U y el hueco que queda lo repara una endonucleasa VIII  Los patrones de incorporación errónea de U pueden ser útiles para diferenciar ADN antiguo de moderno  La contaminación de ADN moderno en muestras de Neandertal produjo fragmentos de ADN con baja tasa 8 vece menor de desaminación de la citosina, con respecto al ADN Neandertal endógeno  método para valorar la autenticidad de secuencias de ADN derivadas de restos antiguos  Necesario investigar la tasa de incorporación de nucleótidos erróneos para no confundir ADN procedente de contaminaciones antiguas (por ejemplo en muestras recogidas en el S. XIX) con ADN endógeno auténtico TEMA 2: ANÁLISIS DE LA VARIABILIDAD GENÉTICA A NIVEL GENÓMICO (GENOME-WIDE DATA) 8 ...