Tema 2 (2013)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Tècniques Instrumentals Avançades
Año del apunte 2013
Páginas 19
Fecha de subida 17/10/2014
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María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 UNIDAD 2: SEDIMENTACIÓN I CENTRIFUGACIÓN INTRODUCCIÓN Diariamente durante el trabajo en el laboratorio es necesario realizar procesos de separación como por ejemplo para obtener suero sanguíneo, leucocitos, análisis clínico, aislamiento de mitocondrias, entre otras. Estas separaciones se realizan al aplicar un campo centrífugo, lo que se conoce como la técnica de centrifugación. Entendemos por sedimentación al transporte de una partícula en solución bajo la acción de un campo centrífugo.
Es una técnica muy importante basada, tal como hemos dicho anteriormente, en la creación de campos gravitatorios artificiales (más intensos que los terrestres) gracias a una aceleración centrífuga, lo que provocará una sedimentación de la muestra en cuestión.
Existen modelos muy sofisticados como la centrífuga analítica que nos permite observar el proceso de sedimentación mediante un sistema óptico (luz fluorescente o láser) por lo que podemos obtener una gráfica de la concentración respecto el radio. Gracias a experimentos realizados mediante esta maquinare se pudo determinar el número de Avogadro o dar validez a leyes de gases.
Esta técnica instrumental nos permite calcular la masa molecular de una partícula mediante dos métodos diferenciados:  Método de la velocidad de sedimentación (necesitamos el coeficiente de sedimentación)  Método del equilibrio de sedimentación CENTRÍFUGAS La centrífuga es el instrumento que utilizamos para llevar a cabo un experimento de sedimentación. Debemos diferenciar entre dos tipos de centrífugas básicas, que sirven para realizar diferentes separaciones:  Centrífugas preparativas: permiten la separación de compuestos biológicos  Centrífugas analíticas: permiten caracterizar un material que previamente ha sido purificado 1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Centrífuga analítica La diferencia entre una centrífuga analítica y una convencional es que en la primera podemos seguir el proceso de sedimentación mediante unas celdillas de sedimentación, que son como unas ventanas transparente que nos permiten observar el proceso o bien a simple vista o mediante luz ultraviolada.
Este tipo de centrífuga (modelo más nuevo) presenta un sistema óptico que nos permite seguir el desplazamiento de las moléculas y a la vez nos permitirá determinar el peso molecular, el coeficiente de sedimentación, la pureza… Este procedimiento requiere de un sistema especial en el que las celdillas tienen ventadas de centrifugación compuestas por cuarzo o zafiro que nos dan la concentración en el interior de la celdilla en función del radio.
Tenemos una lámpara de xenón que cubre todo el espectro de luz y mediante un monocromador elegiremos la longitud de onda que nos interesa en cada experimento. El haz de luz traviesa la celdilla y encontraremos un detector ISFRS que elaborará un escáner del interior de dicha celdilla, lo que se elabora es un escáner radial que nos permite conocer la concentración a partir del radio. Durante la experimentación lo que se elaborará es determinar la concentración en función del radio mediante un conjunto de escáneres.
Debemos tener presente que no todas las moléculas absorben luz de manera que, aquellas que no tienen la capacidad de absorber las seguiremos por su índice de refracción.
Dichos datos nos permitirá hacer un gráfico de la absorbancia (que va aumentando hasta estabilizarse en un punto) por lo que veríamos un perfil que se desplaza hacia radios más grandes hasta estabilizarse.
Aceleración o campo centrífugo Debemos entender que la fuerza centrífuga que se aplica sobre la suspensión de partículas es una fuerza relativa ya que se refiere a la fuerza del campo gravitatorio, por lo que, la denominaremos como fuerza centrífuga relativa (FCR) y queda representada como: La relación entre las dos fuerzas de gravedad es un parámetro adimensional, pero la fuerza centrífuga relativa se expresa 2 en unidades de gravedad, en m/s . Generalmente nos referimos al campo centrífugo como 4000·g lo que significa que es un campo centrífugo 4000 veces más grande que la gravedad. Para que tengamos una idea 4000g es un campo adecuado para sedimentar núcleos mientras que si queremos obtener son los ribosomas deberemos aplicar un campo de 10000g.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN El coeficiente de sedimentación es muy importante para caracterizar a una macromolécula (los ribosomas se caracterizan mediante este).
Fuerzas que actúan sobre la partícula Supongamos una partícula esférica de masa m y radio r que se encuentra en disolución y que gira manteniendo un movimiento circular uniforme, por lo que tiene una velocidad angular (ω) respecto al eje situado a una distancia x. En el transporte de esta partícula actúan las siguientes fuerzas:  Fuerza centrífuga o centrípeta: consideramos que es positiva porqué lleva 2 las partículas más allá del radio. Tiene como fórmula Fc = m·ω ·x  Fuerza de fricción: esta fuerza está en la misma dirección que la fuerza de flotación pero en sentido contrario motivo por el cual la consideramos como negativa. Es proporcional al coeficiente de fricción, -f (para un determinado volumen el coeficiente de fricción más pequeño es el de las esferas) i a la velocidad. Queda determinado por la fórmula Ff = -v·f = -6·π·ŋ·r(max)  Fuerza de flotación: la consideramos negativa porqué direcciona las partículas a un lugar más pequeño que el 2 2 radio. Tiene como fórmula Fb=- ω ·r·V·(ρ-ρ0) = - ω ·r·m0 Siendo: f el coeficiente de fricción, ŋ la viscosidad del medio, ρp i ρm la densidad de la partícula y del medio correspondientemente. Durante el estudio debemos tener presente que no se evalúa la fuerza de gravedad.
La fuerza resultante cada vez debería ser más grande, la velocidad debería ir aumentado pero debemos tener presente que esta se mantiene constante en velocidad máxima puesto que se las tres fuerzas quedan compensadas (el equilibrio de fuerzas es nulo).
Cálculo del coeficiente de sedimentación Recordamos que teníamos un equilibrio de fuerzas durante la sedimentación: Podemos elaborar una aproximación de esta ecuación substituyendo el volumen por el volumen específico parcial, que lo podemos definir como: 3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Reescribimos la ecuación anterior para hallar el coeficiente de sedimentación: 23 Multiplicamos la expresión por el número de Avogadro (N A=6,023·10 ), para obtener el coeficiente de sedimentación (S) definido como: Observamos que el coeficiente de sedimentación está relacionado con el peso molecular (Mr) aunque este no lo podemos calcular directamente puesto que en la misma ecuación aparece también el coeficiente de fricción, que depende del tamaño y forma de la partícula.
Expresión del coeficiente de sedimentación Este coeficiente está determinado en unidades de segundo pero son del orden de 10 -13 segundos, lo que recibe el nombre de Sredberg (se llama así la unidad puesto que fue el investigador que construyó la primera centrífuga analítica).
Generalmente el coeficiente queda expresado como: En que el superíndice i el subíndice hacen referencia a la estandarización de dicho coeficiente Superíndice 0 Este superíndice hace referencia a la estandarización a concentración 0. Al medir el coeficiente de sedimentación en función de la concentración en algunas moléculas nos podemos encontrar una medida horizontal aunque debemos tener presente que generalmente encontremos una situación en la que a medida que la concentración aumenta el coeficiente de sedimentación va disminuyendo (podemos elaborar una recta patrón decreciente).
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 En las moléculas biológicas cargadas o de carácter polar existe una gran dependencia entre la concentración y el coeficiente de sedimentación y por lo tanto, es muy importante extrapolar al valor de concentración 0. La dependencia se debe a que las moléculas con carga solvatan muchas capas de agua por lo que tendrán densidades mayores lo que causará que las moléculas reinas (partículas que estudiamos) tendrán más dificultad para moverse por el disolvente.
Debemos tener presente que el agua adquiere una estructuración y organización importante, lo que le da una estructura de sólido, aumenta la viscosidad del aigua (densidad local de disolvente grande) y por lo tanto también aumenta la fuerza de fricción. Esto también sucede con las moléculas apolares pero tienen una dependencia despreciable.
Otro aspecto a tener en cuenta es la concentración de sales que tenemos en disolución; es aconsejable no medir el coeficiente de sedimentación si dicha concentración es superior a 0,1M de NaCl puesto que la sal apantalla las cargas y por lo tanto ya no se puede observar la dependencia de cargas con el coeficiente.
Superíndice W, temperatura Para empezar debemos entender que W nos indica que la medida la hacemos en condiciones de la disolución de agua a 20ºC. Cuando se indica 20,W se nos informa que de la viscosidad y que 20 es la temperatura a la cual el experimento ha sido estandarizado.
Temperatura 20ºC es la utilizada en la mayoría de experimentos y debemos tener presente que la viscosidad del medio depende de ella. Las ultracentrífugas analíticas tienen un sistema muy sofisticado de medición de la temperatura (del orden de décimas de grado). Para aclarar conceptos: tanto la temperatura de medición como el disolvente están a 20ºC.
Debemos aclarar que si no podemos cumplir las características 20,W existe una fórmula que te permite encontrar Sº a partir de una determinada S.
DETERMINACIÓN DEL COEFICIENTE DE DIFUSIÓN EXPERIMENTALMENTE Elaboraremos el siguiente montaje de experimentación: Estableceremos una situación en la que tengamos un disolvente y una disolución. La disolución estará compuesta abajo por las moléculas de soluto y más arriba por el disolvente (de la disolución), esta estará en contacto con el disolvente.
Cuando añadimos el disolvente lo debemos hacer siempre sin alterar la interfase. Este sistema inicial tiene un máximo de energía libre i un mínimo de entropía por lo que no es estable. Termodinámicamente el sistema evolucionará hacia disminuir la energía libre y aumentar la entropía, lo que generará que en el tiempo obtendremos una disolución homogénea que presente una energía libre mínima y una máxima entropía.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Debemos crear esta situación para poder calcular el coeficiente de difusión y se hará con una centrífuga que presente una velocidad pequeña (alrededor de 500 rpm) para evitar que las moléculas sedimenten. Este procedimiento requiere de unas celdillas especiales, denominadas celdillas de frente sintética, que tienen un sector de sedimentación que llenamos con la disolución (son celdillas con una ventanas a través de las cuales se observa el proceso de sedimentación). Este sector está unido a un depósito en el que introducimos el disolvente a través de un capilar. Si la centrífuga está parada el disolvente no puede pasar por el capilar mientras que si la centrífuga está en movimiento (a una velocidad baja para que Fc aumente) vencerá la resistencia y tensión superficial por lo que se depositará sobre la disolución sin alterar la interfase (en realidad existe una pequeña alteración).
En determinar el coeficiente de difusión observaremos una campana Gausiana viendo cómo a lo largo del tiempo se ensambla y disminuye su altura. La superficie siempre será la misma ya que tiene relación con la concentración de la disolución mientras que la campana se ensancha (la evolución será más o menos rápida en función de S). Observamos el gráfico del cambio de la concentración respecto la coordenada X.
Para determinar el coeficiente de difusión realizaremos una gráfica en la que representaremos:  Eje de ordenadas (y):  Eje de abscisas (x): tiempo Observamos como la altura va disminuyendo y el área de la superficie se mantiene constante por lo que el valor del eje de ordenadas cada vez será mayor. Las partículas más pequeñas difunden más rápido; a medida que una molécula se aleja de la esfericidad esta se difunde más lentamente.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Expresión del coeficiente de difusión Expresamos el coeficiente de difusión de igual manera que expresamos el de sedimentación: Este superíndice significa que debemos repetir el experimento varias veces a diferentes concentraciones para poder extrapolar el coeficiente de difusión a concentración 0.
MÉTODOS PARA CALCULAR Mr Método de la velocidad de sedimentación Supongamos el siguiente esquema de disolución homogénea que se va centrifugando: En tiempo t=0 la solución es homogénea pero cuando la centrífuga se pone en marcha las moléculas tienden a ir hacia un radio más grande i por lo tanto se irán acumulando progresivamente en el fondo, teniendo en tiempo t=1 una zona que ya no contiene ninguna molécula.
Podemos seguir como avanzan las moléculas midiendo el avance del frente de sedimentación: Si representamos la absorción a lo largo del tiempo observaremos que cada vez existe un frente de sedimentación (radio) más grande porqué este avanza. También podemos representar la concentración en función del radio (observamos lo mismo).
Debemos tener presente que nosotros mediremos el avance del frente de sedimentación a lo largo del tiempo y que este en el tiempo se desdibuja porque aparte del movimiento hacia abajo el sistema tiene una temperatura determinada puesto que las partículas son térmicas y se desplazan en todas las direcciones debido a esta energía, esto provoca que las partículas tengan una tendencia a volver a la situación de equilibrio (es un proceso de difusión). Observamos en el siguiente gráfico que a medida que transcurre el tiempo la gráfica se desplaza hacia lugares con radios mayores: Este tipo de gráfico es el que nos permite calcular, mediante el equilibrio de sedimentación, la masa molecular de la muestra problema.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Para determinar la velocidad máxima de sedimentación experimentalmente debemos elaborar un frente de sedimentación, tal como se ha indicado en los esquemas anteriores. Dicho frente aparecerá en t=1 puesto que tendremos un espacio libre de moléculas problema.
Entenderemos como velocidad de sedimentación al cambio de radio de sedimentación respecto del tiempo. Inicialmente esto se elaboraba mediante fotografías pero actualmente sabemos que se mide mediante un sistema óptico que elabora un escáner radial (centrifugación analítica) que nos permite observar como la interfase se va desplazando.
La velocidad, determinada anteriormente es: El frente cada vez será más difuso a causa de la difusión de las partículas, que chocan entre ellas (los choques aumentan con la compactación) lo que provoca que el frente se vaya ensanchando. Presentaremos un esquema como el siguiente: Las partículas que no absorben la luz se trabajan mediante el índice de refracción con lo que obtenemos una grafica lineal creciente (representación de n-[x]).
Recordamos que la velocidad queda definida como la derivada de la posición respecto del tiempo y que el coeficiente de sedimentación quedaba expresado como: por lo que tenemos: La máquina nos dará la siguiente gráfica en la que obtenemos una línea recta que extrapola el radio del frente de 2 sedimentación a tiempo t=0 i una pendiente que equivale a ω S, gracias a la cual podremos calcular el coeficiente de sedimentación.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 En centrifugación se trabaja siempre en (cm) por convenció y el coeficiente de sedimentación (S) calculado servirá para calcular la masa molecular de la partícula puesto que sabemos que: No podemos obtener el valor de la masa molecular de la partícula directamente puesto que desconocemos el coeficiente de fricción, que depende tanto del tamaño como de la forma de la partícula, por lo que deberemos encontrar otra manera de calcular la masa molecular.
El coeficiente de difusión (lo veremos más adelante) queda definido como: Dividiremos las dos ecuaciones anteriores para obtener: Por lo tanto, podemos calcular el coeficiente de sedimentación siempre que tengamos o definamos el coeficiente de difusión (D). Cuanto menores son las moléculas más rápido difunden y según su forma esta difusión puede ser más o menos rápida. Por lo general, las moléculas esféricas son las que difunden más rápido.
Cuanto mayor sea la masa molecular más pequeño será el coeficiente de difusión. No encontraremos una relación línea entre ambos parámetros puesto que la difusión también depende de la forma de la partícula.
La precisión con la que encontraremos la masa molecular es más o menos del 1% (si trabajamos con mucha precisión) y esto es debido al volumen específico parcial y la densidad (consideradas durante las fórmulas).
Esto es un método para calcular la masa molecular denominado método de la velocidad de sedimentación en el que tenemos que tener presente que no llegamos al equilibrio.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Método del equilibrio de sedimentación El método visto anteriormente se basa en la velocidad de sedimentación y este no es un método en el que se llegue al equilibrio pero sabemos que si hacemos girar la centrifugadora aún más a poco a poco ofrecemos la oportunidad de llegar a un equilibrio entre la tendencia a sedimentar y la tendencia a difundir o a restablecer la disolución homogénea.
Sabemos que la sedimentación mueve las moléculas hacia radios más grandes mientras que la difusión intenta mantener la solución homogénea. Esta difusión se manifiesta en el método de la velocidad de sedimentación pero al final acaba ganando la sedimentación. Si bajamos la rotación del eje podemos llegar a una situación en que el estado no se modifica con el tiempo puesto que se llega al equilibrio; el perfil de equilibrio de sedimentación es exponencial, una vez llegamos a él no puede variar.
En llegar al equilibrio podemos calcular la masa molecular pero debemos tener presente que no es un experimento fácil de realizar. Si variamos la fuerza centrífuga se varía el perfil, el equilibrio cambia de lugar. El intervalo de fuerzas que nos permiten establecer el equilibrio que necesitamos es pequeño.
Calcularemos la masa molecular mediante la segunda ley de Flick, que determina el flujo de partículas cuando tenemos simultáneamente una fuerza que actúa sobre las partículas y un gradiente de concentración. En esta ley se da un flujo j(r) donde la r es una posición en la coordenada (tracción superficial unidad) definiendo f como el número de partículas que pasan a través de la superficie unidad (cm) por tiempo (segundo).
En nuestro caso tenemos exactamente estas condiciones puesto que tenemos una disolución homogénea en que en el instante t=0 no tenemos ningún gradiente pero al siguiente instante tenemos gradiente por la sedimentación de las partículas. Además, debemos tener presente que las partículas sufren unas determinadas fuerzas relacionadas con la velocidad de sedimentación.
En llegar al equilibrio únicamente tenemos dos fuerzas que actúan sobre la partícula: la fuerza centrífuga y la fuerza de flotación.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 La segunda ley de Flick nos describe el flujo, j(r), como el número neto de partículas que pasa a través de la sección transversal a un radio por unida de tiempo y superficie y por lo tanto, se debe medir que partículas/cm·seg En la ecuación anterior debemos tener presente que:  J(r): flujo  D: coeficiente de difusión  dC/dr: gradiente, el cambio de concentración en función de la coordenada en el estado inicial que es 0 puesto que se trata de una disolución homogénea  K: constante de Boltzman (R=K·NA)  T: temperatura absoluta  Fc: fuerza sobre las partículas  C(r): concentración en función del radio Mientras no se ha llegado el equilibrio de sedimentación tenemos un flujo neto con dirección hacia radios más grandes, pero en llegar al equilibrio el flujo neto es nulo, el número de partículas que van a un lado y a otro se ven compensadas.
¿Cuál es la fuerza que actúa sobre nuestra partícula? Si imaginamos un sector de sedimentación (una sedimentación normal) sabemos que una partícula en disolución o suspensión cuando la centrífuga está en marcha la partícula está sometida a una serie de fuerzas.
 Fuerza centrífuga (Fc): es positiva porque tiene a llevar a la partícula a radios mayores  Fuerza de flotación (Fb): está generalmente será más pequeña que la anterior siempre que la partícula no tenga una densidad mayor al disolvente.
Podemos escribir las siguientes fórmulas como: La fuerza resultante que recibe la partícula es: Esta fuerza total que hemos determinado con anterioridad la podemos sustituir en la ecuación de Flick obteniendo: Término 1 Término 2 11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Inicialmente no tenemos ningún gradiente porqué partimos de una disolución homogénea, de manera que, el flujo viene determinado por el segundo término, que está relacionado con la fuerza centrífuga. En el instante t=1 aparece un gradiente a causa de la sedimentación de las moléculas, este gradiente es positivo porque tenemos una concentración que depende del radio: a más radio más concentración. Como el segundo término de la expresión anterior es negativo sabemos que cada vez se va haciendo mayor en valor absoluto.
Llega un momento en que ambos términos se ven compensados; este es el momento en que llegamos al equilibrio de sedimentación y podemos decir que el flujo es nulo: j(r) = 0. Podemos expresar el flujo ahora como: En el equilibrio el tiempo no cuenta, únicamente nos interesa la función coordenada por lo que, ya podemos sustituir la masa de la partícula individual por la masa molecular, que es con lo que normalmente se trabaja. Para realizar este cambio es importante tener en cuenta dos factores:  Relación de la constante de gases y la constante de Boltzman  Relación de la masa molecular con la masa: Mr= m· número de Avogadro Para poder elaborar el cambio comentado anteriormente multiplicaremos por el número de Avogadro el numerador y el denominador, lo que dará lugar a: Debemos tener presente que para establecer este equilibrio existe un rango determinado de fuerzas centrífugas; si nos pasamos de revoluciones tendremos una situación como en el coeficiente de sedimentación, en la cual todo acaba al final del recipiente aunque también podemos encontrar situaciones intermedias. Observamos en el siguiente esquema las diferentes opciones: Lo que nos interesa para este método es la cuarta opción puesto que sabemos la posición del 0, podemos definir el perfil de optimización en milímetros de altura en función del radio y nos interesa hacer girar la centrífuga tan deprisa como parte de la disolución se quede sin moléculas de soluto, puesto que este aspecto nos facilita los cálculos. Este método se puede aplicar prácticamente en todas las situaciones y recibe el nombre de método de infantis.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 La ecuación anterior la podemos integrar, recordando que C(r) es la concentración en función del radio y se expresa como: Siendo C(a) la concentración del menisco y r el radio del menisco.
Si integramos y linealizamos la ecuación anterior llegamos a la siguiente ecuación: Que representada gráficamente se obtendría de: C(a) es la concentración en el menisco. Anteriormente hemos visto perfiles de equilibrio de sedimentación, que podrían ser de la misma molécula pero con una fuerza centrífuga creciente, es decir, serian de una misma especie molecular con una misma masa, pero podemos comprimir más o menos el perfil de sedimentación variando la velocidad a la que gira la centrifugadora. El menisco es lo que encontramos en los perfiles como el primer punto, pero en el perfil que nosotros vamos a utilizar (número 4) es 0 por lo que no tiene ninguna complicación matemática (si el menisco no es 0 se denomina método de Van Holde Barlddwin) Para calcular el peso molecular (Mr) debemos determinar el factor por medios independientes de manera que la masa molecular pueda ser calculada mediante el pendiente de la representación anterior.
Si conocemos la masa de la partícula y elaboramos esta experimentación podemos tener el número de Avogadro como incógnita de manera que, esto se elaboró hace muchos años para determinar dicho número, demostrando que la teoría cinética de los gases, por aquel tiempo muy discutida, era cierta.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS DE LA DISOLUCIÓN Volumen específico parcial El volumen específico parcial ( ) se determina mirando la dependencia de la densidad de una disolución respecto a su concentración, cuanta más concentración tenga la disolución más densidad tendremos.
Normalmente trabajamos con disoluciones acuosas de manera que la densidad inicial será 1. Por lo tanto, para determinar el volumen cogeremos una serie de disoluciones con concentraciones diferentes y por tanto con densidades diferentes (que debemos calcular y que podemos representar los datos mediante el siguiente grafico): La densidad de una disolución se puede expresar como la siguiente suma: Siendo Vf la fracción ocupada por el soluto (no tiene unidades) y es el producto del volumen específico parcial para la concentración, por lo tanto podemos escribir la ecuación anterior como: Para la simplificación anterior hemos tenido en cuenta que ρ soluto· = 1 porqué sabemos que es la inversa de la densidad del Soluto, es decir podemos expresar el volumen específico parcial como: El volumen específico parcial en términos rigurosos es el incremento de volumen que experimenta la disolución cuando se le añade la unidad de masa, por lo tanto, no es exactamente cierto que sea la inversa de la densidad del soluto puesto que al disolver un soluto en agua, el agua al entrar en contacto con el soluto se cristaliza (pasa a su estado hielo) por lo que varía su densidad, que se ve disminuida, consecuentemente, también varía el volumen.
Existe otro método para calcularlo y es mediante residuos de aminoácidos que ya están tabulados. Debemos tener presente que las tablas no funcionan cuando la proteína tiene modificaciones postraduccionales importantes como por ejemplo glucosilación o conjugación con otras proteínas. El volumen parcial de una proteína queda definido como: 14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Densidades de disoluciones Mediante un a picometría Durante esta medición conocemos el volumen y el peso del picómetro, que llenaremos con agua, de la cual también 3 conocemos la densidad (ρ=1 g/cm ). Una vez el picómetro esté lleno lanzamos la disolución a medir y volvemos a pesar teniendo en cuenta la temperatura. La densidad de nuestra disolución queda definida como: Debemos saber que el peso vacío está incluido para descartar el peso del vidrio, para elaborar la experimentación de forma más exacta.
La principal ventaja de este método es que es el más preciso para grandes volúmenes de disolución. La gran ventaja es que si trabajamos con materiales viscosos, como por ejemplo el ADN molecular, es muy difícil introducirlo puesto que el cuello de las botellas es muy estrecho y no lo podemos introducir bien.
Mediante un oscultador mecánico Este es un método basado en el fenómeno de la resonancia. Entendemos por resonancia al fenómeno físico donde a nivel mecánico cualquier objeto una frecuencia (frecuencia de resonancia), si excitamos dicho objeto a la su frecuencia este se rompe. La resonancia en este caso dependerá de la masa del dio y la densidad del líquido que lo contiene. En realizar la experimentación obtendremos un perfil como el siguiente, en que la amplitud aumenta notablemente en llenar el tubo: La velocidad v natural de vibración del tubo magnético (v1) viene determinada por la geometría y masa del tubo. Cuando llenamos este con la disolución de la cual desconocemos la densidad la velocidad de vibración (v1) se ve modificada, por lo que ahora presentará una nueva velocidad: v2. A partir de esta nueva velocidad podemos calcular la densidad ρ 0 ya que calculamos el peso del líquido y el volumen.
Sabemos que la frecuencia de resonancia del tubo depende de las disoluciones que tenga dentro por lo que si llenamos este con diferentes disoluciones (que tendrán masas diferentes) se presentaran diferentes frecuencias de resonancia, que se podrían detectar gracias a una varilla de hierro situada en el extremo de la U que vibra y emite energía.
3 La exactitud en las muestras de volumen reducido (inferiores a 1ml) y una precisión de 0,0011 g/cm es la principal ventaja de esta técnica.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Mediante una columna de Linderstrom-lang Este método está basado en un volumen específico parcial como el queroseno (petróleo) y el borombenceno, que son impermeables en agua. En la superficie de la columna dejamos caer una gota de disolución (1 µl) que pasará a través de la columna hasta encontrar su densidad, punto en el que se parará. Elaboramos un esquema como el siguiente: El calibraje se realiza con KCl de concentración conocida; elaboremos una disolución de concentración saturada de KCl y diferentes gotas marcadoras de densidad. Las diferentes gotas quedan marcadas por su índice de refracción también. La densidad de la proteína queda definida como: La principal ventaja de este método es que conlleva un gasto mínimo de material y el principal inconveniente es que las gotas son hidrofóbicas por lo que se disuelven en el disolvente orgánico y es muy laborioso. Otro problema se presenta con aquellas proteínas transmembrenales, que no se disuelven en agua o las proteínas amfipáticas, que se escapan de la gota.
Concentración de la disolución Gravimetría o pesada Esta técnica consiste en pesar una determinada masa de un soluto y la disolvemos en un volumen conocido. El problema está con las moléculas biológicas que son polares y están hidratadas (llegan a contener hasta un 20% de agua) por lo que antes de pesar debemos secarlas drásticamente sin aplicar temperatura. La forma más eficaz de elaborar el secado es mediante peróxido de fósforo (P 2O5), que es prácticamente la sustancia más hidrofóbica que existe. Introduciremos al vacio durante 5-7 días la muestra conjuntamente con el peróxido de fósforo para eliminar el agua (podría quedar un %).
Esto nos permite ya pesar la proteína y disolverla en un volumen conocido, para calcular así la concentración.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 Espectrofotometría de adsorción Esta técnica se basa en la absorción de luz a 260 nm puesto que algunas moléculas biológicas tienen esta capacidad, como los aminoácidos o en enlace peptídico (absorbe a 230 nm). Existen casos en que la espectrofotometría no se puede aplicar, cuando la molécula en cuestión no tiene la capacidad de absorber la luz o bien cuando existe una relación entre la absorbancia y la concentración.
Análisis de aminoácidos Esta técnica se basa en la determinación del % de residuos de aminoácidos que constituyen la proteína y para ello se necesita elaborar una hidrólisis total de la proteína en la que se rompen todos los enlaces peptídicos (por ejemplo, mediante la introducción de HCl a 120 º o de KCl a 110º). Tenemos un cromatograma con diferentes picos que representan los distintos aminoácidos y la superficie de estos picos está relacionada con su representación en la proteína (esto lo conseguimos mediante un analizador de aminoácidos).
Para determinar las concentraciones son necesarios patrones de aminoácidos comerciales que ya tienen una concentración conocida, por lo que se puede repetir con un patrón de otro aminoácido para tener mayor precisión. Para conocer la concentración se escoge primero un pico altamente representado (mínimo 2 aminoácidos diferentes) y se hace un patrón de estos aminoácidos (un estándar) a partir del cual se puede calcular las otras concentraciones.
El tanto por ciento de aminoácidos que tenemos queda definido como: 17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 GENERACIÓN DE GRADIENTES Gradiente de sacarosa Elaboramos el siguiente gradiente de sacarosa, lo que nos permitirá conocer la velocidad de sedimentación: Con esto obtendremos la siguiente recta patrón: Así mismo la velocidad quedaba definida como: En la que sabemos que respecto a la velocidad la disposición de las moléculas es uniforme. En cuanto a valores sabemos que el volumen parcial cada vez es más pequeño mientras que tanto el radio como la fuerza de fricción cada vez son más grandes.
Este puede ser un gradiente preformado que nos ayuda a elaborar diferentes análisis.
Gradiente autoformado de CsCl Debemos saber que CsCl (extremadamente corrosivo) es un compuesto muy pesado por lo que en elaborar una centrifugación a más de 100.000g se forma un gradiente: Mezclamos el homogenizado celular con el CsCl y lo introducimos en la centrífuga, lo que separará por densidades de flotación los diferentes elementos de dicho homogenizado.
Este sigue siendo el procedimiento más utilizado y eficaz para producir una purificación extrema del DNA y además también es muy utilizado para purificar plásmidos.
18 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Técnicas Instrumentales Básicas T2 ESTIMACIÓN DE LA RELACIÓN AXIAL DE UNA PROTEÍNA Podemos estimar de una forma sencilla la relación axial de proteínas y de forma bien definida.
Supongamos que inicialmente tenemos el siguiente homogenizado (ver imagen), en el que debemos separar los componentes, siempre en presencia de bromuro de etidio, que disminuye los dentados de DNA.
Supongamos que tenemos toda esta información (ecosistema germinal):  Coeficiente de sedimentación: Sº=5,01·10  Coeficiente de difusión: Dº=6,97·10 cm /seg  Volumen específico parcial:  Densidad: 1,0024 g/cm  Constante de los gases ideales: R=8,314·10 J/k·mol  Temperatura: T=25ºC (298K) 7 -13 seg 2 = 0,734 cm 3 3 7 Podemos elaborar los siguientes cálculos: 1.
Cálculo de la masa molecular 2.
Cálculo del volumen de la proteína y el radio esférico 3.
Cálculo de la fuerza de frenado 4.
Cálculo del coeficiente de fricción 5.
Cálculo de la relación axial 19 ...