Tema 7 (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 30
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 71
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Tema 7. EMPAQUETAMENT DEL DNA VIRUS I BACTERIS TMV. Autoassociació Veiem figures que fan referència a un cas molt estudiat que és l’empaquetament del RNA dins del virus del mosaic del tabac i és un cas molt ferm perquè és molt senzill. Aquest virus està format, bàsicament, per una proteïna que es repeteix milers de vegades i segons les condicions de pH i concentració iònica del medi podem tenir des de la forma monomèrica, oligomèrica, estructures circulars, cercles apilats o productes més complexes que són una sèrie de cercles que formen una helicoide; és dins d’aquesta càpside on entrarà el DNA.
Les condicions de pH i força iònica són les adients perquè es vagi formant l’estructura final. Els cercles s’apilen i veiem una mena de cilindres que cada vegada es van fent més llargs. Al començament tenim moltes escletxes però al final les proteïnes estan tan ben posades que donen una estructura ben acabada i compacta.
A la imatge de la dreta veiem una representació parcial del cilindre que es forma en el TMV. S’observa l’estructura proteica i el forat per on hauria de passar el RNA que no està representat.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Quan s’estudia el sistema complet, és a dir, el RNA i la proteïna és quan en el microscopi electrònic es poden observar les estructures de com van creixent.
Veiem que virus s’estan començant a formar i altres que ja estan bastant avançats. Com més poca càpside hi ha, més RNA sobre de manera que quan ja està tot format, sobresurt molt poc RNA. En els casos intermedis hi ha bastant RNA lliure.
Una cosa que van veure és que en un dels dos extrems del RNA, tant en els passos avançats, intermedis o inicials, hi ha una part del RNA que és curta, és a dir, hi ha un dels dos extrems que manté la longitud constant durant casi tot el procés i l’altre es va escorçant, es va ficant més endins perquè la càpside va augmentant.
D’aquests resultats treuen un model de formació i han identificat que l’extrem 3’ és el que manté la longitud constant durant el procés. La idea que tenen és que a mesura que va creixent la càpside, l’extrem 3’ es queda fora i amb una longitud constant, en canvi, el 5’ va entrant cap a dins perquè es va enrotllant i formant una hèlix. Finalment, l’extrem 3’ acabarà entrant dins però durant bona part del procés manté una constància en la seva longitud.
Bacteriòfags En el cas del TMV hem vist que la càpside es forma al mateix temps que es va formant el virus però hi ha altres casos, com els bacteriòfags, on es forma la càpside i després el DNA dins. Els estudis de micrografia electrònica indiquen que primer es forma la càpside i després va entrant el DNA, es fica dins del tot i al final acaba formant la cua que és per on es contacta amb el bacteri i injecta el material genètic que està dins.
Com que són sistemes relativament senzills, la gent treballa molt i una de les coses que s’està fent són estudis estructurals de bastant bona resolució sobre la proteïna que fa que entri el DNA dins de la càpside.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Ens hem d’imaginar la càpside i la part central és la proteïna que fa que el DNA vagi entrant dins. Per la forma que té això i pel fet que és una proteïna que hidrolitza ATP, el que pensen que passa és que es tracta d’una proteïna que girar i que al girar fa que el DNA entri; imaginem que la proteïna és com una femella d’un cargol de mecànica, aleshores, si la femella gira pot provocar que el DNA, que és com una hèlix, vagi entrant cap a dins.
Aquesta és una mena d’estudi estructural però també estan estudiant altres tècniques que permetran mesurar la longitud del DNA que està fora de la càpside. Amb aquests sistemes que són més complicats i que fan servir pinces òptiques es poden mesurar quina és la longitud del DNA tot i que no estigui dintre i per tant, podem determinar al llarg del temps com disminueix la longitud del DNA que no està dins de la càpside. Això es pot fer amb una gran precisió i també es pot mesurar quina força està fent la proteïna per aconseguir ficar el DNA dins i empaquetar-lo d’una manera compacte.
Bacteris Aquest tema és complicat i és per això que no se saben tantes coses com se saben de l’empaquetament del DNA en els eucariotes. Els bacteris no tenen pròpiament el nucli definit sinó que hi ha una zona on sol trobar-se el DNA i que es coneix com nucleoide. S’han trobat proteïnes que s’uneixen amb el DNA i per tal que s’empaqueti correctament el que fan és enrotllar-lo sobre la seva superfície. D’aquesta manera aconsegueixen que la longitud del DNA disminueixi i que el DNA quedi empaquetat dins del nucleoide.
També pensen que a part de l’acció de les proteïnes per produir l’enrotllament del DNA, existeixen unes llaçades que fan que el DNA es fiqui dins. Aquest és un tema recurrent i també surt en el cas dels cromosomes d’animals i plantes.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Experiment fet als laboratoris de Wercel Una font d’informació d’aquest tema és degut a uns estudis que va fer un autor reconegut i que és Wercel, d’origen argentí. Aquest investigador va treballar amb E. coli on va isolar el material del nucleoide i va obtenir un material que tenia un coeficient de sedimentació de 1500 Sv i que contenia el material genètic del bacteri i proteïnes.
Quan sotmetia el material a l’acció de la DNAsa I trobava que com més temps actuava l’enzim, més petit es feia el coeficient de sedimentació.
D’altra banda, quan afegia bromur d’etidi veia com el coeficient també es veia disminuït, ja que l’estructura s’estava fent més grossa, però a partir d’una determinada concentració de EtBr el coeficient de sedimentació augmentava.
La idea que va tenir per justificar això va ser que potser el nucleoide es composava de moltes llaçades de DNA. Aquestes poden tenir una certa tensió superhelicoïdal i si s’aplica DNAsa I es va relaxant i es va obrint, fent que el coeficient de sedimentació disminueixi. Per una altra banda, si aquestes llaçades tenen tensió i afegim un agent intercalant es poden relaxar però pot arribar un moment on hi hagi molt EtBr i es produeixi l’enrotllament cap a l’altra banda.
Això va portar a la idea que en els bacteris, un nivell d’empaquetament són les llaçades i això es complementa amb les proteïnes que s’uneixen al DNA.
CROMATINA En les cèl·lules que tenen nucli, pensar que existeix DNA com a alguna cosa independent és totalment incorrecte ja que mai no veiem el DNA separat d’altres molècules, com les proteïnes. Concretament, les proteïnes que acompanyen el DNA són les proteïnes histones. En el nucli, sabem que la massa de DNA i la massa d’histones són aproximadament idèntiques.
En el nucli, també trobem RNA i altres proteïnes que s’anomenen de manera negativa com a non – histones proteins.
Les proteïnes histones tenen un avantatge i és que només són 5 tipus de proteïnes, en canvi, en el grup de les proteïnes no histones hi ha centenars. Així doncs, les histones tenen un atractiu molt gran i és que no són una col·lecció de moltes menes diferents sinó que són una col·lecció curta que està en una gran quantitat. Les no histones són molts tipus però en poca quantitat.
Veiem al diagrama que els components principals del DNA són el DNA i les proteïnes histones.
La cromatina és el material que surt del nucli i que nosaltres estudiem. Per als citòlegs, la cromatina és el material que es tenyeix amb colorants bàsics.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Proteïnes histones Hi ha 5 tipus d’histones que són: 3, 4, 2B, 2A i 1. Totes les histones, excepte la 1, s’assemblen bastant entre elles amb una Mr similar que oscil·la entre 11.000 i 15.000 a més, tenen arginina en una proporció bastant elevada. Per una altra banda, la histona H1 té una Mr que és gairebé el doble i té moltes més lisines que arginines. Les histones tenen una càrrega neta positiva que és promoguda per l’existència de lisines i arginines; cal remarcar que la H1 té una càrrega positiva més gran.
Poc temps després que es descobrissin les histones , temps després del DNA, es va pensar que la unió entre aquestes proteïnes tan bàsiques i el DNA es produïa per interaccions electrostàtiques. Aquest fet queda demostrat quan es fan experiments en presència de clorur de sodi 2M on les histones es dissocien del DNA; cal tenir present que el NaCl no trenca enllaços covalents però sí que és capaç d’apantallar les càrregues positives de les histones i les negatives del DNA.
Per tant, quan al laboratori volem dissociar les histones hem d’aplicar NaCl concentrat.
Les histones 3, 4, 2B i 2A estan molt conservades evolutivament, en canvi, la H1 no ho està tant. Concretament, les histones 3 i 4 són les que més ho estan i això ho podem demostrar amb un exemple.
A la imatge veiem representada la seqüència de la histona H4 de lletó de vedella. També se sap la seqüència de la proteïna en una espècie molt allunyada com és el pèsol. Si es representa l’estructura primària per les dues espècies es veu que només s’hauran de produir dos canvis: valina per isoleucina i lisina per arginina. A més, aquests canvis són per aminoàcids de la mateixa mena, és a dir, equivalents. Per tant, tots els canvis que ha fet l’evolució per canviar la seqüència d’aquesta proteïna no han estat vàlids i es tracta de proteïnes que tenen tots i cadascun dels aminoàcids necessaris per fer aquesta funció; aquesta funció no és química sinó que és una funció 100% estructural.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Les histones són proteïnes parcialment globulars, de manera que, des de fa temps sabem que si s’agafen les proteïnes histones (qualsevol d’elles) i se sotmeten a digestions amb enzims proteolítics en petites dosis, es troba que de tota l’estructura hi ha una part que està protegida, que correspon a la part globular, i una més exposada que no està estructuralment protegida i que les proteases poden digerir fàcilment. Cal tenir present que això no vol dir que les proteases a altes concentracions no puguin trencar-ho tot. De fet, sabem quines són l Sabem quines són les zones globulars i quines són les no globulars, tal com veiem a la imatge. Gairebé tota la regió central i la C-terminal és globular i els aminoàcids que hi trobem són apolars. A la part vulnerable trobem molts residus lisina i arginina i a aquesta regió s’anomena cua N-terminal que és on hi ha les càrregues.
La histona H1 és anòmala ja que té una zona central que és apolar, una zona N-terminal que és bàsica i a més, una zona C-terminal que la diferencia de la resta i que és bàsica, és a dir, la histona H1 té dues cues.
Comparant entre espècies s’ha vist que les zones més variables en quant a seqüència són les cues N i Cterminal.
EL NUCLEOSOMA Determinació de l’existència del nucleosoma A l’any 1973, H&B, a partir de l’estudi de nucleases endògenes van trobar la digestió que observem i van deduir que existia una unitat repetida que continuava aproximadament 200 pb.
Al 1974 es va fer un estudi al laboratori de Olins & Olins on van sotmetre a un xoc osmòtic fort a les cèl·lules i van resuspendre el que sortia de les boletes; van veure que cada boleta tenia uns 10 nm de diàmetre. Aquesta és una altra aproximació que ajuda a entendre la compactació del DNA.
Aquest tema que desenvoluparem no és un tema típic de la biologia molecular actual que es pugui resoldre amb la tècnica més potent, la cristal·lografia de raigs X. No és possible perquè tal com veurem només s’ha conegut per difracció l’estructura d’una part del nucleosoma. Tot el demés s’ha hagut d’anar coneixent sense renunciar a l’estructuralisme, és a dir, a l’estudi de l’estructura però no pas fent-ho amb la tècnica més poderosa.
Aquest és un tema ideal per convertir-lo en escola de biologia estructura perquè en comptes de resoldre-ho tot amb una sola tècnica, degut que el problema es tan complicat, hem d’intentar-ho amb altres tècniques.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Octàmer d’histones Altre gent havia trobat que les histones en dissolució tenien n comportament curiós ja que si s’havien extret del DNA en presència del NaCl 2M, les histones, excepte la H1, s’associaven entre elles i formaven un octàmer on hi havia dues còpies de cadascuna.
Si aquestes proteïnes extretes sense DNA es portaven a una condició iònica més fisiològica, d’un 0,2M, aleshores quan fèiem cromatografies en aquests gels de filtració molecular amb sephadex (separen en funció de la grandària) s’observaven dos pics quan es mesurava a 280 nm ( longitud d’ona a la que absorbeixen les proteïnes):  El primer pic corresponia a les histones H3 i H4  El segon pic corresponia a les histones H2A i H2B.
Si sumem les masses moleculars de la H3, H4 i la H2A i H2B obtenim que són aproximadament iguals però en aquest gel sortien a diferents posicions, la qual cosa no lliga gaire amb el que s’esperaria. Això ho explicaria el fet que estiguessin associades de manera diferent, fent que les H3 amb les H4 formin un agregat de major massa molecular Estudis fets al laboratori de Kornberg En el laboratori de Kornberg van voler demostrar que aquesta diferència de masses es donava per la forma com estaven associades les histones. Van procedir a fer un experiment mitjançant cross linking que consisteix en utilitzar reaccions químiques amb dimetil suberimidat que són estructures molt petites que tenen reactivitat en els dos extrems i reaccionen amb les amines de les proteïnes. Aleshores, si dues proteïnes estan properes, es poden enganxar de manera artificial.
El que fa el cross linking és establir unions covalents entre les proteïnes. Per veure si estaven juntes de natural es fa un gel SDS i com que hem introduït cross linking covalents, les proteïnes no es poden dissociar en presència de SDS. A la imatge veiem el resultat que van obtenir quan van agafar el H3H4 i el van sotmetre a dimetil suberimidat. Cada puntet fa referència a una banda, que aquí costa de veure però en l’original es veia bé.
El que troben després de fer la reacció amb dimetil suberimidat en concentracions adients és que si les histones H3 i H4 fan tetràmers, després de fer la reacció veuríem algunes molècules lliures, altres que formen dímers, altres trímers i també algunes que estan formant tetràmers.
Van concloure que les histones H3H4 formen tetràmers però les histones H2A/H2B, que van ser estudiades de la mateixa manera, no formen aquestes estructures d’alt pes molecular sinó que es queden en dímers.
Per tant, l’octàmer que existeix en presència de 2M deu estar format per una subunitat de H3H4, que és un tetràmer, i dos dímers formats per H2AH2B.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Kornberg va ser el més ràpid i a l'any 1974 va aglutinar tots aquests experiments i va fer la hipòtesi estructural o també coneguda com model estructural del nucleosoma. Va proposar que el nucleosoma es composava per aproximadament 200 pb, resultats de H & B, i que contenia un octàmer d'histones. A més, també contenia una còpia de la histona H1 tot i que als treballs de cross linking no surti. Cal tenir present que algunes vegades la histona H1 s’anomena H5 però essencialment són de la mateixa família.
Per tant, el nucleosoma és la unitat fonamental de la cromatina i és important saber quina és la proporció de proteïna i DNA.
Experiments fets al laboratori de Noll al 1974 Vist això i pensant en termes que trobem unitats consecutives de nucleosomes, es van anar fent preguntes com ara: Com estan posades les 200 pb? Estan fora o dins? Aleshores, molt aviat va haver-hi qui va saber trobar l’experiment adequat per esbrinar-ho.
En el laboratori de Noll van agafar nucleosomes i els van sotmetre a l’acció de la DNAsa I per elaborar una electroforesi on van trobar que moltes de les bandes estaven separades entre elles per 10 pb.
Aquest fet afecta a tota la longitud del DNA que està unida a una part del nucleosoma. Això es va interpretar com que el DNA havia d’estar per fora ja que si hagués estat per dins, la nucleasa no podria haver actuat i si hagués estat mig fora i mis dins, trobaríem bandes intermèdies.
El nucleosoma és l’estructura que veiem a la imatge i que conté aproximadament 200 pb. Conté un globus d’histones que és conegut com octàmer d’histones i involucre a unes 146 – 147 pb que estan posades donant un parell de voltes per fora i embolcallant a l’octàmer. En la part central del nucleosoma falten unes parelles de bases que es troben unint-se amb el següent nucleosoma. Les histones tipus H1 també s’anomenen linker histones (histones d'unions) ja que aquesta histona es troba en aquesta zona d’unió entre nucleosomes.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Experiments fets al laboratori de Lutter Poc temps després va aparèixer un autor important, Lutter, que el que va fer va ser estudiar el nucleosoma mitjançant una digestió amb DNAsa I i el marcatge radioactiu dels extrems 5’ del nucleosoma.
Una qüestió de nomenclatura important és que hi ha costum de parlar de nucleosoma quan en realitat s’està parlant de la partícula nucli. Per tant, moltes vegades parlarem de la partícula nucli i direm nucleosoma. Cal tenir present que es parla de la partícula nucli perquè és el que millor es coneix.
Aquest experiment de Lutter està referit a la partícula nucli que té marcada radioactivament l’extrem 5’. Veiem les autoradiografies dels gels desnaturalitzats que va obtenir i com la distribució de bandes és curiosa. Així com abans obteníem totes les bandes amb una intensitat similar, en aquest cas trobem una gran varietat: algunes molt intenses, altres no tants i fins i tot algunes que no es veuen. Aquest fet indica que hi ha llocs que la nucleasa no talla tant.
Es tracta d’un treball molt potent i molt ben fet. El que van trobar va ser la velocitat de tall o dit d’una altra manera, la probabilitat de tall dels diferents llocs per on talla la DNAsa I. Això ho veiem representat a la imatge inferior i està relacionat amb la intensitat de bandes on com més llarga és la banda, més velocitat de tall hi ha.
Va elaborar el mateix experiment marcant aquesta vegada en 3’ i amb això va obtenir un resultat molt complet que va des del nucleòtid 0 al 140. Veiem que en mig hi ha representat un puntet i això és degut que si posem un eix i fem un gir veiem que hi ha un eix de simetria binari, per tant, el DNA està envoltant el nucleosoma té una simetria binaria que és un element estructural molt important.
A més, també va trobar que els llocs 30, 60 i 20, marcats a l’autoradiografia superior són llocs de talla bastant infreqüents ja que estan protegits; en el 0, en 110 i 140 també trobem protecció. Aquestes proteccions es poden “aparellar”, és a dir, si tenim una protecció molt forta en el 0, si anem 80 pb cap a la dreta (posició 80) també trobem una protecció forta; en 30 trobem que la protecció és igual a la que es troba en la posició 110. Per tant, a una distància de 80 pb trobem proteccions equivalents.
Això li va ajudar per saber com posar el DNA per fora de les histones. Si som realistes, la dada que faríem servir per saber si dóna una volta o 2 és el diàmetre dels octàmers. Noll va determinar que es donaven 2 voltes i a més va fer coincidir les posicions 0 – 80, 30 – 110 i 60 – 140. Cal tenir present que l’autor parla d’una hèlix però això és una espiral ja que el diàmetre va creixent.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Experiments del camp de la cristal·lografia Es van aconseguir fer cristalls de partícules nucli i això es va fer al laboratori d’Aaron Klug. Els cristalls que aconsegueixen són de baixa resolució però van permetre obtenir la densitat electrònica dels nucleosomes i van obtenir diagrames semblants als que veiem a la imatge.
Aquests estudis es van combinar amb els estudis fets a altres laboratoris, com ara la difracció de neutrons que és útil perquè té l’avantatge que en funció de la proporció que es posa en el medi d’aigua deuterada i aigua normal es pot aconseguir que es vegi només el DNA o que es vegin les proteïnes. Amb això van poder determinar que el DNA està per fora i la proteïna per dins.
Tot això confirma el que estàvem veient i que el DNA en la partícula nucli dóna una volta i ¾. La partícula nucli és una estructura xata (cilindre baix) que té tan sols una alçada de 6 nm i un diàmetre d’aproximadament 11 nm. L’hèlix que descriu el DNA és una hèlix d’esquerra.
Experiments fets amb topoisomerases Es van fer servir les topoisomerases per estudiar la cromatina i això és relativament antic ja que no parlaven encara de topoisomerases sinó d’un extracte (untwristing extract = UE) que avui dia es correspon a la topo I. Van fer un estudi de DNA amb histona, és a dir, de cromatina i el DNA que van fer servir era un DNA circular relaxat i a continuació una sèrie de topoisòmers que corresponien a formes superenrotllades (a) que quan aplicaven l’extracte es produïa desenrotllament (b).
A l’electroforesi de la dreta, cada dos carrils posaven concentracions creixents d’histones de manera que ja no era DNA sol sinó que era DNA amb histones (a – d). Quan aplicaven la topo en presència d’histones, si hi havia poca histona, aconseguien relaxació del DNA però quan hi havia més histona no ho aconseguien tant. Per tant, no es produeix tanta relaxació quan actua la topoisomerasa.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Observem en la següent imatge una simplificació del problema i ens fa pensar que en el DNA circular tant sols hi ha un octàmer d’histones i que el que fa aquest octàmer d’histones es elaborar dos voltes de superenrotllament toroïdal cap a l’esquerra. Si aquest aspecte fos així, dos voltes de superenrotllament toroïdal cap a l’esquerra seria equivalent a que tingués un valor de ∆W=-2 unitats i això és el que hauria de ser teòricament però no és el que trobem a la experimentació.
Com que el DNA encara no l’hem sotmès a un tall si elaborem ∆W=-2 a la part que està dins del nucleosoma, a la part que es troba fora hauria d’aparèixer un valor de ∆W=+2 per compensar la tensió. A la pràctica el que veiem en elaborar experiment és que cada nucleosoma elabora un ∆W=-1 i en conseqüència hauríem d’esperar que a la resta de cadena del DNA circular es produeixi ∆W=+1.
Si apliquem en aquestes condicions una topoisomerasa sabem que aquesta relaxarà allà on pugui; on hi ha histones no podrà actuar però si que ho podrà fer en la part exterior de manera que podrà eliminar la tensió superhelicoïdal fora del nucleosoma (∆W=0) mentre que les histones seguiran tenint tensió ∆W=-1).
Observem a continuació un gel electroforètic de DNA i quan indicaven topoisòmers eren topoisòmers corresponents a DNA corrents com DNA pur, és a dir, sense histones. Després de fer el tractament amb la topoisomerasa el que es fa és purificar el DNA, treure-li els topoisòmers i analitzar-los en el següent gel.
En el gel si només hi ha un nucleosoma observaren un valor de ∆W=-1 i com que ja s’ha realitzat l’acció de la topoisomerasa per treure aquest superenrotllament veurem que ha disminuït el Linking Number i per tant, el valor experimental que tenim és que ∆W=-1 i ∆L=-1 per cada nucleosoma. El que hauria de ser, tal com hem dit anteriorment és que ∆W=∆L=-2 però experimentalment observem que sempre correspon a un altre valor el que és denominat la paradoxa del Linking Number del nucleosoma.
El que van pensar inicialment és que no era tant fàcil com s’havia plantejat el problema sinó que per poder entendre la topologia no només ens havíem de fixar en els valors de W i L sinó que també havíem de tenir presents els de T. Així doncs, s’arriba a la conclusió que el nucleosoma provoca un canvi en el número de parelles de bases/volta en unir-se al DNA, el que permet justificar la paradoxa anterior.
Sabem que en el nucleosoma el número de pb/volta en comptes de ser 10,5 (com en dissolució) disminueix a 10 el que provoca que observem un ∆T=+1 ja que: Sabem el teorema topològic sabem que ∆T =+1 de manera que, ∆L=∆W-∆T= (-2)-(-1)=-1, que és el que trobem en els resultats experimentals obtinguts a partir d’electroforesi. Així doncs, quan el DNA entra en el nucleosoma aquest queda alterat en la seva estructura secundària el que és reflexa en un canvi en el valor de ∆T que provoca una variació en els valors de ∆W i ∆L.
11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 REPRESENTACIÓ DEL NUCLEOSOMA: IMPEDIMENTS GENERATS En el nucleosoma tenim un core i tenim que el DNA va per sobre i si el mirem transversalment ens podríem imaginar el core d’histones y el DNA per sobre d’aquest. no podem estar d’acord amb aquesta hipòtesi ja que el diàmetre del nucleosoma és de 11nm i el DNA no actua com un fil i quan està en un lloc tant petit el seu gruix és important ja que és de 2nm. Així doncs podem entendre que el DNA dins d’una estructura tant petita té un gruix significatiu i una estructura gruixuda no es pot doblegar amb facilitat.
D’aquesta manera el DNA en doblegar-se presenta diferències entre la part externa i interna; el perímetre de la superfície del cercle intern és més petit que l’extern la qual cosa provoca una compressió en l’aparellament de bases.
Recordem que tot i que corbem el DNA de forma uniforme en la cara de dins tenim que l’angle de roll provoca que hi hagi una certa angulació de roll i per tant, hi ha més compressió que a l’exterior. Aproximadament a la part de fora entre les parelles de bases hi ha una distància de 0,4 nm mentre que a la part interna és de 0,3 nm.
S’han realitzat experiments interessants respecte aquesta qüestió i cal remarcar el següent experiment: van preparar nucleosomes i de manera atzarosa al laboratori del professor Travers van elaborar la seqüenciació del DNA d’aproximadament 187 nucleosomes diferents triats a l’atzar el que va permetre veure quines característiques tenien les seqüències implicades en els nucleosomes .S’ha de dir que, en principi, qualsevol seqüència es pot unir en les histones per formar un nucleosoma.
Van elaborar diagrames de probabilitat en que es representa en l’eix d’abscisses (x) la posició del DNA, que va de 0-146pb respecte l’eix d’ordenades (y) en que es representa la probabilitat, el nombre de vegades que es troben les diverses vases. En l’esquema veiem que l’eix de les X només arriba al punt 70 ja que la gràfica és molt simètrica de manera que, van plegar una gràfica sobre l’altre tenint en compte, com a eix de simetria x=70.
En la gràfica superior es representen les seqüències que tenen A i T i per sota les que tenen C i G. Observem que en tots dos cassos la gràfica puja i baixa cada 10 parelles de bases tot i que al final aquesta monotonia es trencada (15 pb). A més, veiem que les dues gràfiques estan en antifase.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Per compensar la compressió de la fase interna el que sembla que passa és que a la part que el DNA toca les histones es posen les A-T ja que el contacte entre el DNA i les histones es dona a nivell del solc petit. Així doncs, a la part interior queden les A/T mentre que en la part exterior s’acumulen les C/G. Això vol dir que el DNA que forma nucleosomes no ho pot elaborar amb qualsevol seqüència ja que té preferències en quant al plegament, és a dir, el DNA té direccions preferides de corbament (és una preferència isotròpica pel corbament).
En la part central a més, podem observar una anomalia que s’interpreta com que en el lloc on passa la simetria binària hi ha unes tensions especials, és un lloc on les histones grapen fortament el DNA i per tant, hi ha una zona anòmala que representa unes deformacions.
LOCALITZACIÓ DE LES HISTONES DINS LA PARTÍCULA NUCLI Experiments en el laboratori de Mirzabekov Els estudis que permeten la posició dins la partícula nucli es van trobar de forma primerenca gràcies a una contribució ferma d’estil químic elaborada en el laboratori del professor Mirzabekov on van trobar de manera molt intel·ligent una forma de situar dins la partícula nucli totes les histones.
Veiem en la imatge el que vol representar alguna part del nucleosoma i tenim una histona que elabora contactes amb una purina a través de ponts iònics. El que van trobar al laboratori és que en les condicions experimentals (en presència de dimetilsulfat i 45ºC) aconseguien que es produís una unió covalent entre la histona i la purina i a més, el procés de reaccions químiques el que provoca és que s’uneixin les histones i la cadena de DNA. En el punt on la cadena s’havia unit quedava tallada i es tallava doncs, un enllaç fosfodièster. En aquest tipus de reacció la histona s’uneix covalentment.
Observem en la següent imatge el resultat d’un experiment real després d’elaborar la reacció en unes condicions on hi hagués unions atzaroses amb les histones. Van fer un gel bidimensional on la primera dimensió era tal qual amb els productes de la reacció anterior (no es mostra aquesta primera dimensió) i la segona dimensió es va agafar el producte de la primera dimensió i es va sotmetre a tractaments de degradació i eliminació completa del DNA, de manera que, hi ha menys DNA; d’alguna manera en la segona dimensió les bandes que veurem migraran tal com ho fan les histones en un gel de proteïnes.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Sabem que les histones en un gel de proteïnes que conté SDS migren en el següent ordre indicat de la part més superior a la part més inferior: H3–H2B–H2A–H4. Observem que en la segona dimensió tenim una col·lecció de bandes inicials (part més superior) que contenen H3 i les altres més inferiors segueixen l’ordre determinat anteriorment.
La primera reflexa trossos de purina, de DNA, de manera que és una manera de conèixer la grandària dels trossos de DNA, com més grans és el DNA menys ha migrat i com més petit més ho ha fet. Observem una autoradiografia que recull els fragments marcats en 5’ (hi ha autoradiografies exposades a temps diferents de manera que, acaben observant correctament totes les bades). La banda que migra en la zona de les 140 pb és la H3 de forma que sabem que la H3 està unida al final del segment del DNA mentre que en la zona 135 hi ha la H2 i així successivament.
Al final d’aquestes experimentacions acabem obtenint en quina part del DNA interaccionen les histones. Observem que hi ha una simetria també en quant a les interaccions. Veiem tant la representació lineal com en cercle.
Els diagrames anteriors són extrets de les dades experimentals i si ens fixem hi ha ratlles blanques o negres i entremig hi ha espais on sembla que les histones no interaccionin, és a dir, que les histones es troben interaccionant en alguns trossos però hi ha zones on no hi ha interacció. Aquest aspecte si el traduïm en una imatge és la següent, en que ara en lloc de posar línies representem la doble hèlix i les histones amb el mètode de Miraveka. Podem observar on hi ha espais en que no es produeixen interaccions i això és perquè el DNA és un cilindre complicat amb unes determinades dimensions i les histones interaccionen amb el DNA per una cara i no per tot el cilindre el que genera que els contactes no es donin de forma uniforme, només detectem les interaccions que es donen en una cara.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 A més, la partícula nucli té un total de 292 càrregues negatives ja que són 146 parelles de bases i cada parella de base té 2 fosfats de manera que, tenim el doble de càrregues negatives que parelles de bases. Les histones tenen càrregues positives majoritàriament i algunes negatives tot i que la càrrega neta de l’octàmer d’histones és de +142. Així doncs, quan hi ha un octàmer que interacciona amb un DNA aproximadament la meitat de les càrregues no són neutralitzades i a més a més el DNA únicament interacciona en una cara de les histones.
A partir d’aquestes dues dades el que van hipotetitzar Mirzabekov i Rich va ser que les càrregues del fosfat que no estan neutralitzades a la part externa són les parts que no interaccionen. D’aquesta manera tenim que, la meitat de les càrregues estan neutralitzades i l’altre no, de manera que tenim, les dues disposicions del DNA, la part que està en contacte amb la histona i la part que no està en contacte. Això provoca que existeixi una gran repulsió de la part d’adalt i per tant, el DNA es pot corbar mentre que si el DNA està sencer té càrregues negatives a totes les cares i per tant, aquesta repulsió corbadora no existeix.
Experiments en el laboratori de Klug (1980) Van aconseguir agregats d’octàmers i van elaborar uns agregats que només estaven formats per proteïnes d’histones que en les condicions adequades agregaven i formaven una estructura monòtona que era observable en el microscopi electrònic; a les imatges obtingudes podien aplicar-li la tècnica de reconstrucció d’imatges que permetia a partir dels agregats donar una estructura 3D de poca resolució però que ens permetia tenir una idea global del octàmer d’histones.
La part interna és just la forma aproximada que té l’octàmer d’histones fruit dels resultats esmentats anteriorment.
Observem una estructura més ampla per una part que per l’altre, com una falca.
Aquest laboratori va publicar les seves dades al mateix any que ho va fer Mirzabekov i gràcies a questes dades l’estructura de falca anterior es va poder interpretar: si tenim aquesta estructura i tenim les dades d’interacció histona – DNA el laboratori es va poder atrevir a fer la hipòtesi de la situació de les histones. Així doncs, el DNA queda representat en les imatges anteriors com un tub de plàstic (en l’experiment no estava).
Obtenció de millors cristalls (1984) Al 1984 s’obtenen millors cristalls que els anteriors tot i que no son prou bons per elaborar una bona cristal·lografia. De l’estudi de rajos X es va aconseguir donar una estructura on el DNA estava per fora i la histona al interior. En aquesta, tot i que no és de màxima resolució es donen mesures: diàmetre (11 nm), alçada del cilindre (5,7 nm).
Recordem que hi havia unes regions en l’atac de la DNAasa I i gràcies a aquest resultat de cristal·lografia és veu que aquesta protecció no era perquè les histones estiguessin impedint que es pogués digerir sinó que es va arribar a la conclusió que les histones no estan fora, no s’externalitzen sinó que estaven a la part interna i elaboren aquesta protecció a la digestió a determinades zones però de manera indirecta, deformant la doble hèlix, el que provoca que la DNAasa I no pugui tallar específicament.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Experiments en el laboratori de Moudrianckis (1991) En aquest laboratori van aconseguir cristalls d’octàmers molt bons que li van permetre estudiar tant sols l’octàmer i no el DNA obtenint una resolució bastant bona, de 3,1 Å el que permet obtenir la següent estructura de la histona.
L’únic que podem treure de l’estudi és l’estructura de l’octàmer de manera que, aquella estructura blava més clar és el DNA, que el van posar a sobre en l’esquema. En la resolució de l’estructura van trobar que l’octàmer era una estructura formada per 3 parts, tripartida: la part central era el centràmer (3-4), que tenia a la part superior i inferior un dímer. Les 4-3 tendeixen a formar un tetràmer que està tot junt mentre que les altres tenen tendència a estar més separades.
Hem de tenir en compte que l’estructura que va trobar no és la totalitat de l’octàmer sinó que és part d’aquest perquè part dels aminoàcids no saben on estan ja que no donen senyals en rajos X ja que formen part de les cues de les histones que com són molt polars inclús quan es fan el cristall no queden en posicions totes en el lloc equivalent sinó que són cues que en una part del cristall estan més a la dreta o esquerra, no estan d’una manera repetida com en un cristall.
També van trobar que si posaven el DNA damunt l’octàmer (imatge de la dreta) podien explicar teòricament on es produïen les interaccions entre les histones i el DNA. A més el que van poder fer és descobrir que totes les 8 histones que hi a dins el core tenen el mateix tipus de plegament, totes segueixen el mateix motiu (anomenat motiu histona) son sempre s’elabora una hèlix α curta, una llaçada, hèlix α llarga, llaçada i hèlix α curta.
Si podem el DNA sobre les histones aquesta queda molt tapada ja que el DNA és una molècula molt gran. En la imatge però només veiem l’esquelet de la doble hèlix i per tant, podem veure l’interior. L’octàmer té aquestes senyals vermelles que són les càrregues positives i en estudiar la seva estructura van veure que aquestes estaven disposades estratègicament de manera que formen una forma helicoïdal ideal perquè el DNA s’uneixi i formi un helicoide d’una volta i 3/4.
Experiments al laboratori de Richmmond Els experiments en aquests laboratoris van permetre conèixer l’estructura de la partícula nucli amb una alta resolució. Així doncs ens quedaria que l’estructura és la següent.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 FUNCIÓ DE LA PARTÍCULA NUCLI: REPLICACIÓ DE LA CROMATINA La replicació del DNA es dóna en el nucli i amb aquest DNA unit als nucleosomes de manera que, la pregunta més clara que ens farem serà: que passa amb els nucleosomes? Aproximació en el laboratori de Jose Maria Sogo S’elaboren uns experiments que pretenen determinar què passa amb l’expressió i replicació del DNA. El psoralen en les condicions adequades si tens DNA va elaborant crosslinks que provoquen que no es puguin separar les dues cadenes però si tenim el DNA amb els nucleosomes i apliques psoralen al espai entre els nucleosomes actua correctament però on hi ha nucleosomes no podrà actuar.
Si en lloc de fer el tractament amb psoralen elaborés una desnaturalització obtindràs unió – bombolla – unió – bombolla... on en cada bombolla significa que tens un nucleosoma.
Experimentació en condicions normals En l’experiment es fa servir DNA circular i després de tractar-lo amb histones i elaborar el crosslinking amb psoralen el nombre de bombolles estarà relacionat directament amb el número de nucleosomes que esperem tenir.
Veiem que en totes les imatges apareixen nucleosomes menys en la (B) ja que aquest es tracta d’un DNA íntegre, és un DNA covalent, tancat i circular (CCC) i ja sabem que quan volem fondre’l té grans dificultats ja que no pot girar sobre ell mateix.
En les condicions de l’experimentació no manifesta les bombolles perquè li costa molt fondre de manera que, les bombolles les manté formant doble hèlix.
Observem però que en les altres imatges tot i que sigui un DNA circular al estar nickat les bombolles es desfan i desnaturalitzen.
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Estudis durant la replicació En estudiar aquestes molècules quan es donava la replicació van veure unes imatges diferents: En la figura (D) observem una bombolla on estan les fletxes que indiquen les forquetes. A la zona de la bombolla de replicació el que veiem és que hi ha bombolles petites que tenen la mida corresponent a un nucleosoma i a la part exterior, a allò que ja ha replicat també observem aquestes bombolles.
Així doncs a la conclusió a la que s’arriba és que la polimerasa ataca el DNA per replicar-lo però el nucleosoma segueix al seu lloc, al darrera (un cop s’ha fet la replicació) també hi ha bombolles tot i que hi hagi un espai on aquestes no estiguin. Els nucleosomes estan presents just abans i després de la replicació de manera que, encara que non podem dir si els nucleosomes es mantenen tal qual o es dissocien quan es dona la replicació si que podem dir que es desfan i es refan de forma molt ràpida.
És difícil de concebre que la polimerasa passi per sobre els nucleosomes sense cap interacció ja que les polimerases són molècules complexes amb un gran nombre d’elements. Així doncs, podria ser que el que passes fos que es desfés la volta i 3/4 del nucleosoma, és a dir, que sense arribar a passar pel nucleosoma la polimerasa podria fer que el DNA es fes lineal, les histones encara estarien unides però sense que el DNA estigues elaborant un corbament i una volta, el que permetria a la polimerasa elaborar la síntesi.
La polimerasa ha d’interaccionar i a més s’ha de moure, avança, copia i obre les dues cadenes de manera que es plantegen tres opcions possibles:  Les polimerases passen per sobre sense treure les histones  Les polimerases passen desfent la superhèlix però sense treure les histones. La reassociació del DNA monocadena que s’associa per formar la doble cadena en presència d’histones no es veu afectat des del punt de vista cinètic de manera que, es podria produir.
 Les polimerases per tal que puguin passar sabem que s’han de desfer les histones el que permetria que el DNA s’obrís i es pogués llegir.
En qualsevol dels cassos és obvi que tot ha d’anar molt ràpid perquè si s’hagués de prendre molt de temps en que les histones marxessin o que es tornessin a fer els nucleosomes a les imatges anteriors es detectaria. Així doncs que la tercera hipòtesi es pot admetre sempre i quan admetem també que la dissociació i reassociació ha de ser molt ràpida.
18 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Experiments en el laboratori de Jackson (1990) Els experiments que realitzen en aquests laboratoris són estudis de marcatge radioactiu combinats amb un marcatge per densitat. Elabora experiments amb marcatge molt complicat i ho fa amb la finalitat de veure si durant la replicació passa la opció A o B: Entenem per opció A aquella en que durant la replicació els octàmers es conserven de manera que, estan indicats de color negre els octàmers d’histones (formats per 4 dímers) perquè són les histones que formen els nucleosomes que ja estan fetes abans que es faci la replicació. Si es conservés l’octàmer aniríem fent replicacions i trobarem que els octàmers vells serien sense barreja d’histones, tindries totes les histones velles formant octàmers vells i les histones noves en nous nucleosomes (aquestes són de color blanc) però no hi hauria una barreja.
La opció B és aquella que proposa que si l’octàmer es dissociés en haver-hi replicacions les histones que constituïen els nucleosomes vells (de color negre) es dissociarien perquè els nucleosomes es desfarien i aleshores el que trobarien és una barreja d’histones velles i noves en els nous nucleosomes.
Observem en la següent imatge els resultats que va obtenir: s’observa que la hipòtesi B és la correcta, és a dir, les histones noves i velles es barregen de manera que els nucleosomes estan desprès de la replicació formats per histones velles i histones de nova síntesi. D’aquesta manera la idea global és que quan avança la polimerasa aquesta provoca la dissociació dels nucleosomes, les histones transitòriament es dissocien i aquestes histones velles (ara representades de color blanc) es barregen amb les histones de nova síntesi (ara negres).
Hem de tenir present que quan es replica el DNA també es replica la cromatina; a la fase S del cicle cel·lular és quan es produeix aquesta replicació del DNA i de les histones ja que van junts. Les histones de nova síntesi es produeixen a continuació de la dissociació de les velles de manera que, es genera un pool de histones barrejades que seran introduïdes en formar nous nucleosomes sense preferència, de manera que aquests seran heterogenis.
Hi ha nucleosomes la gran part del temps però durant un instant deixen d’existir a prop d’on es duu a terme la síntesi del DNA i de la invasió per la polimerasa. La formació d’aquests és molt ràpida.
19 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Experiment de transcripció en presència de nucleosomes Aquest experiment estudia que passa sobre la cromatina quan té lloc la transcripció. La seqüència conté des de la base 1 fins la 148 la seqüència corresponent a un nucleosoma que es va clonar i que es va triar a l’atzar de manera que, la seqüència és d’un nucleosoma (anomenat Xavier número 1) i la part més important és la part final ja que és la que hibrida amb el primer, iniciador, que correspon a la t7RNA polimerasa.
Així podíem estudiar la replicació amb un motlle cromatínic mínim. Quan afegim histones en aquesta seqüència esperem tenir un nucleosoma, tros de DNA i un iniciador. En afegir la t7RNa polimerasa podríem veure que és el que passa quan s’inicia la replicació. Hem de tenir present que l’iniciador el necessiten en elaborar la seqüenciació perquè la DNA polimerasa el necessita però la RNA polimerasa no necessita cap. Així doncs, l’iniciador serveix per la DNA polimerasa per seqüenciar el que ens interessa, que és la última regió.
La RNA polimerasa es posarà al promotor, podrà avançar però es trobarà amb un nucleosoma de manera que, podrem veure que passava en aquesta situació: si la polimerasa s’atura, si es queda igual... es un template cromatínic mínim, és el més senzill que podem trobar. El que teníem era el nucleosoma amb el DNA del Xavier número 1, Paqui 7 o també denominat NX1P7.
Observem un gel electroforètic que permet analitzar tot el que intervé en el procés de transcripció de la cromatina.
Aquest gel els permet analitzar:  DNA (NX1P7)  DNA que es produeix després que la polimerasa actuï, passi pel nucleosoma i elabori una copia A més, el gel està pensat que en les condicions en que s’elabora quan hi ha nucleosomes apareix una banda que es deguda a aquest nucleosoma (N1) i que a més, si els nucleosomes agregen o tenen excés d’histones donen zones de poca intensitat en N2 i si agreguen entre ells donen una banda que no entra en el gel denominada AN (agregated nucleosome).
Així doncs es tracta d’un gel mixta, que permet analitzar els àcids nucleics i els complexos proteïna – DNA.
20 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 En els últims 2 carrils observem que en presència d’histones hi ha una mica de material agregat perquè la constitució excés d’histones i acumula agregat. Tenim el nucleosoma reconstruït i una part de DNA agregats (els nucleosomes no es fan al 100% és un equilibri, per tant, el material elabora el producte de la reacció i part del DNA encarà esta dissociat).
En aplicar la polimerasa (carril 12) veiem que es produeix RNA, la qual cosa vol dir que el nucleosoma no ha impedit que la polimerasa passi per sobre o com sigui però el fet és que s’elabora RNA de la mida que toca; el RNA surt en la banda adient de manera que, la polimerasa ha transcrit tota la seqüència. A més, veiem que el gruix de la banda del nucleosoma s’ha fet més prim, ha desaparegut una mica el número de nucleosomes i alhora que ha passat això també s’ha fet més intensa la banda de DNA.
Quan la polimerasa passa transcriu però deu pertorbar el nucleosoma ja que aquest queda dissociat i això queda demostrat en que augmenta la quantitat de DNA lliure. Aquest no es regenera perquè part de les histones que estaven formant el nucleosomes han quedat atrapades de manera bastant irreversible i les formes agregades tenen excés d’histones. La agregació és doncs bastant irreversible de manera que, no tenim tants nucleosomes.
Amb altres dades que tenien del grup de treball es va poder arribar al mecanisme de transcripció marcat en las següent imatge: el triangle representa la polimerasa, que quan es troba davant un nucleosoma el dissocia, aleshores, les histones queden lliures i es poden unir en cromatina en forma d’excés d’histones i in vivo el que deu passar és que les histones en excés no queden aparcades sinó que tornen a formar el nucleosoma que abans s’havia dissociat el que resulta, en experiments que ja hem vist com si no passés res.
Així doncs, in vitro els agregats es formen de manera bastant irreversible el que ens permet observar-los mentre que in vivo es formen de forma transitòria i tornen a elaborar un nucleosoma sense cap tipus de problema.
Tenim tendència a pensar que en el nucli hi ha DNA i el DNA independent no existeix, el DNA no està esponjat al interior del nucli. Observem que en E.Coli en els nuclis de les cèl·lules la concentració de DNA pot ser de 0,1 g/ml mentre que el 6 volum total de DNA és de 4,23·10 de manera que, el nucli té una gran quantitat de DNA. Aquesta imatge representa la quantitat de molècules que trobem en el nucli. Observem en la imatge que la concentració del material que hi ha en el nucli és molt elevada de manera que, el DNA no està esponjat sinó que tot està ple de nucleosomes i no és estrany la hipòtesi esmentada anteriorment perquè si els nucleosomes poden unir histones en excés és perquè estan per tot arreu però després que la polimerasa passi els nucleosomes i les histones voldran estar en la forma més estable possible de manera que, es tornarà a formar l’octàmer.
21 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Mecanisme de la polimerasa per desfer els nucleosomes La síntesi de RNA és de 5’3’ i observarem una bombolla on té lloc la transcripció que seran aproximadament 17 pb que queden obertes. Davant la polimerasa hi ha un nucleosoma, com pot fer la polimerasa per desfer aquest? Sabem que en aquest procés la tensió topològica pot ajudat, pot apretar el DNA. Sabem que si volem moure un objecte hem de fer una força i per tant, elaborem un treball determinat per el qual necessitem energia (el treball és energia). Cal determinar d’on treu la polimerasa l’energia per desfer l’estructura del nucleosoma.
Sabem que quan entra un nou nucleòtid s’allibera un pirofosfat i aquesta hidròlisi allibera energia de manera que, ja tenim energia per fer un treball però necessita una altra cosa; per moure un objecte hem de tenir una força que es pugui aplicar sobre aquest objecte (lleis de Newton) i també necessitem una força d’ancoratge. El punt d’ancoratge de la polimerasa és el DNA, abans que el DNA es dupliqui observarem que hi ha un dúplex híbrid, el nou nucleòtid s’elaborarà més endavant de l’híbrid i el dúplex no el deixarà desfer-se, no deixarà que la doble hèlix es desfaci de manera que, el nou nucleòtid entrarà 0,34 nm més endavant però en un lloc on si es posa representa un avenç d’aquesta distància. Així doncs la polimerasa actuarà com una pala mecànica.
Si posem davant una biotina i streptavidina que elaboren unions no valent que són tant fortes com les covalents s’ha vist que la polimerasa pot arribar a desunir-les de manera que, la polimerasa té capacitat d’elaborar un treball mecànic molt fort, el que li permet, entre d’altres, desfer el nucleosoma.
22 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Modificació en la cromatina Havíem vist sistemes simplificats que ens permetien estudiar en presència de partícules nuclis la replicació, la transcripció i també la regulació de l'expressió gènica (Aquest tema no l'hem parlat però forma part del tema d'autoestudi).
Les histones poden patir modificacions químiques postraduccionals. Una molt important és l’acetilació de les lisines que té la particularitat ja que desapareix la càrrega positiva que podríem tenir. Això té molta importància estructural ja que pot comportar la expressió o la repressió de gens.
Veiem un exemple extret d’una revista on es va trobar que dins d‘aquell embolic de repressors i activadors que hi ha quan s’estudia l’expressió gènica, en els eucariotes hi ha elements d’aquestes proteïnes reguladores que poden donar corepressors i aquests corepressors són desacetilases de les histones.
Una desacetilasa es pot considerar un corepressor perquè elimina grups acetil i si eliminem aquests grups de les histones ens queda una càrrega positiva fent que puguin interaccionar millor amb el DNA i per tant, provocar un millor empaquetament de la cromatina. També pot passar el contrari, on les histones s’acetilin i que es tregui una càrrega positiva, en aquest cas actuaria com a repressor.
HISTONA H1 La histona H1 està col·locada una mica més per fora de la partícula nucli. Es representa amb dues cues desestructurades en N i C-terminal; recordem que les altres histones només presenten desestructurada la N-terminal.
Una vegada ubicada la H1, també es va avançar perquè el tros globular es va poder cristal·litzar després de digerir amb proteases les dues cues (mitjançant nucleases a poca concentració). Històricament van treballar amb la histona H5 de pollastre que és la mateixa que la H1 i és per aquest motiu que en molts treballs trobarem que fan referència a la H1 com H5.
Van trobar una estructura que era molt semblant a l’estructura de les proteïnes que interaccionen amb el DNA de manera específica. Per exemple la CAP que té a veure amb l’operon i aquesta proteïna que havia estat tridimensionalment estudiada té una estructura molt similar a la H5. Aquesta similitud també es troba amb altres proteïnes que també interaccionen de manera específica amb seqüències concretes de DNA. Cal tenir present que la part globular de la histona H5 es diferencia d’aquestes proteïnes perquè interacciona en general amb qualsevol seqüència, és a dir, no és d’interacció específica.
23 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 En l’autoestudi, un dels motius estructurals de les proteïnes que participen en els processos de l’expressió gènica són proteïnes de la família que tenen l’estructura: hèlix – turn – hèlix. La part grossa es fica en el solc gran i fa interaccions específiques. La hèlix que es fica dins del solc gran es coneix com a hèlix de reconeixement i quan es va estudiar la part globular de H5 es va veure que la hèlix 3 és la que s’encasta amb el DNA, tot i que no ho fa amb interaccions específiques exerceix el paper d’hèlix de reconeixement.
Cal tenir present que el plegament de la H1 no és el mateix que el que tenen les histones en el core i això ho veurem en un seminari.
EMPAQUETAMENT DE LA CROMATINA Un nucli de cèl·lules humanes haploide té aproximadament 3 Gb de DNA i podem calcular quant ocupa sabent que: El cromosoma humà 1 té uns 100 cm de DNA dins. El cromosoma amb més DNA que es coneix fa referència al d’una planta i conté 10 m de DNA. Obtenim que aquestes magnituds són molt grans de manera que el DNA ha d’estar altament empaquetat. Hi ha un terme que es fa servir molt en aquest àmbit i és el packing ratio o grau d’empaquetament i ens diu la longitud del DNA que estem considerant estès dividit per la longitud de l’estructura que conté el DNA.
Si posem els cromosomes metafàsics un darrera l’altre, obtindríem un total d’aproximadament 100 µm i dins es fiquen 6 cromosomes amb una longitud de 10 µm- Per tant, podem calcular el grau d’empaquetament com: Aquest valor ens està indicant que el DNA queda molt reduït quan l’introduïm dins del cromosoma. També podem calcular el grau d’empaquetament en el nucleosoma com: Observem que si fiquem el DNA dins del nucleosoma es justifica un empaquetament de 7 però hem d’arribar a un 4 empaquetament molt superior, de 10 .
Estructura d’ordre superior de la cromatina Amb els resultats anteriors van concloure que ha d’haver-hi més estructures per sobre del nucleosoma. A la següent imatge observem una sèrie de nucleosomes separats entre ells però units per DNA que es fa visible. Els mateix autors d’aquesta imatge diuen que la fibra estesa de cromatina pot plegar-se de tal manera on s’insinuen els nucleosomes. La imatge inferior faria referència a una estructura més compacta que adopta la cromatina i que es coneix com fibra de 10 nm.
La imatge superior fa referència a una fibra una mica més gran i que rep el nom de fibra de 30 nm.
24 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 En el microscopi electrònic s’observen intermedis. Moltes vegades trobem una estructura semblant a la de 10 nm però que es troba fent zigs – zags. Cal tenir present que el que veus depèn molt de la concentració iònica del medi: si hi ha una concentració baixa de sals (potassi, sodi o magnesi) trobarem majoritàriament l’estructura de la fibra de 10 nm que és la menys compactada; si posem una mica més d’ions passem a una estructura de zig – zag i si poses unes concentracions petites però significatives, pots arribar a veure la fibra de 30 nm. El magnesi com que és un ió divalent té propietats estructurants molt més fortes que els altres ions.
Hem de tenir en compte que és un tema estructuralment molt important però que té una dificultat de base ja que no són estructures regulars ni estructures petites, sinó tot el contrari. El fet que aquestes estructures siguin heterogènies fa que no es puguin cristal·litzar i per tant, no es poden aplicar aquestes tècniques fent que s’hagin hagut d’utilitzar tècniques de microscòpia, sobretot, electrònica. La difracció ens ha permès estudiar proteïnes bastant grosses, el core particle i el ribosoma; hi ha algun cas de sistemes que tenen 4 nucleosomes però hi ha moltes dificultats per fer-ho i l’anàlisi és de baixa resolució.
Estructura de la fibra de 30 nm Tornem a trobar-nos en allò tan bàsic de la biologia molecular i és que malgrat les dificultats es proposen hipòtesi estructurals, és a dir, models estructurals.
Model del solenoide El model més acceptats de tots és el model del solenoide proposat per Aaron Clutch i els seus col·laboradors i que està basat en l’observació de les fibres de 30 nm.
Quan hi ha poca concentració de sal la cromatina està estesa i quan hi ha més sal, s’empaqueta més la H1 que entra dins (color negre). Quan hi ha prou sal es forma la fibra de 30 nm que ell va anomenar solenoide i es tracta d’una hèlix senzilla d’un sol origen.
El nom de solenoide prové del camp elèctric on s’enrotlla un cable sobre un cilindre que és el mateix que passa amb la cromatina: els nucleosomes estan envoltant una mena de tub i estan formant una hèlix. Per tal de entendre-ho millor van elaborar un model però en aquests dibuixos no es veu el DNA d’unió, que segons el que va dir aquest autor està corbat ja que per anar d’un nucleosoma a l’altre ho ha de fer. Per tant, després d’unir-se encara queda un espai central i és per això que s’espera que els solenoides tinguin un espai buit en el seu interior.
El model més acceptat proposa que hi ha 6 nucleosomes per volta d’hèlix. De manera que quan el solenoide fa una volta, l'espai que hem avançat és de 11 nm. Així doncs, el solenoide té el Linker corbat i a més a més, té un pas de rosca de 11 nm/ volta.
25 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Model de la cinta helicoïdal Altres autors es van fixar molt en l’estructura del zig zag i el que proposen és que el DNA linker es manté estirat i malgrat això, el zig zag ens el podem imaginar com una cinta que es plega sobre sí mateixa formant un helicoide.
La gran diferència d’aquest model respecte l’anterior és que aquest té el linker estirat, en una disposició estesa i en paral·lel a l’eix de la fibra.
Model del linker creuat El model del linker creuat també té molts autors a favor. En aquest cas, enlloc de considerar que el linker queda paral·lel a l’eix el que considera és que el zig zag adopta una forma helicoïdal amb el linker dins de l’estructura, tal com podem veure a la imatge. Així doncs, s’entrecreuen i com a conjunt queda una mena de doble hèlix amb dos orígens (color blanc i color blau).
Model de super beads El model de super beads que també es conegut com a model de les súper boles o de les fibres discontinues es produeix dins del nucli. No té sentit pensar en fibres de 30 nm de longitud ja que normalment no s’obtenen fibres tan llargues; és fàcil obtenir fragments de fibres de manera que proposen que la cromatina és un conjunt de fibres que s’agreguen i el linker que surt del conjunt arriba a un altre conjunt de nucleosomes agregats i hi trobem diversos conjunts.
Per tant, el que realment tenim és una fibra de 30 nm discontinua.
Model del solenoide interdigitat compacte Quan afegim magnesi 2M el que s’observa en el microscopi electrònic són unes fibres de cromatina més compacte, de l’ordre de 3 vegades malgrat que semblava impossible que s’arribés a un grau de compactació tan gran.
Després de fer molts estudis de microscòpia van modelar amb un programa tridimensional i els hi va permetre treballar respectant les mides que té el nucleosoma (determinades per cristal·lografia. Aquests esdeveniments van portar a proposar el model del solenoide interdigitat compacte que és complex de veure com està constituït.
Observem que aquest model (B i C) és molt més compacte que el model del solenoide normal (E) que acaba sent més llarg.
Aquests estudis es van publicar al 98 però es va postular al 95. A l’any 2005 un altre laboratori també va trobar aquesta estructura i ja es considera que és una forma que la cromatina pot adoptar quan està molt compactada.
26 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Estructura del cromosoma metafàsic El grau d’empaquetament al qual hem arribat encara és petit i hem d’encarar-nos a una estructura més compacte que és el cromosoma metafàsic. Des dels anys 60 es van obtenir radiografies de cromosomes metafàsics on els autors per poder veure alguna cosa tendien a fer preparacions amb molt poca concentració de cations i el motiu és que si poses molts cations (sobretot magnesi), l’estructura es torna tan compacte que es torna molt sòlida.
La micrografia que veiem tan ferma està reproduïda amb cromosomes que han estat estesos en 0 absolut de cations, és a dir, amb aigua. En aquestes condicions el cromosoma s’esponja i el que es veu són una mena de fibres. És per aquest motiu que la gent ha deduït que els cromosomes estan fets de fibres que s’enrotllen i s’empaqueten.
Experiment fet al laboratori de Laemmli. Scaffold/loop model Per poder estudiar l’estructura del cromosoma es va anar més enllà i es van extreure completament les histones dels nucleosomes, en conseqüència el DNA s’allibera. Van veure que els DNA en els cromosomes metafàsics estan formant unes llaçades (loops) i és per això que el model el van anomenar model dels llaços radials (radial loop model) però, Laemmli va afegir un element extra.
Com que queda un vestigi de cromosoma, va suposar que això devia ser una mena de bastidor que estava aguantant l’estructura i fixava les llaçades per una base i que en presència d’histones estava retingut perquè hi havia un esquelet central que organitzava el cromosoma.
És per aquest motiu que el model també rep el nom de la bastida o de l’esquelet (scaffold loop model).
Fent micrografies cromosomes, a les estudiant superfícies en dels condicions desnaturalitzants, es veuen unes estructures que tenen un diàmetre de 30 nm de manera que això feia pensar que en el cromosoma metafàsic trobem llaçades de cromatina adoptant la forma de fibres de 30 nm que estan unides a l’scaffold.
27 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Organització de la cromatina En aquesta imatge es representa la formació del cromosoma radial que hem vist abans. Aleshores es comença parlant del DNA lliure, que si afegim histones formem la fibra de cromatina prima que a vegades és coneguda com a collaret de perles o rosari. El packing ratio del DNA lliure és de 1 i en el cas de la fibra de cromatina prima és d’aproximadament 7 nm.
Quan anem al següent nivell de compactació amb el solenoide observem que la packing ratio augmenta fins a 40. Si a sobre a la fibra li fem fer llaçades obtenim que el valor de packing ratio és de 70. Aquestes fibres les podem posar unes sobre les altres entorn el centre del cromosoma i arribem al 10 4 com a raó d’empaquetament.
Aleshores, aquest model ens permet justificar l’empaquetament del DNA. No és l’única manera de fer-ho però sí que ens pot servir per pensar en termes d’empaquetament.
Nuclis interfàsics Això s’ha volgut lligar amb la cromatina a la intefase i van haver-hi forces anys on el camp es va capficar molt en el nucli interfàsic. A la imatge veiem un nucli interfàsic normal (esquerra) i un nucli interfàsic on han extret gairebé tot (dreta); únicament tenim un 10% de la proteïna total, un 2% dels fosfolípids i un 1% del DNA. Malgrat això, encara hi ha una estructura que recorda al nucli original. Van pensar que en el nucli hi ha una matriu (nuclear matrix) que és important per organitzar el DNA i la cromatina dins del nucli.
En els llibres de text se sol recollir que el cromosoma metafàsic té un scaffold proteic i que el nucli interfàsic té una matriu nuclear. S’ha volgut lligar una cosa amb l’altre i aleshores el que es pensa és que la matriu nuclear organitza la cromatina en forma de llaçades però en la matriu, aquestes llaçades estan molt separades entre elles.
Quan passem a la profase i metafase, aquestes llaçades s’acosten i acaben constituint les llaçades que trobem dins de les cromàtides dels cromosomes metafàsics.
28 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 Com que també van trobar que digerint molt la cromatina amb nucleases s’obtenen trossos de DNA amb una determinada seqüència, es va pensar que aquests trossos tan resistents estan relacionats amb la unió del DNA amb l’scaffold (la matriu). S’ha parlat de seqüències SAR (Scaffold Attachment Regions) i de seqüències MAR (Matrix Attachment Regions), Durant temps es va buscar quin era l’scaffold i es va veure que dins del cromosoma hi ha moltes proteïnes que no són histones però que estan en molt poca quantitat. La que està present en major quantitat és la topo II i és per això que durant molt temps s’ha considerat que podria ser un dels components de l’scaffold. Més recentment s’han trobat proteïnes de la família SMC (structural mainteinment of chromosomes) que també podrien estar relacionades. Totes dues proteïnes estan ubicades en el centre de les cromàtides.
Experiment al laboratori de Marko Hi ha un experiment fet al laboratori de Marko que és molt senzill i modern. Consisteix en agafar cromosomes i xuclar-los amb micropipetes utilitzades en citogenètica que el tiben una mica perquè estigui estirat i és aleshores quan afegeixen nucleasa micrococcal i deixen que passi el temps. Es veu com aquesta estructura es va corbant a mesura que va passant el temps i finalment es trenca.
La conclusió de Marko és contundent ja que si hi hagués scaffold, tot i que tallessis el DNA, quedaria l’esquelet. Potser sí que hi ha proteïnes que estan en el centre del cromosoma però si el talles se’n van i per tant, no faran d’scaffold.
Actualitat en els cromosomes metafàsics Amb el que s’està treballant en els últims 10 anys en l’àmbit dels cromosomes metafàsics no té res a veure amb el que hem vist fins ara.
Si respectes la concentració iònica que hi ha en els cromosomes a la metafase, trobem imatges que ens indiquen que són molt densos fins el punt de no poder diferenciar res.
Això no és convenient quan vols estudiar l’estructura.
Per tant, el que voldran fer és desmuntar-ho una mica però no massa i per fer-ho posaven les reixetes del microscopi on tenien el DNA a un bany a condicions fisiològiques metafàsiques i les ficaven a 37°C. El que van trobar és que quan desmuntes cromosomes en condicions suaus trobem estructures laminars apilades.
29 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T7 El que tenim davant són làmines però si això són làmines que venen de cromatina vol dir que hi ha DNA i recordem que havíem dit que aquest és una fibra. Si agafem les làmines que es coneixen com a plaques i les desnaturalitzem amb EDTA (quelant de magnesi) observem que surten fibres de cromatina. Per tant, la cromatina s’ha plegat i està empaquetada en forma de làmines multicapa.
En el cromosoma de la pàgina anterior, normalment no es veu res però a vegades per l’extensió es poden veure laminetes que estan enganxades en el cromosoma que sembla que estiguin posades en paral·lel a l’eix de la cromàtide b; en a sembla que les làmines que es poden intuir són perpendiculars a l’eix de les cromàtides.
Hipòtesi de les plaques fines Tot el que tenim lliga amb la hipòtesi estructura de les plaques fines i és que la cromàtide està feta per capes de cromatina que s’apilen i estan perpendiculars a l’eix de la cromàtide. Als telòmers, sobretot, aquestes làmines quan es fa una desnaturalització suau s’esllavissen i això és normal perquè tenen més cohesió dins de les làmines que entre làmines; quan nosaltres ho mirem al microscopi electrònic obtenim plaques que s’han escapat de l’estructura.
S’ha vist que gruix de cada làmina és de 6 nm i aquesta està plena de nucleosomes i recordem que els nucleosomes tenen un diàmetre d’11 nm. Això s’explica perquè els nucleosomes deuen estar de costat, on tenen un gruix d’uns 6 nm, però quan s’estudia no es veu això sinó que es veu una estructura plena d’estructures circulars.
El que pensen que passa és que en les capes se situen els nucleosomes però aquests se situen de forma irregular de manera que la capa número 2 s’interdigita amb la 1 i la número 3 amb la 2. Per tant, és la interdigitació la que ens permet justificar tanta compactació en la cromatina. Hi ha un avantatge en la interdigitació i és que es formen uns contactes laterals que donen estabilitat a l’estructura. El DNA no passa a la capa de sota fins que no ha acabat d’omplir la de sobre i amb això aconseguim una bona connexió covalent.
Cal saber que en realitat no és una pila de plaques sinó que és una placa única que està plegada en forma d’helicoide.
Perquè el DNA en cadascun dels punts tingui la mateixa tensió i assegurar-te que no es trenqui, es tracta d’una estructura helicoïdal continua que a més, permet aquest empaquetament.
30 ...