Cultius Cel·lulars T1 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2015
Páginas 5
Fecha de subida 12/03/2015
Descargas 7

Vista previa del texto

1 TEMA 1. INTRODUCCIÓ, HISTÒRIA I EQUIPAMENT BÀSIC.
1.1 INTRODUCCIÓ I HISTÒRIA DELS CULTIUS CEL·LULARS A finals del segle XIX (1885) es van aconseguir mantenir (no proliferar) per primera vegada cèl·lules vives fora dels organismes dels quals procedien un cert temps en solució isotònica. A principis del segle XX, Duran i Reynals va poder agafar extractes filtrats d’un tumor i inocular-los en un animal, al qual se li induïa la proliferació d’aquest tumor. L’extracte de cèl·lules tumorals contenia un virus (rous sarcoma virus), això va fer que defensés la hipòtesi de que la causa del càncer era únicament deguda a infecció vírica. Avui dia sabem que no és així, el càncer pot tenir moltes causes (entre elles, la infecció vírica).
Anys més tard, Carrel (premi Nobel) va dissenyar un sistema de sutura que afavoria la ràpida cicatrització dels vasos sanguinis. Aquest va veure que agafant fragments de vena sana i inoculant-los en artèries malmeses, podia regenerar l’artèria. El motiu per el qual això succeïa era que les cèl·lules de vena, inicialment lleugerament diferents de les d’artèria, podien desdiferenciar-se i diferenciar-se novament en cèl·lula d’artèria. Aquesta capacitat que tenen les cèl·lules s’anomena plasticitat, i és definida com la capacitat que tenen aquestes de desdiferenciar-se i diferenciar-se en altres tipus cel·lulars que no són del seu origen en funció de les necessitats i requeriments ambientals.
Carrel, juntament amb un famós aviador, va inventar un sistema en el qual mantenia fragments de teixits i òrgans durant anys, solament en condicions estèrils i amb una solució isotònica en constant circulació.
1948 es va aïllar una línia cel·lular i se’n van obtenir els primers clons. L’any 52 es va obtenir la primera línia cel·lular humana anomenada HeLa i universalment reconeguda, doncs la mostra primigènia procedia d’una dona anomenada Henrietta Lacks que va patir un carcinoma uterí i va morir d’aquesta afecció. Es van poder aïllar les seves cèl·lules tumorals i obtenir la línia.
Així doncs, a partir dels anys 50 van començar a proliferar els cultius cel·lulars, i els estudis que es van fer sobre els requeriments nutricionals de les cèl·lules en aquestes condicions encara són vàlids. Es van idear molts medis de cultiu que intentaven substituïr el sèrum (preparació líquida que porta molts components necessaris per al creixement de cèl·lules de qualsevol tipus). Els medis menys rics requerien l’addició de sèrum i els més rics no, però són molt més complicats de fabricar.
L’any 64 es va desenvolupar el medi HAT, que serveix per seleccionar les cèl·lules heterocarionts (fusió de fibroblast de ratolí amb cèl·lula humana per tenir una cèl·lula amb el mateix nucli).
Als anys 70 es produeix el primer anticòs monoclonal. Si fusionem una cèl·lula productora d’un anticòs concret (limfòcit B) amb una cèl·lula tumoral, podem obtenir una cèl·lula immortal capaç de sintetitzar anticossos (hibridoma).
Posteriorment es van aïllar cèl·lules pluripotents embrionàries de rates i d’humans. Finalment les cèl·lules iPS.
1.2 APLICACIONS DELS CULTIUS CEL·LULARS.
El coneixement del funcionament de les rutes metabòliques, la replicació, i altres processos cel·lulars molt importants són gràcies als cultius cel·lulars. És més econòmic que fer els experiments en organismes sencers i a més ens permeten repetir l’experiment si ho necessitem, si prèviament hem reservat cèl·lules de la mateixa línia.
Els cultius també són utilitzats per produïr productes d’interès farmacològic, com són la insulina, hormones de creixement, anticossos monoclonals, etc. També s’utilitzen en processos mèdics com el diagnòstic prenatal o preimplantacional.
En conjunt, podem dir que els cultius cel·lulars són una eina que és utilitzada en benefici de moltes branques de la ciència.
1.3 EQUIPAMENT BÀSIC D’UN LABORATORI DE CULTIUS 1.3.1 Campanes de flux Per a poder desenvolupar cultius cel·lulars, primer ens hem d’assegurar que el medi és estèril. Això ho aconseguim amb campanes de flux, que bàsicament filtren l’aire perquè no hi quedin microorganismes, que poden ser de dos tipus: Verticals: les làmines d’aire estèril baixen de dalt a baix i toquen la mostra per la part superior.
Horitzontals: les làmines d’aire estèril van de l’interior a l’exterior de la campana. Són menys eficients que les verticals, però ens permeten utilitzar material òptic. Si el flux ve “de dalt”, els microorganismes d’aquest material pot ser que “caiguin” sobre el cultiu i el malmetin.
Cal tenir en compte que les mans, la bata, i altres materials no són estèrils, i cal que tinguem en compte la seva manipulació prèvia als cultius cel·lulars. A més, cal netejar amb etanol 70% la campana abans i després de l’experiment.
1.3.2 Autoclau i elements de filtratge A part de les campanes de flux per esterilitzar l’ambient de treball, cal també que esterilitzem la resta d’equipament (flascons, pipetes, etc.) de vide o plàstic amb autoclau, així com els medis de cultiu i els reactius per filtració. Si hem de filtrar petites quantitats ho fem amb xeringues i si ho hem de fer en grans quantitats ho fem amb una bomba.
En quant als medis, generalment els comprem ja fets, però si en necessitem una gran quantitat (per a un bioreactor, per exemple) els podem preparar nosaltres mateixos i ens sortirà molt més econòmic. Només hem de comprar medi liofilitzat i afegir-hi aigua tractada a través de processos de destil·lació i purificació.
1.3.3 Incubadors de CO2 Els incubadors de CO2 serveixen per mantenir estable la temperatura dels cultius (37ºC en cèl·lules de mamífer). Aquests aparells han de poder recuperar ràpidament la temperatura òptima si es deixa escapar una mica de calor. Els més sofisticats tenen incorporada una “camisa d’aigua”, que no és més que aigua calenta en circulació per les parets de l’incubador. L’alternativa econòmica és un incubador amb ventilador. El material de les parets i les reixetes és d’acer inoxidable en general, però pot ser de coure per obtenir una major resistència a la contaminació per fongs i/o bacteris (però és més car).
En els laboratoris que treballen en producció, és a dir, que necessiten cultivar a gran escala, en lloc de tenir els flascons/plaques en incubadors els tenen en cambres adaptades a temperatura constant. En aquestes cambres no hi ha CO2 per regular la temperatura, sinó que utilitzen un sistema de circulació de l’aire per salvar de la diferència de temperatura entre els cultius de la part superior i els de la part inferior.
Tots els incubadors tenen a la part inferior una bassa d’aigua tractada, que és molt susceptible a que hi creixin organismes i ha d’estar molt ben controlada.
1.3.4 Material òptic És necessari material òptic per visualitar l’estat dels cultius. Com que les cèl·lules no poden estar tenyides ni fixades perquè això les destruïria, hem d’emprar mètodes alternatius: tècniques de Nomarski i de contrast de fases.
Tècnica de contrast de fases En el condensador hi ha un diafragma anul·lar que evita que la llum vagi directament a la mostra, a diferència del microscopi òptic clàssic. Aquesta llum passa pel condensador i incideix a la mostra obliqüament. Això fa que poguem veure les parts de la cèl·lula ombrejades de forma diferent en funció del seu índex de refracció.
Microscopi invertit Aquests microscopis tenen una altra característica. Els cultius els fem en plaques o flascons, i les cèl·lules estan adherides al medi d’aquest. El medi té un gruix; si posem tot el cultiu directament al microscopi l’objectiu no arribarà a enfocar a baix de tot, on es troben les cèl·lules. És per això que els microscopis que utilitzem són microscopis invertits, en els quals els objectius estan per sota de la platina i just a sobre d’aquesta hi ha la mostra. Això fa que la distàncientre l’objectiu i la cèl·lula sigui petita i es pugui enfocar correctament.
Microscopi invertit de fluorescència Per utiltizar aquests microscopis cal treballar amb cèl·lules modificades genèticament perquè emetin fluorescència. S’utilitza molt en la teràpia gènica, per identificar si el gen d’interès s’ha inserit o no dins del genoma hoste: si transfectem aquest gen juntament amb un gen codificant per la GFP sota un mateix promotor, i si la cèl·lula mostra fluorescència és que sí que s’ha inserit. Amb aquests microscopis podem arribar a veure les unions cèl·lula-matriu (contactes focals).
També podem aplicar fluorescència per seguir la motilitat d’un determinat organisme (p. Ex. Cuc Elegans).
Microscopi confocal Aquest microscopi s’utilitza quan hem marcat una determinada proteïna d’una cèl·lula amb un anticòs amb fluorocrom. Es fa un scan làser pla de la cèl·lula, de manera que la major part de la fluorescència que emet procedeix del punt que hem marcat i podem localitzar-lo. Podem fer l’scan de dues superfícies i obtenir imatges de gran nitidesa. Hi ha microscopis confocals amb incubador de CO2 incorporat perquè les cèl·lules puguin viure i poder fer “pel·lícules” de la seva activitat biològica.
1.3.5 Sistemes de recompte cel·lular L’aparell utiltitzat per al recompte cel·lular s’anomena hemocitòmetre o cambra de Neubauer. Consisteix en un porta excavat de 10-4 mL al qual hi apliquem aquest volum de cultiu, i comptem les cèl·lules que hi ha en aquest espai.
Abans es feia manualment, però recentment s’utilitzen els recomptadors automàtics. N’hi ha de molts tipus, els més sofisticats són unes pipetes que a la punta porten un dispositiu que fa que cada cop que les cèl·lules passin a través d’aquest interrompin el corrent elèctric que hi circula i generin així un senyal detectable.
1.3.6 Criopreservació Consisteix en congelar les cèl·lules per tenir “stocks”. Si no ho féssim, les cèl·lules proliferarien i moririen per falta d’espai i nutrients. Podem fer-ho de dues maneres: a -80ºC o bé amb nitrogen líquid. Amb el primer mètode, les cèl·lules poden reservarse entre 6 mesos-1 any, al cap d’aquest temps experimenten una pèrdua de la viabilitat. El nitrogen líquid (-190ºC) ens permet conservar-les durant moltíssim més temps. Podem congelar les cèl·lules en el líquid mateix o bé en el vapor, es sol utilitzar el primer mètode.
1.3.7 Com hem de dissenyar un bon laboratori de cultius? El més important és la localització d’una sèrie d’elements clau: 1 Bombones de CO2: han d’estar a l’aire lliure, fora del laboraori. Una fuita d’aquest gas en un espai tancat pot arribar a ser mortal, doncs desplaça l’oxigen i provoca asfíxia. És necessari que s’instal·lin detectors de CO2 a la meitat de l’alçada de la persona més baixeta que treballa en el laboratori. Tanmateix, el risc 0 no existeix perquè hi haurà com a mínim un sistema de conducció de CO2 que porti el gas fins l’incubadora i passarà per dins del laboratori.
2 Punts d’aigua: no hi poden haver piques, safarejos, aigua no controlada en general doncs són un focus de contaminació. Els banys maria sí que estan permesos.
3 No posar en la mateixa poiatta la cabina de flux/centrífuga i l’incubador. Aquests dos elements quan funcionen produeixen unes vibracions, que poden arribar a l’incubadora i alterar el creixement de les cèl·lules que s’adhereixen al medi de cultiu.
4 No pot haver-hi ni refrigeradors ni autoclaus.
...