TEMA 1.2 (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2016
Páginas 11
Fecha de subida 26/04/2016
Descargas 6
Subido por

Vista previa del texto

Microbiologia I TEMA 1.2: TÈCNIQUES MICROBIOLÒGIQUES BÀSIQUES OBSERVACIÓ DELS MICROORGANISMES Els microorganismes són molt petits i utilitzem microscòpics per observarlos. El microscopic optic utilitzem llum visible; mentre que el electrònic utilitzem fotons.
Per observar els microorganismes nosaltres veiem la llum transmesa (la que transmet el microorganisme; on normalment transmeten la mateixa i la podem augmentar amb tincions). El contrast és la intensitat de la llum.
Al augmentar la imatge també augmentarem la resolución i el contrast d’aquesta.
Microscòpia o Poder de resolució d’un microscopi. És la distancia més petita entre 2 punts adjacents. (4nm té un poder de resolución més gran que 5nm). El poder de resolución depèn de: - La dimensió de la lent: com més gran més poder de resolució.
- La longitud d’ona de la llum que travessa la mostra.
- L’índex de refracció: la relació entre la velocitat de la llum que viatge al buit i la velocitat de la llum quan viatge en un determinat objecte. Entre el material i la mostra (pot variar).
Ex: I.Raigua pura=1.33 (Viatge més lent→més resolució). I.Raire=1 o Obertura numèrica d’un microscopi: 𝑛 · 𝑠𝑖𝑛𝛼 La dimensió i la mida de la lent són propietats intrínseques.
Preparacions en fresc (per microorganismes vius → no fem tinció, per tant, no es pot augmentar el contrast).
o Preparació simple: Directament s’observa al microscòpic o Preparació en gota pendent: s’utilitzen portaobjectes excavats (depressió al mig) on es posa la gota al cobreobjectes i es gira i aixi la gota queda penjant al forat. Serveix per veure si el microorganisme es mou.
Microbiologia I Al haver aire el angle és mes petit: disminueix el poder de resolució Oli (I.R=1.5; com el del vidre). Amb l’oli l’angle es fa mes gran: el poder de resolució augmenta TINCIONS La majoria de tints són efectius si es fixa (morta i adherida) al vidre del portaobjectes.
o Fixació - Escalfor: fas un frotis, es seca i es dóna calor (agafes amb pinces i ho passes pel bunsen) → Es fixa amb la calor i desnaturalitza les proteines: maten bacteris, per tant, veiem microorganismes morts.
- Química: s’afegeix un producte fixador com per exemple: àcid òsmic, formaldehid, gluteraldehid. (Es distorciona l’aparença i no permet veure la mobilitat: queden mortes).
o Colorants: Temps per ser absorbit per la mostra.
- - Grups cromòfobs (2 enllaços)  Iònics: cèl·lula (més freqüent)  Covalents: DNA  Hidròfobs: Lípids Bàsics (+) (Cl-): tenyeixen estructures amb càrrega negativa (-).
Ex: blau de metilè, cristall violeta, safranina, verd de malaquita, fucsina básica.
- Àcics (-) (-COOH, -OH): tenyeixen estructures amb càrrega positiva (+). Ex: fucsina àcida, roig… o Mordents: complement que s’utilitza en tincions (NO COLORANTS). Augmenten l’afinitat de la cèl·lula pel colorant.
Ex: lugol (T.gram), àcid lactàmic (T.flagels).
SÓN Microbiologia I o Tipus de tincions - Tincions simples: totes les cèl·lules es tenyeixen igual. Veiem la mida, la forma i la distribució de la cèl·lula. Es fa primer una fixació + mordent + colorant (cristall violeta); es deixa temps i es renta l’excès.
- Tincions diferencials: utilitza dos colorants: un primari i un de contrast. Aquests s’utilitzen per distinguir bacteris per la paret bacteriana.
 Tinció de Gram: fixació + colorant primary (cristall violeta) + mordent (lugol) → rentat → tinció amb el de contrast (safranina). Gram + lila, Gram - rosa.
 Tinció àcid-alcohol resistent: diferenciar bacteris amb la paret d’àcid micòlic. Si té paret (vermell → etanol clorhidric roig), si no te paret (transparent).
- Tincions especials  Tinció d’espores: formes de resistència que sintetitzen alguns bacteris. Tenen paret amb moltes capes. Són resistents a altes temperatures, pressió… podem veure la posición de l’espora, la forma i poden deformar o no el bacteri. Per tenyir l’espora, de colorant primari utilitzem el verd de malaquita, on es posa varies vegades per afavorir que entri i després es decolora (tot menys les espores) i s’afegeix un segon colorant (cèl·lules vegetatives: rosa).
 Tinció de flagel: no podem fer fixació per escalfor perque es separen els flagels. Es fa una fixació química. Li apliques un mordent (àcid lactàmic) i colorant (rosanhilina) per veure el número i la disposició dels flagels.
 Tinció de càpsula: és una tinció negativa, és a dir, tenyeix el fons i no la mostra (el colorant no penetra la mostra, i si el microorganisme no té càpsula quedarà tenyit). El colorant pot ser: tinta xinesa, hidrocina, sulfat de coure.
Microbiologia I MICROSCÒPIA ÒPTICA Hi ha dos tipus de microscòpis òptics: 1. Simple: no tenen molts augments 2. Compostos: - Camp clar: segons la llum que absorbeix - Camp fosc: veure cèl·lules vives sense tenyir. Els únics ratjos de llum són els que transmeten la mostra (condensador especial). No hi ha ratjos desviats.
- Contrast de fases: cèl·lules vives sense tenyir. Cada material té una composició diferent i els ratjos es mouen diferent. (↓dens, ↑ ràpid).
- Fluorescència: absorbeixen llum d’una longitud d’ona superior (visible). Tenyim la mostra amb fluorocroms (si no té fluorescència).
Al voltant de la cèl·lula es veu un al·lo de llum Ex: taronja d’acridina (DNA), DAPI, FiTC, Rodamina.
Ús: tall ultrafins Ús: tota la cèl·lula Com ↑ dens ↑ electrons.
No es recullen els electrons transmesos, sinó que els electrons primaris que entren emeten electrons secundaris que són els captats pel ordinador (no són captats sinó que reboten de la mostra).
Els electrons travessen la mostra. Per augmentar el contrast es fan servir metalls pesants: Pd, Cu, U. A més a més en els microscopis amb electrons el portaobjectes es de coure i no de vidre.
Microbiologia I MICROSCÒPICA ELECTRÒNICA  M.E de transmissió (TEM) Tallada amb ultramicrotom  M.E de rastreig (SEM) Permet observar l’estructura tridimensional → Maneres per preparar la TEM o Criosublimació: congelar la mostra i la sublimació fa que alguns orgànuls sobresurtin de la mostra. Es fa un tall sec i una copia molt fina del que és la superficie que hem aconseguit. La copia es amb pols de carbó.
*La tinció negativa es una fina capa d’àcid que no penetra a la mostra però enfosqueix el fons (tenyeix tot menys la mostra) o Ombrejat metàl·lic: es fa servir en mostres senceres.
NOVES TÈCNIQUES DE MICROSCOPIA -. Microscòpia confocal de rastreig làser (CSLM) Es un microscopi de fluorescencia, amb mostres tenyides amb fluorocroms i s’utilitza un raig laser. Recull imatges més nitides (elimina tot el que no sigui el pla focal).
Microbiologia I -. Microscòpia de sonda de rastreig: observar l’estructura atómica de la superficie.
- Microscopi d’efecte túnel (STM): (100.000.000X).
permet visualitzar atoms de superficie. Cada àtom té un nuvol d’electrons que projecten a la superficie, s’utilitza una agulla amb un nuvol d’electrons i s’apropen i s’aplica un voltatge i es va moven detectant l’estructura de la superficie.
- Microscopi de força atòmica (AFM): visualitzar la composició de la superficie però en materials que no transmeten electricitat.
S’utlitiza una sonda que es va moven deixant sempre la mateixa distancia amb la mostra. Aixi es genera la imatge. La sonda te un raig laser que diu la distancia i es crea la imatge.
MANIPULACIÓ DE MICROORGANISMES Fil fins que quedi roig -. Manipulació antisèptica -. Esterilització o Per calor  Calor humida: autoclau. En materials visibles en aigua.
Esterilitza la temperatura del vapor d’aigua (1 atm, 121ºC, no bull, durant 15-20min).
 Calor seca: forn Pasteur: En materials de vidre, no visibles en aigua, no tèxtils. És més lent i s’ha de mantenir més temps. (170ºC, 90min).
 Flamejat  Incineració  Flama  Elèctrica o Per filtració Incinerador electric Microbiologia I o Química: autoclaus d’òxid d’etilè (gas tòxic) barrejat amb altres gasos per materials sensibles a la calor (plaques de Petri, tubs. roba). No esterilitza, sinó que desinfecta. Ex: lleixiu, sals d’amoni quaternari.
*Sèpsis: presencia de patògens o toxina *Antisèpsia: prevenció d’una infecció AUTOCLAU Es tanca ermèticament.
A dalt del Erlenmeyer si coloca un cotó hidròfob (deixa pasar el vapor d’aigua). Si es coloques un tap de rosca s’hauria de desenroscar una mica perque entri el vapor.
L’aigua entra en contacte amb l’exterior i l’interior de la mostra.
FILTRACIÓ No elimina tots els microorganismes. Fa pasar un liquid o aire per una membrana de mirocel·lulosa que té uns porus amb un diametre de 0.45 micrometres o 0.22 micrometres. El liquid que passa i baixa será estéril (el recipient que el recull ha d’estar esteralitzat). Per esterilitzar: sucres, aminoacids, vitamines, antibiotics (que amb l’autoclau es farien malbé).
TÈCNIQUES DE CULTIU -. Cultiu pur o axènic: artificials. S’aïlla el microorganisme que ens interessa de tota la resta.
-. Cultiu mixt -. Aïllament Microbiologia I -. Sembra per estria: per aïllar. La 1 serà la més contaminada, la 2 arrastra les linies de la primera i la 4 seran els bacteris ja separats.
-. Banc de dilucions: per comptar.
-. Sembra per abocament -. Sembra per extensió *Si la mostra es liquida s’ha d’agitar AÏLLAR I COMPTAR Microbiologia I AÏLLAMENT DE BACTERIS ANAEROBICS BACTERIS ANAERÒBICS (no creixen en presencia d’oxigen) o Aerotolerants: sobreviuen en presencia d’oxigen pero creixen només amb CO2. Es un medi de cultiu reductor (perque els gasos son oxidants).
Contenen un sobre on hi ha: un indicador redox de bicarbonat, i borohidrat sòdic com a catalitzador. Quan s’obre aquest sobre aquests components s’activen i tenen un paper de filtre indicador que canvia de color amb l’oxigen. Quan tanquen hermeticament va canviant el oxigen per CO2 i H (pel catalitzador que forma aigua), i el indicacor torna a canviar de color.
Quan el medi està saturat de CO2 ja comencen a creixer.
o Sensibles al oxigen: utilitzen tubs amb tap de rosca amb un medi solid (temperatures elevades) perque es mantingui liquid (no si poden formar bombolles). Un cop s’hagi solidificat l’introduirem al GasPak.
o Estrictes: moren amb presencia d’oxigen; s’han de manipular amb CO2 a la cambra anaeróbica. No podem fer servir nances de dicrom (molt oxidatives), s’utilitzen nanses de platí. S’incuben dins a 37ºC.
MEDIS DE CULTIU Un medi de cultiu pot ser liquid o gel, i tenen els components necessaris per desenvolupar cèl·lules.
Els medis tenen: - Consistència: liquida, solida (1.5-2% agar) o semisólida (0.2-0.5% agar).
- Concentració química  Definit: composició química establerta  Indefinit: complexa Microbiologia I - Microorganisme:  Medi d’enriquiment: composició química que afavoreix el creixement d’un grup de microorganismes en diferencia.
 Medi selectiu: contè 1 o varios compostos que inhibeixen el creixement d’alguns microorganismes. Ex: Enterobacteris en una placa amb un medi selectiu que conte sals biliars i cristal violeta, impedeix el creixement de gram +. (Es pot fer selectiu canviant la temperatura).
- Caracteristiques dels microorganismes: depen de les caracteristiques de cada microorganisme es poden separar en un medi diferencial (lactosa i indicador de pH).
S’inoculen per picadura (dins del medi semisolid).
Són medis diferencials: per saber característiques metabòliques d’un bacteri Microbiologia I CONSERVACIÓ DE CULTIUS DE MICROORGANISMES  Temps curt  Cultius en placa: més fácil de contaminar que l’agar inclinat  Cultius en agar inclinat: s’asseca menys (es pot mantenir més temps). Al tenir menys superficie aguanta millor la humitat i es contamina menys.
 Temps llarg  Liofilització:(congelació+dessecació) no tots els bacteris resisteixen aquest sistema.
 Congelació: eppendorf.
es pot (es fer amb mantenen tubs els microorganismes vius congelats a -40ºC; -70ºC; i per cultius cel·lulats a -196ºC).
s’ha d’afegir un crioprotector (anticongelant amb un 20% de glicerol i un 10% de DMSO).
 Cultius cel·lulars i cultius de teixits: Treponema pallidum (es mante en conills); Mycobacterium leprae (es mante en armadillos); Rickettsies clamidies virus (parasit intracelular obligat).
 Col·leccions de cultius ...