Práctica 1.1 (2015)

Pràctica Español
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Fisiología general
Año del apunte 2015
Páginas 5
Fecha de subida 20/04/2016
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Fisiología  Celular  I,  Práctica  1       9/IV/2015   PRÁCTICA  1:  NEUROPRTECCIÓN  MEDIDA  POR  ANTIOXIDANTES  FRENTE  A   AGENTES  PRODUCTORES  DE  ESTRÉS  OXIDATIVO     1.  Introducción   ⇒ Sistema  Nervioso   Neurona:     o Unidad  funcional  y  estructural  del  sistema  nervioso.     o Función:  excitabilidad  eléctrica  à  transmisión  del  impulso  nervioso   à  PA  (de  neurona  a  neurona  /de  neurona  a  otro  tipo  celular).       -­‐ Soma  (cuerpo  celular)   o Estructura                 -­‐ Dendritas   -­‐>   membrana   plasmática   plagada   -­‐>   recambio     proteínas  -­‐>  aumento  del  metabolismo.     -­‐ Axón     Se  asume  que  se  nace  con  un  número  de  neurona  determinado  que  se  van   muriendo  progresivamente  con  la  edad  y  que  no  se  recuperan.  Así  pues,  la   neurona  es  la  unidad  funcional  más  afectada  por  el  paso  del  tiempo.   Las  dendritas    -­‐>  trasmiten  el  PA  de  los  receptores  al  soma.                         ⇒ Proteínas  -­‐>  estructura  3D  (enlaces  peptídicos  que  las  estabilizan)   Existe   un   alto   intercambio   de   proteínas   en   las   dendritas,   esto   es   muy   importante  porque  implica  un  ↑  metabolismo.     ⇒ Agentes  productores  de  estrés  oxidativo  -­‐>  Radicales  libres   Radicales   libres:   pueden   desestabilizar   la   estructura   3D   de   las   proteínas   debido   a   su   propiedad   oxidativa.   Un   radical   libre   es   una   molécula   con   un   electrón   desaparejado,   lo   cual   provoca   que   sea   muy   inestable.   Con   tal   de   ganar   estabilidad,   dicha   molécula   capta   el   electrón   de   otra   molécula,   provocando  que  esta  segunda  se  desestabilice.           Este   proceso   repetido   sucesivamente   se   denomina   cascada   oxidativa   o   oxidación   en   cadena.   Cada   molécula   desestabilizada  captará  el  electrón  de  otra  sucesivamente.     Fisiología  Celular  I,  Práctica  1       9/IV/2015   ⇒ Entorno  Reductor     Para   evitar   el   exceso   de   radicales   libres   la   célula   presenta   un   entorno   reductor,   es   decir,   mantiene   los   radicales   libre   a   uno   concentración   no   tóxica.  Existen  dos  tipos  de  métodos  para  mantener  un  entorno  reductor:   o Sistemas  Enzimáticos   o Antioxidantes  (aox)  -­‐>  por  ejemplo,  vitaminas  E,  C  y  A  (=  inhibidores   peroxidación   lipídica   membranas   celulares).   También   está   el   Glutatión  reducido  (GSH).     ⇒ Fuente  de  radicales  libres     Mitocondrias:  son  la  principal  fuente  de  radicales  libres.  Cuando  empiezan  a   funcionar  peor  (paso  del  tiempo)  -­‐>  ↑  [radicales  libres].     *Enfermedades  sistema  nervioso  relacionadas  con  los  radicales  libres:   -­‐ Esclerosis   lateral   amiotrófica:   mutaciones   enzima   antioxidante   superóxido   dismutasa   -­‐ Enfermedad   de   Parkinson:   la   teroría   propuesta   dice   que   la   actividad   oxidasa   de   la   MAO   B   y   el   alto   contenido   en   hierro   de   la   Sustancia   Negrea   actuarían   como   catalizadores   redox   -­‐>   ↑ estrés   oxidativo   en   neuronas   dopaminérgicas.     -­‐ Alzheimer:   péptido   beta-­‐amilode   induce   la   muerte   celular   mediante   radicales  libres  que  causan  lipoperoxidación  en  los  lípido  de  las  membrana   y  aumentan  las  niveles  de  endoperóxidos  en  la  célula.       2.  Objetivos   El   objetivo   de   esta   práctica   es   evaluar   el   papel   protector   de   dos   antioxidantes   naturales:   la   vitamina   E   (vit   E)   y   Glutatión   reducido   (GSH)   en   líneas   celulares   neuronales   utilizando   como   agentes   productores   de   radicales   libres   H2O2   y   Menadiona   (modelos   experimentales   de   estrés   oxidativo).   Los   efectos   beneficiosos   de   los   antioxidantes   sobre   la   toxicidad   inducida   por   ambos   agentes   se   evaluarán   bioquímicamente   en   células   no   diferenciadas   (blastos)   a   través   de   la   actividad   mitocondrial   mediante   el   ensayo   de   MTT,   que   permite   cuantificar   la   viabilidad   celular.       3.  Metodología   3.1.  Líneas  celulares     Las   células   N2a   corresponden   a   una   línea   de   neuroblastoma   de   ratón1  que   se   cultiva   en   placas   de   plástico   de   60   mm   de   diámetro   con   un   medio   sintético   de   composición   conocida   denominado   DMEM2  (Dulbecco’s   Modified   Eagle   Medium),   suplementado  con  suero  bovino  fetal  (SBF)  al  10  %,  más  antibióticos  para  inhibir   el   crecimiento   microbiano   en   el   cultivo   (100   U/ml   de   penicilina   y   100   mg/ml   de   estreptomicina).                                                                                                                     1  Líneas  celulares  estables  de  cáncer.   2  DMEM  =  medio  celular.  Contiene  PBS,  antibióticos  (P/S)  y  factores  de  crecimientos   Fisiología  Celular  I,  Práctica  1       9/IV/2015   Para   la   realización   de   la   presente   práctica   las   células   son   cultivadas   usando   un   medio   DMEM   sin   rojo   fenol3.   Estas   células   en   condiciones   de   cultivo   normales   (cuando   son   blastos)   presentan   una   morfología   poligonal,   pudiéndose   distinguir   fácilmente   el   núcleo   con   los   nucleolos   así   como   diminutos   procesos   celulares   o   neuritas  (aunque  éstos  pueden  estar  ausentes).     3.2.  Técnica  de  cuantificación  de  la  viabilidad  celular     La   neuroprotección   inducida   por   vit   E   y   GSH   frente   a   agentes   oxidantes   neurotóxicos  se  estudiará  mediante  el  método  de  reducción  del  bromuro  de  3-­‐(4,5-­‐ dimetiltiazol-­‐2-­‐il)-­‐2,5-­‐   difeniltetrazolio   (MTT).   Este   compuesto   ingresa   por   transporte  activo  al  interior  de  la  célula  siendo  reducido  a  formazán  (de  color  azul)   por   la   cadena   respiratoria   mitocondrial.   La   producción   de   formazán   es   un   excelente  parámetro  del  metabolismo  celular  (cálculo  absorbancia).     *Es muy importante mantener la esterilidad a lo largo de todo el proceso experimental.
4.1  Desarrollo  experimental  (Día  1)   1. Disgregación  de  las  células  (tripsinizar  las  células)     -­‐ Los   neuroblastos   se   pegan   fuertemente   a   la   matriz   del   plástico   de   la   placa.   Es   necesario   levantarlos   para   poder   contarlos.   Este   proceso   se   realiza  mediante  la  adición  de  tripsina4  y  EDTA5.     -­‐ No   obstante,   el   DMEM   debe   ser   retirado   antes   de   añadir   la   tripsina   al   cultivo,   debido   a   que   el   suero   (PBS)   que   este   contiene   inhibe   la   acción   de   la  proteasa.     -­‐ Se  debe  dejar  actuar  la  tripsina  durante  unos  minutos,  controlando  bajo   el   microscopio   que   las   células   se   van   despegando.   El   proceso   debe   acompañarse    con  golpes  suaves  en  el  borde  de  la  placa.   -­‐ Para   finalizar   la   acción   de   la   tripsina   se   añaden   rápidamente   4mL   de   medio  de  cultivo  completo  para  inactivar  la  tripsina.                     (A)   Neuroblastos   sin   tripsinizar   (máximo   aumento).   (B)   Neuroblastos   trispsinizados  (mínimo  aumento).                                                                                                                         3  El  medio  DMEM  presenta  rojo  fenol  como  indicador  de  los  cambios  de  pH.  Este  indicador  presenta   activación  estrogénica,  proceso  que  para  la  presente  ensayo  es  una  interferencia.  En  consecuencia,   se  utiliza  DMEM  sin  rojo  fenol.     4  La  tripsina  es  una  enzima  peptidasa,  que  rompe  los  enlaces  peptídicos  de  las  proteínas  mediante   hidrólisis  para  formar  péptidos  de  menor  tamaño  y  aminoácidos.   5  Agente  quelante  de  calcio  y  magnesio,  elementos  que  favorecen  la  adhesión  de  las  células  a  la   matriz.     Fisiología  Celular  I,  Práctica  1       9/IV/2015   2. Cuantificación  de  las  células     -­‐ Tras  tripsinizar  las  células  se  obtienen  suspensiones  celulares  que  deben   centrifugarse  durante  unos  minutos.   -­‐ Los   sobrenadantes   se   eliminarán   mientras   que   los   sedimentos   (pellet)   deber  resuspenderse  en  un  medio  DMEM  sin  suero.   -­‐ Deben   tomarse   unos   10microlitros   de   la   suspensión   celular     para   ser   contadas  en  la  cámara  de  Neubauer.     -­‐ El  objetivo  es  ajustar  las  células  a  una  concentración  de  100.000c  cel/mL   para   incubar   alícuotas   de   100microlitros   en   placas     de   96   pocillos   (obtendremos  10.000  cel/mL).                          (A)  Cuantificación  de  células  en  el  primer  cuadrante  de  Neubauer.  (B)  Cámara  de  Neubauer.  Cada  cámara   contiene  dos  cruces  con  cuatro  cuadrantes  respectivamente.         Los  cálculos:       Cris   140   183   196   181   1   2   3   4   Carla   137   /   180   183   Sara   139   186   211   184   Mediana   ≈139   185   ≈196   ≈183       𝒏ú𝒎𝒆𝒓𝒐  𝒕𝒐𝒕𝒂𝒍  ∅ ×𝟏𝟎. 𝟎𝟎𝟎 =  𝟏𝟕𝟓! 𝟕𝟓×𝟏𝟎. 𝟎𝟎𝟎 =  𝟏. 𝟕𝟓𝟕. 𝟓𝟎𝟎  𝒄𝒆𝒍/𝒎𝑳   𝟒 𝟏. 𝟕𝟓𝟕. 𝟓𝟎𝟎  𝒄𝒆𝒍 𝟏  ×   = 𝟏𝟕! 𝟓𝟕𝟓 → 𝒑𝒐𝒓𝒑𝒐𝒓𝒄𝒊ó𝒏  𝟏: 𝟏𝟕! 𝟔  𝒎𝑳   𝟏𝒎𝑳 𝟏𝟎𝟎. 𝟎𝟎𝟎  𝒄𝒆𝒍   Por   lo   tanto   ,   para   conseguir   una   concentración   de   100.000   cel/mL,   debemos  añadir  1mL  de  nuestra  suspensión  por  cada  17’6  mL  de  DMEM  +   Ab  (sin  suero),       Fisiología  Celular  I,  Práctica  1       9/IV/2015   3. Siembra  de  células   -­‐  Las   células   suspendidas   a   una   concentración   de   100.000   cel/mL   serán   repartidas  en  una  placa  de  ELISA  siguiendo  el  esquema:       1   Medio   2   Control   3   aox.16   4   aox.2     5   ox.1   6   ox.2     7   aox.1  +   ox.1   8   aox.1  +   ox.2   9   aox.2  +   ox.1   10   aox.2  +   ox.2   A   DMEM   +  PBS   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   PBS   Vit  E  +  PBS   GSH  +  PBS   H2O2  +   Men  +  PBS   Vit  E  +   Vit  E  +  Men   GSH  +   GSH  +  Men   PBS   H2O2   H2O2   B   DMEM   +  PBS   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   Suspensión   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   celular  +   PBS   Vit  E  +  PBS   GSH  +  PBS   H2O2  +   Men  +  PBS   Vit  E  +   Vit  E  +  Men   GSH  +   GSH  +  Men   PBS   H2O2   H2O2     -­‐ Los  pocillos  deberán  incubarse  durante  20  horas  a  37  grado  y  al  5%  de   CO2.                                                                                                                             6  Las   vitaminas   interfieren   en   algunos   casos   en   el   ensayo   de   MTT,   dando   resultados   ficticios.   Por   eso  tenemos  un  grupo  control  de  la  vitamina  E.   ...