Tema 3: Bancos de cDNA 2/2 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 7
Fecha de subida 03/10/2017
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Tema 1 de Tecnología del DNA recombinante

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TEMA 3 BANCOS DE cDNA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
María Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología.
Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología AMPLIFICACIÓN RÁPIDA DE LOS EXTREMOS DEL cDNA (RACE).
Técnica para replicar los extremos de un RNA concreto. Para hacerlo, habitualmente se hace dentro de un escenario donde tenemos cierta información del DNA, por ejemplo, un banco de cDNA que no nos ha salido bien y, por lo tanto, no tenemos la secuencia completa.
Si conocemos un poco la secuencia podemos amplificar la secuencia, a no ser que sea la inversa.
Se mezclan dos conceptos: el primero es el de mester picier, se aplica a cualquier PCR, no solo a amplificación rápida, a cualquier PCR con rendimiento bajo. Un “Nesled” PCR/aniguada: utilización de dos lugares de oligos para amplificar la misma zona de DNA.
Si la reacción de PCR es muy ineficiente la cantidad de producto de PCR puede ser inferior a la necesaria para amplificar. El producto de PCR mayoritario será el que queremos, pero si hay algún problema en el producto de PCR encontraremos: nuestro DNA que queremos amplificar y otros que no nos interesan, esto es muy habitual, pueden amplificar secuencias diferentes a las que queremos.
Para eliminar estos fondos (Fons), utilizamos una nueva pareja de oligos interna aniguada a los otros dos.
Si la PCR ha amplificado nuestro DNA y por ej. 15 más que no nos interesan, si utilizamos dos oligos internos, ya solo amplificarán la secuencia deseada.
En la nueva PCR ya aparece la banda que nosotros deseamos.
El concepto de “nesled” se utiliza cuando la cantidad de DNA es muy pequeña y queremos optimizar el producto de PCR. Cuando haces un cDNA, el extremo 5’ del cual no dispones la secuencia es precisamente el que quieres determinar.
¿Qué problema tenemos con el cDNA? Tenemos cDNAs después de hacer el banco, tenemos la cola poli-adenilada y pueden faltar 80 bases correspondientes al extremo 5’ y faltan las 80 bases. Si queremos determinar la secuencia que nos falta conociendo la otra secuencia, hacemos un RACE.
Seguramente no había suficientemente RNA para que el producto de PCR rindiera en una cantidad de DNA que se pueda ver en la electroforesis. Es utilizar dos PCR para tal de aumentar el rendimiento, para no aumentar el Fons utilizamos dos oligos diferentes con doble especificidad de secuencia, de esta forma evitas que las moléculas de Fons puedan amplificar.
La Nesled PCR son dos PCR que permiten detectar una única molécula de DNA en un tubo.
Utilizamos 4 oligos específicos de la zona que se quiere amplificar.
El producto de la primera PCR le ponemos dos oligonucleótidos nuevos e internos con el producto. Después hacemos la segunda PCR con dos oligos internos del producto de la primera PCR, si la primera reacción ha ido más o menos bien, se verá bien.
1 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Proceso de Race 5’ : Esto es porque desconocemos la secuencia del 5’, y así podemos amplificar por PCR. Aunque no conozcamos la secuencia 5’ podemos amplificarla por PCR, viene la terminal transferasa y añade esas adeninas.
1. Con un oligo interno con la transcriptasa inversa se hacen las bases, copia del RNA a DNA. La transcriptasa inversa nos ha copiado, así sintetizamos la primera cadena (-).
2. Después de esta transcripción inversa añadimos As con la terminal transferasa en el 3’ de la cadena - + 1er oligo interno.
3. Añadimos cebadores con cola de Ts y sintetizamos la segunda cadena (+) utilizando un oligo interno del cDNA, que es el reverso o complementario al 3’ del + que sabemos previamente. La idea es smilar a la “nesled” PCR. El segundo oligo hibrida con la secuencia interna de la cadena +-. Es un oligo aniuado respecto del anterior. Entonces, la reacción es suficientemente potente como para poder detectar en el gel de electroforesis a la molécula.
2 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Y esto lo podemos amplificar por PCR porque tenemos dos oligos, la secuencia desconocida a la izquierda y la conocida a la derecha*** El primer oligo que ponemos es una PCR diferente, una reverse transcription porque parte de RNA.
El segundo oligo que ponemos es una PCR normal y corriente, porque parte de DNA.
Proceso de Race 3’: 1.
Se hace un cDNA (-) con un primer con 5’ oligo de T.
No hace falta añadir ninguna cola. Se aprovecha el poliA que tiene el mRNA en 3’.
2.
Síntesis de la segunda cadena (+) con un oligo interno.
3.
Amplificar por PCR la cadena + y su complementaria.
El producto del cDNA portará en 3’ el extremo del mRNA.
MICROENSAYOS. ANÁLISIS GLOBAL DEL GENOMA.
Los microensayos permiten analizar de forma simultánea y en un sólo experimento los patrones de expresión de centenares o de miles de genes. Vemos las variaciones de la expresión. Se trata de expresión diferencial en diferentes condiciones, como por ejemplo la presencia o no de cierto medicamento.
Ya no se utiliza, ahora se utilizan técnicas de secuenciación masiva.
Es muy similar al Northern Blot, pero en lugar de utilizar RNAs que previamente hemos separado con un gel de agarosa, usamos oligonucleótidos, productos de PCR y cDNAs inmobilizados en una superficie.
3 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Tipos: Microensayos de cDNAs: - Se inmovilizan los DNAs: cDNAs, Expressed Secuence Tags (ESTs) o bien productos de PCR a partir de DNAs clonados) en una superficie sólida (vidrio o nylon).
Contienen centenares o miles de spots.
Densidad baja.
Microensayos de oligonucleótidos: - Los oligos se sintetizan directamente sobre la matriz de vidrio.
Contienen decenas de miles de spots.
Densidad elevada (10^7 copias de oligonucleótido por spot).
CONFECCIÓN DE MICROENSAYOS.
Proceso general: 1. Hacemos un banco de cDNAs, todos identificados y tenemos algunas secuencias parciales del cDNA.
2. Hacemos oligonucleótidos. Concretos contra cada uno de los cDNAs que hemos detectado en el banco.
3. Los oligonucleótidos normalmente se hacen por síntesis química mediante métodos robotizados sobre puertas de vidrio de microscopio (los robots hacen los spots).
Se pueden poner muchos oligonucleótidos diferentes, cada uno representa a un cDNA.
La “ impresión” de los spots se hace por métodos robotizados.
En cada uno (cada spot) se depositan entre 0.25 y 1 nL y se genera una taca de entre 100-150 micrómetros de diámetro.
4 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología HIBRIDACIÓN MICROENSAYOS.
Por ejemplo: si nos interesa ver como el hígado responde a la presencia de un medicamento.
1.
Coge el hígado de referencia y extraer el RNA de tratados con medicamento y del control (no tratado) 2.
Hacer cDNA de todo el RNA (de ambos) con transcriptasa inversa y oligo de T.
3.
El de referencia (control, sin medicamento) se marca con Cy3, un fluoróforo que da fluorescencia verde cuando se le pone luz azul.
4.
El del test (muestra, con medicamento) se marca con Cy5, que da color rojo.
5.
Mezclamos los dos cDNAs y los hibridamos sobre una placa de cDNAs inmovilizados sobre una superficie.
6. Utilizamos lásers / luz azul para mirar los resultados.
5 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología HIBRIDACIÓN MICROENSAYO Y ANÁLISIS DE RESULTADOS Verde: se inhibe cierto RNA cuando se le trata con medicamento, por tanto, un oligonucleótido que representa el RNA quedará hibridado solo con el RNA control.
Rojo: el medicamento estimula la síntesis de un RNA nuevo. Por tanto, como no hay el de referencia, predomina el tratado con medicamento.
Amarillo: hay de los dos (verde y roo) ocurre cuando el medicamento no afecta para nada su expresión.
Negro: el spot no está, no se expresa en el experimento ni nada.
Para cuantificar las señales se hace el logaritmo del cociente o ratio rojo/verde: - =0: el gen no se expresa de forma diferente en el experimento (negro, indiferente).
>0: positivo, predomina el rojo y es estimulado con el medicamento. El gen se sobreexpresa en el experimento (tonos crecientes de rojo).
- <0: negativo, predomina el verde y se inhibe la expresión. El gen se expresa menos en el experimento (tonos crecientes de verde).
Con técnicas de RNAseq nos ahorramos la parte experimental del ensayo, porque es poco repetitivo y carísimo. Pero se continua cuantificando igual, nos da valores de expresión del RNA, el experimento y muestra + se hace el análisis del Clúster.
Una vez tabulados los valores del logaritmo, se puede agrupar los genes en función del patrón de respuesta, y se puede obtener los que tienen un patrón de regulación similar por el medicamento, que suelen ser de la misma función. Entonces, tenemos los genes que modulan a aquella hormona o medicamento.
Después se puede mirar si los genes tienen igual secuencia.
6 ...

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