TEMA 8 Biologia Molecular (BIOMOL) (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 38
Fecha de subida 01/07/2017
Descargas 1
Subido por

Descripción

Inclou els apunts corresponents al tema 8 de l'assignatura Biologia Molecular: Vectors i estratègies de clonatge.

Vista previa del texto

Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) TEMA 8: Vectors i estratègies de clonatge VECTORS DE CLONATGE I D’EXPRESSIÓ Un vector és una molècula de DNA que unirem la molècula d’interès per aïllar.
Molècula de DNA que pugui replicar en la molècula hoste i a més permeti una introducció relativament fàcil dins de l’hoste corresponent.
Primera classificació de vector de clonatge (obtenció de moltes copies dins l’hoste) i vector d’expressió (permet obtenir el producte codificat o proteïna).
Vector de clonatge Característiques: - - Accepta gran quantitat de DNA  permeti introduir el fragment de DNA més gran possible Presenta regió policonnectora  afegirem el DNA a clonar Presenta sistema selecció clons amb inserció  diferenciar els clons que porten l’inserit als que no Seqüència complementària a oligonucleòtid universal  encebador complementari a la regió policonnectora per un extrem i un altre encebador complementari a l’altre extrem de la regió policonnectora  encebadors universals on afegirem el meu fragment a clonar que permeten seqüenciar fàcilment el que hem introduït enmig de la regió policonnectora Tots han de portar un origen de replicació Vector d’expressió 1 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Pot portar elements que permetin que la proteïna que se m’expressa pugui ser purificada. Unit a la proteïna i facilita la purificació. GFP formant una proteïna de fusió i permet detectar cap a on va la proteïna que s’ha traduït. Facilita la localització dins la cèl·lula, la seva solubilització, purificació... altres elements.
A banda de tots els elements de transcripció i traducció porta elements addicionals.
Característiques - Presenta regió policonnectora Presenta sistema d’expressió: promotor, AUG, STOP, terminador Seqüència addicionals per ajudar en solubilització, detecció, quantificació o purificació de la proteïna Tots han de portar un origen de replicació Han de presentar totes les seqüències que em permetin transcriure o traduir el gen que he clonat Vectors: classificació general No és el mateix transformar una cèl·lula eucariota que una procariota. Vectors segons el tipus d’hoste, vectors per transformar cèl·lules eucariotes i vectors per transformar en cèl·lules procariotes.
Com un vector és una molècula de DNA, es pot classificar en funció del seu origen.
Poden ser plasmidis (dsDNA dins dels bacteris) o bé vectors que el seu origen és el genoma d’un bacteriòfag (virus que infecta bacteris) el genoma del fag landa i fags filamentosos.
Per transformar hostes procariotes hi ha vectors que són construccions artificials, un vector que és una molècula de DNA artificial. Conté DNA de més d’un origen. Són vectors que tenen característica de plasmidi però contenen seqüències que provenen de determinats trossos de virus.
Després tindríem cromosomes artificials (són més grossos) construccions artificials per transformar procariotes. Vectors que contenen DNA de més d’un origen. PACs  plasmidi basats en fags 2 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) BACs contenen seqüències d’altres llocs.
En hostes eucariotes trobem vectors que serveixen per transformar cèl·lules animals o vegetals. Virus o genomes de virus que infecten cèl·lules animals o vegetals. En animals tenen més utilitat. Trobem també plasmidis (normalment associats a hostes procariotes però també hi ha propis d’hostes eucariotes) i s’utilitzen per clonar. Hi ha propis de llevat i trobem episòmics, d’integració i de replicació. Plasmidis que permeten obtenir transgènics vegetals són els (Ti). Cromosomes artificials serveixen per transformar cromosomes vegetals anomenats YACs.
Tots aquells vectors que porten un asterisc o dos asteriscs serveixen per la construcció de genoteques. Busquem que el vector accepti fragments lo més gran possibles.
La diferencia en un asterisc i dos és que el que porten 2 asteriscs són particularment útils per construir genoteques de cara a seqüenciar genomes eucariotes.
Plasmidis Molècules de DNA de doble cadena presents en cèl·lules bacterianes (transformació d’hostes procariotes) porten molts gens i dins del que són els plasmidis es pot parlar de plasmidis conjugatius i plasmidis no conjugatius. Els primers porten els gens tra.
3 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Permeten la transferència del plasmidi d’un bacteri a un altre i no ens interessen en biologia molecular.
Volem controlar on va el vector. Una seqüència important és la ORI, la qual marca l’inici de la replicació (la qual fan independentment del cromosoma bacterià). És crítica i és important per dos motius: 1. Segons quina sigui aquesta seqüència ori determina en quin hoste es pot replicar el plasmidi. Hi ha alguns que són molt restrictius que només permeten la replicació en colis entèrics (ColE1). Un altre és RP4 que només permet replicació en bacteris gramnegatius. Un altre és el RSF1010 que només permet la replicació en bacteris grampositius i gramnegatius. Interessa poder controlar en quins organismes em creixen al laboratori i esperar que si s’escapen del laboratori estan molt controlats i no infectaran altres organismes perquè estem creant transgènics.
2. Marcar quantes copies del plasmidi tindre dins la cèl·lula. Determina el nombre de copies del plasmidi per cèl·lula. Podem parlar de plasmidis relaxats o bé multicòpia (permeten múltiples copies dins del bacteri). També podem parlar de plasmidis astringents (només permeten una sola còpia per cèl·lula). Aquests plasmidis astringents han de portar forçosament els gens PAR perquè quan la cèl·lula es divideix permet una divisió equitativa dels plasmidis a cadascuna de les cèl·lules filles.
La regió policonnectora es troba enmig del gen LacZ. Permet diferenciar transformants que provenen de relligat que dels que portaven els inserits.
Aquells plasmidis que presenten el mateix origen de replicació formen part dels grups de incompatibilitat. Dos plasmidis diferents amb un mateix origen de replicació no poden coexistir dins d’una mateixa cèl·lula perquè quan la cèl·lula es divideixi una cèl·lula filla es quedarà amb un plasmidi, una altre amb l’altre o un dels dos s’anirà perdent.
4 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) El fag λ Aquest virus és un bacteriòfag i presenta un genoma format per dsDNA lineal i als extrems presenta seqüències anomenades seqüències COS. Aquestes permeten que un cop el genoma del fag s’ha introduït a la cèl·lula bacteriana es recircularitzi i es repliqui com si fos genoma bacterià. Són extrems cohesius, són complementaris.
Un procés de replicació asimètrica mitjançant cercle rodant i es forma un extrem en 5’ i 3’. Fem créixer la cadena copiant l’altre i acabem tenint un conjunt de genomes que va creixent i es va copiant n vegades. Això es converteix en dsDNA i acabo amb n genomes del fag concatenats. Dins de la cèl·lula, aquests genomes concatenats (on cada tros és un genoma sencer del fag unit per seqüències COS enmig) pot ser empaquetat dins de la càpsida viral perquè existeix una DNAasa que talla les seqüències cos. Paral·lelament s’hauran sintetitzat les proteïnes de la càpsida i la cua i gràcies a altres dues proteïnes (num1 i a) s’acaba sintetitzant un únic genoma per cèl·lula).
Fent servir el genoma d’aquest fag com a vector tenim una sèrie d’avantatges: A la part esquerra trobem les seqüències del gen per sintetitzar la càpsida... el que és interessant del fag és que al seu genoma una part interna aproximadament d’un terç és substituïble pel fragment de DNA que a mi m’interessi. Una segona avantatge és que tot el sistema que hem explicat dins de la càpsida es pot dur a terme in vitro. Kit per empaquetar genomes de fag landa. Formació de concatèmers que per poder empaquetar-los hem de tallar entre les seqüències cos. Quan fem el clonatge tenim el 5 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) genoma del fag landa i si fem el clonatge tindrem un braç dret. Un esquerre i la part del mig. Si tallem i substituïm la part central pel fragment de DNA que m’interessa. Aquest vector accepta fragments més grans que no pas el vector. Podem arribar a inserir fragments de fins a 23 – 25 kb.
Clonatge en el fag λ Es forma un altre cop el mateix amb un fragment al mig. Es formen concatèmers dels fags. A partir d’aquí aquests concatèmers mitjançant un sistema in vitro ser empaquetats en molècules de virions. Encapsidat dins de la partícula formada in vitro.
Un avantatge d’això és que només la endonucleasa em tallarà entre la seqüència COS i seqüència COS si la distància que em separa les seqüències COS és equivalent a la mida del genoma del fag landa. Pot passar que no serà la necessària perquè la endonucleasa pugui tallar i no podrà ser encapsidat invitro. O se m’ha produït la reacció de lligament correcte o no encapsidaré (no he unit el fragment) o tot allò que encapsidi portarà el fragment i no cal marcador de selecció.
Estem tallant el vector AMB el fragment unit.
Com podem fer la encapsidació in vitro?  Empaquetament in vitro del fag λ 6 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Fags filamentosos: M13 A partir de fags defectius que no poden encapsidar el DNA. Hi ha cèl·lules infectades per fags landa que els hi falta una proteïna de la càpsida.
Podré fer les meves construccions in vitro si tenen la distància correcta per ser reconegudes per la endonucleasa i això només passarà si han incorporar el fragment que té la mida idònia. no fa falta marcador de selecció perquè només es tallarà quan hagi realitzat la reacció de lligament correctament.
Cadascun d’aquests virions porta un fragment enmig corresponent a la genoteca.
Dins del que eren vectors d’origen viral també teníem els fags filamentosos: M13 (aprox 6,4 Kb). Genoma de ssDNA i circular. Queda tot ell embolcallat per una proteïna i en els extrems tenen proteïnes diferents que tenen utilitat.
Com funcionen? En aquest cas en el cicle infectiu de M13. El virió infecta cèl·lules bacterianes que presenten pilus F. A través d’aquest mecanisme el DNA del fag s’introdueix dins les cèl·lules i aquest DNA rep el nom de molècula infectiva o F+.
Aquest ssDNA es transforma en dsDNA donant lloc a una forma replicativa que es pot utilitzar com el meu vector de clonatge. Dins la cèl·lula que estem infectant aquesta forma replicativa es replica com un vector normal i corrent i dona n copies de dsDNA.
7 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Arriba un punt que comença una replicació asimètrica en forma de cercle rodant, es produeix un nick i es dona ssDNA. Aquest queda embolcallat per la proteïna que forma la major part del virus i se li afegeixen les proteïnes dels extrems i surt de la cèl·lula per un mecanisme que no es coneix, poden sortir a l’exterior sense provocar lisi cel·lular i així tenim cèl·lules que constantment produeixen virions.
Si jo tinc un cultiu cel·lular que produeix partícules de virions sense provocar lisi cel·lular sinó que dona lloc a colònies de creixement lent i fem un cultiu que tindran totes les partícules en forma replicativa i el sobrenedant tindrà molècules de virions.
Passar de dsDNA a ssDNA. Clonar la forma replicativa amb el meu vector fins a obtenir virions que porten ssDNA. Despres de centrifugar ens carreguem les proteïnes i obtenim ssDNA.
Interessant per seqüenciació, després per mutagènesi i podem obtenir DNA en forma de cadena senzilla.
El fragment de DNA que puc introduir pot ser força gran perquè als virus el DNA queda embolcallat per la proteïna. Empaquetament molt compacte i eficient.
A banda dels fags filamentosos, en el que era la classificació teníem els plasmidis com a vectors de clonatge i genomes de fags. Ens queden ara cromosomes i construccions artificials.
8 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Còsmids (cos + plasmidi) Aquestes construccions artificials són vectors que contenen DNA de dos orígens diferents. Els còsmids són plasmidis recombinants que tenen les característiques pròpies d’un plasmidi (origen de replicació, regions policonnectores...) i contenen també les seqüències COS del fag landa (seqüències de l’extrem del bacteriòfag que permeten recircularitzar i formar concatèmers). Serveixen també per la creació de genoteques.
El vector és relativament petit. Si clono aquest còsmid tindré a la regió policonnectora una diana per un enzim de restricció, a continuació les seqüències cos, la resistència a un antibiòtic, l’origen de replicació... si tallem amb EcoRI tindrem això linealitzat i obtindrem la diana per EcoRI, la seqüència cos, la resistència a ampicil·lina, l’origen de replicació i la diana per EcoRI. A partir d’aquí afegeixo els meus fragments que he tallat amb el meu enzim i vindrà un tros de fragment. Com tinc n molècules de vector tornarem a tenir això que pertany al vector, després el fragment i després torna a començar el vector. Així podem anar fent. Es formaran concatèmers com es formaven en el cas del genoma del fag landa.
Quina és la gràcia d’això?  puc utilitzar després de les reaccions de lligament i les construccions. Tot un seguit de seqüències que presenten seqüències cos i després un altre cop. La distància entre seqüències cos no serà l’adient a menys que s’hagi introduït el fragment de la mida que toqui. Aprofita les característiques de les seqüències cos del fag landa i la capacitat d’empaquetar. Només l’endonucleasa podrà tallar si s’ha produït la inserció del fragment amb la mida adient. Si s’acaba 9 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) empaquetant finalment significa que s’ha unit el fragment de la mida adient. S’ha produït la reacció de lligament i en principi no necessiten marcadors de selecció.
Els còsmids permeten el clonatge de fragments més grans que no pas els fragments que emet la substitució de la tercera part del genoma del fag landa.
A banda dels còsmids, dins de les construccions artificials trobem els Fagèmids Fagèmids Vector d’origen plasmídic que tindrà un gen marcador de resistència a antibiòtic, regió policonnectora, gen lac Z.
Qui porta com a seqüència que no li és pròpia o que no és del propi plasmidi un origen de replicació de fags filamentós. Totes les seqüències necessàries per l’inici i terminació de la transcripció del gen i els gens que permeten encapsidar aquest DNA o encapsidar els virions.
10 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Plasmidis recombinants que presenten: - Origen de replicació plasmídic Un o més marcadors de selecció Regió policonnectora Origen de replicació de fag filamentós (M13 o f1) + seqüències necessàries per a la iniciació i terminació de la síntesi de DNA víric i per a la morfogènesi de les partícules víriques Si clono el meu clon de DNA i el fico dins d’una cèl·lula es comportarà com un plasmidi normal i corrent. Es replica utilitzant l’origen de replicació propi del plasmidi.
Si infectem una cèl·lula amb un fag filamentós o fag coadjurant  El plasmidi deixa de replicar-se com a plasmidi i s’inicia la replicació a l’origen de replicació del fag filamentós. Síntesi ssDNA el qual és empaquetat en partícules de virions. Produiré ssDNA (els fags filamentosos permeten aquesta síntesi) i gràcies a la infecció per aquest fag coadjurant es comença a sintetitzar ssDNA que quedarà embolcallat per la proteïna majoritària i es formaran les partícules de virions. La gràcia de M13 no provoca la lisi cel·lular i dona lloc a colònies de creixement lent. Al pelet quedaran totes les cèl·lules i al sobrenedant les partícules de virions.
11 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Com si fos un plasmidi normal i corrent i obtenir ssDNA. L’avantatge és que admet fragments més grans que no pas M13.
Fàsmids Vectors de clonatge que tenen origen de DNA plasmídic però que porten totes les característiques normals d’un plasmidi corrent i coses extra:  Plasmidis que contenen les seqüències d’integració del fag lambda. (no confondre amb les seqüències COS del fag landa).  Seqüències que permeten que el fag lamda pugui seguir la via lisogènica.
Permeten que tot el vector amb el fragment clonar de DNA es pugui inserir al genoma de la cèl·lula hoste i aguantarà molt més temps que no pas si estigués sense inserir  El plasmidi pot inserir-se en el genoma de la cèl·lula hoste mitjançant recombinació específica de lloc.  És una manera de conservar de forma estable clons.
Es comportaria com un fagèmid si estigués sol perquè tindria un origen de replicació.
Depenent del que vulguem fer triarem un tipus de vector o un altre o bé depenent de l’origen del DNA i tindrà una finalitat o una altre.
PACs i BACs  cromosoma artificial que serveix per la construcció de genoteques amb la finalitat de seqüenciar genomes eucariotes. Vectors de còpia única (astringent) i com a tals, si dins de la cèl·lula tenim un fragment determinat i tenim moltes còpies d’aquest fragment i aquest pertany a eucariotes, l’ordre per recombinació queda alterat. Si només tinc un sol vector i una sola seqüència és difícil experimentar recombinació homòloga i servirà per construir genoteques per seqüenciar genomes eucariotes. Tenen seqüències molt repetides i, per tant, tinc més probabilitat d’experimentar la recombinació i, amb la qual cosa, altero la seqüència original.
PACs  basats en el genoma del fag P1 (dsDNA 199 kb) lineal presenta: Vectors basats en el fag P1 Vectors basats en el genoma del fag P1 presenten: - - - Sistema de replicació plasmídic (ori). Baix número de còpies (seqüències par: de partició equitativa en la divisió cel·lular). En estat lisogènic es replica com un plasmidi normal i corrent.
Seqüència pac necessària per a l’encapsidació del fag  seqüències reconegudes per un enzim anomenat pacasa i encapsida tot el genoma del fag.
2 sequències loxP reconegudes per la recombinasa cre del fag P1 que permeten convertir el cromosoma lineal en un cromosoma circular  llocs de recombinació que són reconeguts per la recombinasa “cre” del propi fag P1. Aquesta duu a terme una recombinació específica de lloc, centre-específica o NO homòloga.
Aquest vector en porta dues i mitjançant recombinació no homòloga transformem un vector lineal en circular.
Sistema de selecció (resistència a la kanamicina)  marcador de selecció Seqüència policonnectora (accepta 50-100 Kb)  la gràcia que tenen els vectors és que admeten o accepten fragments de DNA molt llargs. Com més llarg és el fragment excepte el vector, més petita la genoteca i més fàcil de rastejar.
12 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - Origen de replicació lític del fag que li permetrà seguir la via lítica i aconseguir moltes còpies del plàsmid en el moment de purificar-lo  origen de replicació que fa que puguem seguir la via lítica.
Com lliga tot això per fer-lo servir com a vector de clonatge?  Braç curt i braç llarg  Braç curt té la seqüència par i el braç llarg conté tota la resta (marcadors de selecció...).
Aquests dos fragments en que he trencat el vector els barrejaré amb els meus inserts i aquests inserts poden arribar fins a 100 kb. Duem a terme una reacció de lligament i per exemple queda el braç curt+insert+braç llarg.
A diferència del que passa amb el fag lambda o còsmids, el vector reconstituït pot encapsidar amb el fag lambda. Abans de dur a terme la reacció de lligament, els dos fragments es desfosforil·len perquè la lligasa no els pugui tornar a unir. Estratègia per evitar tancaments de plasmidi. Abans no calia desfosforilar perquè si no s’unia el fragment inserit correcte no es podia tancar (no el reconeixia la endonucleasa).
Construiré n construccions i un cop les tenim, es poden encapsidar en partícules de virions i podem formar el cap i la cua i mitjançant la pacasa tot queda inserit dins del virió.
Cada partícula de virió porta el fragment de DNA que és lineal.
+ Infecto cèl·lules que són cre (expressen la recombinasa cre) i aquesta reconeix els dos loxP i aquests estan en la mateixa cadena i en la mateixa orientació. Aleshores, si recordem de quan parlàvem de la recombinació centre-específica o no homòloga depèn de la orientació si estava oposada o no, la part central queda invertida i si teníem els dos llocs de recombinació en la mateixa orientació s’experimentava una deleció i queda en una de les dues molècules el loxP i en l’altre molècula l’altre lloc de recombinació. Això passa a la cèl·lula hoste que porten els virions de les nostres construccions.
La cèl·lula hoste està expressant la recombinasa i reconeix els dos loxP i produeix una deleció, pèrdua de la part de la construcció. La resta queda recircularitzada i tenim part del loxP.
A partir d’aquí, ho tenim clonat, vectors de copia única i si interessa que tinguem múltiples còpies ho podem aconseguir perquè això presenta un origen de replicació de 13 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) P1 lític. Aquest està sota el control d’un promotor (com per exemple promotor lac). Si afegeixo IPTG comença la replicació i podem obtenir múltiples còpies.
Un PAC vindria a ser un loxP, un tros de fragment de DNA anomenat DNA extra o stuffer, un ori de plasmidi normal i corrent, les seqüències PAC per l’encapsidació, un altre loxP, la regió policonnectora (MCS) que normalment talla un gen anomenat SacB, un origen de replicació de P1 lític, un marcador de resistència (per exemple de kanamicina) i un ori de P1 com a plasmidi. En el fons, és un vector anomenat llançadora. Porten més d’un origen de replicació i això permet que es puguin replicar en hostes diferents.
SacB és un gen que codifica per una proteïna que introdueix múltiples glucosilacions a diferents proteïnes de membrana. Aquestes que són hiperglucosilades i fan que la cèl·lula peti. Si insereixo el meu fragment aquí, tallo el fragment sacB i si no està actiu no pot fosforilar les proteïnes de membrana, la qual cosa ens permet seleccionar les colònies que porten un inserit perquè sobreviuen. La membrana de la cèl·lula és inestable i les cèl·lules moren en el cas de no incorporar cap fragment. Les colònies han inactivat el gen són les que sobreviuen.
BACS o fòsmids  incorpora les seqüències COS del fag lambda estan basats en el plasmidi F d’E. coli  còpia única o presenta un baix nombre de còpies per cèl·lula 14 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Pot acceptar inserts de fins a 100-200 Kb, la qual cosa garanteix que cada una de les copies va a parar a una cèl·lula (partició equitativa quan la cèl·lula es divideix) Gens de marcador de selecció i regió policonnectora. En el cas dels fòsmids les seqüències COS del fag lambda. Si m’interessa encapsidar els vectors en partícules de virions. A més a més d’aquestes seqüències COS hi ha alguns BACs que inclouen loxP per arribar a lo contrari que hem explicat abans. Si tenim un loxP en un vector i un altre en un altre vector, els fusionem i formem els fragments que ens interessa.
Un sol loxP i les seqüències lambda per encapsidar.
Un altre aspecte interessant és que admeten fragments entre 100 i 200 kb (més grans que els que admeten els PACs).
Aquest vector també té les regions que estan a cantó i cantó de la regió policonnectora. Aquestes són dues regions promotores i els objectius o funcionalitats primeres de PACs i BACs és seqüenciar genomes i un cop tenim les genoteques cada clon té una part del genoma però hem d’ordenar els fragments.
Recorregut cromosòmic. Necessitem una primera sonda per trobar el clon, aïllo, ... en aquest tipus de vector tinc un fragment i un promotor a banda i banda. Aquest permetrà sintetitzar una cadena de RNA (un serà reconegut per la polimerasa de T7 i l’altre per la polimerasa de Sp6). Es sintetitza una cadena de RNA en un sentit i l’altre en sentit contrari. Tindran seqüències complementaries del gen i es poden fer servir com a sonda per trobar un fragment del gen i alhora servirà per construir una segona sonda. Dissenyes una sonda complementària d’una altre part i mitjançant solapaments vas construint sondes.
15 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Com volem seqüenciar el genoma sencer hem d’ordenar els clons. Una manera és tenir aquestes sondes de DNA i anar mirant per clons.
Això és el que s’anomena CONTIGS. El fet de tenir promotors a cantó i cantó permeten sintetitzar cadenes de RNA per aconseguir sondes i acabar obtenint el genoma sencer. Això és el tipus de vectors que fem servir per seqüenciar genoteques genòmiques (BACs i PACs).
Còpia única, admeten fragments grans i admeten característiques per obtenir fragments d’interès. Saber cada vector perquè serveix i quines són les seqüències crítiques que fan que aquell vector tingui aquella utilitat.
Clonatge amb llevats i eucariotes inferiors.
Interessa transformar cèl·lules eucariotes amb un vector però és més complex que transformar procariotes. Vaig a buscar dues coses: - Introduir un gen determinat dins d’una cèl·lula eucariota perquè s’expressi i de vegades de manera transitòria per veure la funció del gen dins de la cèl·lula Transformar una cèl·lula eucariota de manera estable (aconseguir que s’insereixi dins del genoma) i necessito que els vectors em permetin fer això.
Si ho fem de manera transitòria volem expressar el temps durant un període de temps, perquè per exemple si estudiem com internalitza un fàrmac dins d’una cèl·lula eucariota i pensem que potser s’internalitza per una via endocítica on participa X proteïna, podem agafar aquestes cèl·lules, transformar-les en un plasmidi amb una proteïna X defectiva (anomenat dominant negatiu). Això vol dir que aquesta cèl·lula té la seva proteïna X que participa en la via d’internalització del fàrmac. Si anul·lem aquesta proteïna, anul·lem la feina que faria la proteïna X. El temps que mantinc el plasmidi expressant a la cèl·lula guanya el dominant negatiu i, per tant, bloquegem la via d’entrada. Quan s’expressa, la via X no funciona i interessa que es mantingui un cert temps per saber si el fàrmac entra o no per aquesta via.
Si el que jo vull és transformar de manera estable i obtenir un eucariota o organisme modificat genèticament hem d’inserir aquell gen dins del genoma de manera estable.
Quan transformo cèl·lules eucariotes és el que interessa fer a continuació.
YACs  minicromosoma Incorporen: - Origen de replicació de cromosoma de llevat Regions centromèriques Regions telomèriques, que permeten la replicació com un cromosoma lineal  es pot replicar a la cèl·lula del llevat com un cromosoma normal i corrent Accepten fragments d’entre 0,2 i 2 Mb (molt grans). Podrien ser molt útils per la construcció de genoteques però no ens valen per la construcció de genoteques per seqüenciació de genomes eucariotes perquè quan es produeix la reacció de lligament és possible que com admeten fragments tan grans quedin lligats dos fragments i l’ordre inicial del genoma es perd.
16 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Quan transformo les cèl·lules de llevat amb YAC i lligament pot entrar més d’un YAC dins la cèl·lula tot i ser de copia única si entren 2 cromosomes com els genomes eucariotes presenten seqüències repetides perden recombinar fàcilment i perdo l’ordre inicial.
Inconvenient: poden experimentar recombinació És circular de bon començament i té un origen de replicació propi de cromosoma de llevat, regió centromèrica i regió telomèrica enganxada per aquest fragment. Al final de la regió telomèrica hi ha una diana per un enzim de restricció. A més a més presenten dos marcadors de selecció en llevat i aquests dos marcadors estan separats per una diana de restricció. Aleshores, per començar a fer el clonatge es transforma el YAC circular en un cromosoma lineal.
Tallo el vector a les dianes de restricció i em quedo amb el vector linealitzat que presenta als extrems les regions telomèriques.
Entremig tinc el marcador de selecció, ori, regions centromeriques i la diana de restricció.
Tallem a la diana de restricció interna i obtinc un braç esquerre que comença amb la regió telomerica, ... i un braç dret.
Un cop dividit es barreja el vector amb el conjunt de fragments que interessa clonar.
Duc a terme la reacció de lligament, lo ideal es que s’introdueixi entre mig del braç esquerre i el braç dret. Admet fragments molt grans. Amb el producte de reacció de lligament transformo i aconsegueixo esferoplasts (no tenen paret i són més fàcil d’introduir el producte de lligament). Selecciono les cèl·lules de llevat introduint els 2 marcadors de selecció perquè volem aconseguir això lineal però pot passar que s’uneixi un fragment esquerre amb el fragment a clonar i un altre fragment esquerre o bé això amb la dreta.
17 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Permet seleccionar aquells productes de la reacció de lligament en braç esquerre + producte de lligament + braç dret perquè nomes aquests podran créixer en presencia dels dos marcadors de selecció.
Pots evitar relligats desfosforilant.
Comparativa vectors artificials Còsmids són de còpia múltiple. El nombre de clons que necessito són 75.
Fòsmids són variants dels BACs. Són de còpia única. El nombre de clons que necessito és 75.
Si el YAC no recombinés podria tenir tot el genoma humà en 33.000 o 15.000 clons.
A mesura que admet un fragment més gran la mida de genoteca es va reduint.
18 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Altres vectors de llevats  la major part de plasmidis són llançadora per copiar al bacteri molts cops i després ficar-los al llevat Vectors episòmics (YEp) (replicons extracromosòmics) Ori de plasmidi de llevat Seqüències necessàries pel manteniment del plasmidi Es replica sota el control del nucli i existeixen de 50 a 100 còpies per cèl·lula Poden presentar també un origen de replicació del plasmidi procariota (vectors llançadora) Vectors de replicació (YRp) Ori de cromosoma de llevat (ARS) Poden perdre’s en el moment de la divisió cel·lular. Per evitar-ho presenten regions centromèriques que les permeten segregar-se durant la divisió cel·lular com si fossin cromosomes. (YCp)  són els mateixos vectors de replicació però tenen les regions centromèriques per assegurar que no es perdin quan es divideixin Vectors d’integració (YIp) Són plasmidis que s’integren en els cromosomes de llevat mitjançant recombinació homòloga.  s’incorpora el vector que porta el gen que ens interessa i permet obtenir noves soques de llevat que expressen el gen que hem introduït al vector Permeten obtenir noves soques de llevat que expressin el gen d’interès (nou organisme modificat genèticament). Integració estable del gen en el genoma.
Selecció per complementació de la biosíntesi d’una molècula en una soca de llevat mutant (auxotròfic) Existeixen vectors llançadora entre bacteris i llevats.
Com a vectors llançadora han de presentar marcadors de selecció que permetin l’expressió en els dos hostes. Marcador de selecció complementa una ruta de biosíntesi d’algun metabòlit necessari pel creixement del hoste.
Ori de replicació propi de llevat, replicació en regió centromèrica, marcador de selecció és un gen que codifica per la síntesi de leucina. Origen de replicació de procariota, un marcador de selecció per bacteri (resistència antibiòtic) i una regió policonnectora.
Són vector llançadora perquè és més fàcil tenir més còpies si s’ha fet créixer en un cultiu i després de purificar s’introdueix als llevats.
19 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Vectors per a cèl·lules animals  transformar eucariotes superiors.
Busco no fer servir la cèl·lula com a manera d’amplificar el gen n vegades sinó que s’expressi el gen. Per tant, si transformo cèl·lules animals busco que expressi un determinat gen.
1. Introducció del gen dins la cèl·lula animal 2. Si m’interessa, integració del gen dins el genoma de la cèl·lula animal. Si faig això aconseguiré una nova línia cel·lular i, per tant, una línia modificada genèticament que expressa un gen que no li és propi.
Molts cops el gen 1 es pot fer però ens quedem aquí perquè ja tenim prou. Deixem que el gen s’expressi. Amb el temps que dura l’experiment s’expressa.
Quins vectors fem servir perquè s’introdueixi el gen? Es fan servir plasmidis que porten seqüències pròpies de virus que normalment són compatibles amb la cèl·lula eucariota i el procés de replicació d’aquesta. Aquests poden ser replicatius o no replicatius.
Plasmidis (transfecció): - No replicatius: per transformació transitòria  no s’expressa quan la cèl·lula es divideixi i la expressió, per tant, serà transitòria.
- Replicatius: contenen orígens de replicació de virus. Exemples:  Poliomavirus (SV40)  tenen un origen de replicació de SV40 i normalment porten també un gen que dona lloc a una proteïna anomenada antigen THT necessària per la replicació de SV40. El vector té tot lo necessari per la replicació.
Una altre opció  transforma només cèl·lules COS. Incorporació del gen que codifica pel antigen T llarg amb un plasmidi que té un ori SV40. Hi ha lisi cel·lular i pensar que puc passar a la següent etapa amb aquests plasmidis és inviable.
 Herpesvirus (Epstein/Barr)  funcionen de manera similar als anteriors però són més estables perquè les cèl·lules triguen més en lisar. Són vectors pensats per aconseguir expressar el gen d’interès.
Contenen promotors virals per a l’expressió Porta seqüències de virus origen viral compatible amb la cèl·lula eucariota. Regió policonnectora, promotor que permet alts nivells d’expressió i plasmidis llançadora 20 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) amb un origen propi de cèl·lula procariota. Gen de resistència a antibiòtic. Quan la cèl·lula es divideix es perd en el cas de plasmidi no replicatiu.
En el cas de plasmidis replicatius contenen a més a més un origen de replicació de virus i és compatible amb la replicació de celules eucariotes.
Vectors per a cèl·lules animals Virus (transducció): mecanisme infectiu dels viurs o bacteriòfag per introduir el material genètic dins de la cèl·lula d’interès - - - - Retrovirus: no immunogènics, infecten cèl·lules en divisió. Mutació insercional.  virus que tenen RNA com a material genètic i aquest RNA està encapsidat dins del nucli envolcallat per la càpside... entra a la cèl·lula per via endosomal... el DNA de doble cadena pot entrar al nucli i la gràcia dels retrovirus és que el cDNA es pot integrar dins la cèl·lula que infecta i podem passar del pas 1 al pas 2. Aquesta inserció és totalment a l’atzar, no sabem on es pot produir.
Adenovirus: infecten també cèl·lules que no estan en divisió, s’expressen a un títols molt elevats. Molt immunogènics. Expressió transitòria.  són virus que tenen un genoma de DNA i així com els retrovirus infecten cèl·lules en divisió aquests infecten cèl·lules que no estan en divisió. Els retrovirus són molt immunogènics i si volem fer teràpia gènica els retrovirus donen molt poca resposta immunològica i els adenovirus fan molta resposta immunològica (xoc anafilàctic bestial). Interacciona amb la membrana de la cèl·lula i per via endosomal interacciona amb la membrana nuclear i introdueix l’ADN del virus al nucli i a diferència del retrovirus aquest genoma viral NO S’INTEGRA DINS DEL GENOMA I, PER TANT, EL TEMPS D’EXPRESSIÓ DEL GEN QUE INTRODUIM AQUEST GENOMA ÉS TRANSITORI. No aconsegueixo línies cel·lulars estables.
Lentivirus: infecten cèl·lules pots-mitòtiques. Mutació insercional.  infecten cèl·lules postmitòtiques i s’integren al genoma, poden produir mutacions insercionals i no podem controlar a on van a parar Baculovirus: infecten cèl·lules d’insecte. Fàcils de treballar. Expressió molt elevada.  tampoc s’integren al genoma i no podem passar al pas 2.
Producció de proteïnes recombinants.
No integració.
Clonatge en el promotor (darrere) de la polihedrina (proteïna codificada al genoma del virus) que fa de salvaguarda del virus quan aquest virus no es troba en condicions òptimes i queda envolcallat per aquest virus que forma cossos de dessecació.
S’expressa o està sota el control d’un promotor d’alt nivell d’expressió.
Cossos oclusius.
Això s’aprofita per utilitzar el promotor d’aquesta proteïna per clonar al darrere el gen que nosaltres volem perquè aquesta proteïna s’expressa molt i per tant podem obtenir moltes còpies del nostre gen. Permet clonar gens molt grans però si ha d’entrar per recombinació tinc poca eficiència de transfecció o introducció del meu fragment de DNA però tinc elevada eficiència d’expressió.
S’utilitzen com a vectors d’expressió per tenir gran quantitat de proteïna, fàcil de manipular...
21 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Accepta inserts molt grans que cal entrar per recombinació homòloga.
Genoma del retrovirus 22 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Genoma d’un retrovirus. Té dues còpies del genoma (2 molècules de RNA) al nucli i proteïnes que acompanyen com la transcriptasa inversa. Envolcallat per una càpsida, proteïnes de la matriu i altres proteïnes de la part exterior que permeten interaccionar amb la cèl·lula.
Esquema del genoma de RNA del virus, la part de baix no integrat i la part de sora un cop integrat. El genoma del retrovirus presenta una sèrie de seqüències i les que realment importen com a vector de clonatge són l’extrem U5 i U3 que serveixen com a promotor per produir la cadena i al altre extrem com a senyal de finalització.
La part central, tots els gens que són el GAG, POL, ENV es pot substituir per les proteïnes d’interès i ens podem quedar amb els extrems U5 i U3. La psi o lletra grega és necessària per l’empaquetament de virions.
Com ho fem per aconseguir el vector retroviral i a partir d’aquest després passar del pas 1 al pas 2?  Totes les seqüències del genoma es poden substituir per gens forans excepte la regió ᴪ i LTR.
Estratègia per aconseguir virus que permetin introduir gens forans en el genoma de les cèl·lules hoste Tenim el genoma d’un retrovirus amb els extrems. Part que hem de mantenir són els extrems. Els gens continguts a les 3 regions es poden substituir pel gen d’interès.
Eliminem la part central i per clonatge es substitueix pel gen + marcador de selecció.
Tallem a la regió policonnectora i transformem.
Evidentment, això seria com un genoma d’un retrovirus però no podem encapsidar perquè hem eliminat els gens però per aconseguir el que volem fem un cultiu que contenen aquests gens per aconseguir encapsidar.
Volem aconseguir un retrovirus per infectar la cèl·lula i integri a la cèl·lula hoste el meu gen, no el genoma viral.
Amb aquest vector transfecto cèl·lules eucariotes que fabriquen partícules de virions però no tenim cap dels gens de GAG, pol, env. Cotransfecto aquestes cèl·lules amb altres vectors que expressen els gens gag, pol i env i dins de les cèl·lules tinc els gens que em permeten fer la morfogènesi de les partícules de virions però els virions encapsiden allò que està entre les regions LTR no el genoma viral.
23 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Les partícules de virions encapsiden el meu gen i fem el salt cap al pas 2.
A la següent imatge tinc el meu cultiu cel·lular i aïllo d’aquest cultiu les partícules de virions, encapsidem un RNA que jo he construït prèviament. Aquestes partícules de virions infecto les cèl·lules que m’interessen i tenim les de dins del genoma encapsidades.
Tenim transcriptasa inversa i integrasa. Quan infectem les cèl·lules amb aquestes partícules de virions el meu RNA obtingut del plasmidi construït que havia quedat dins les partícules de virions, mitjançant la transcriptasa inversa passa a cDNA de doble cadena i circularitza, un cop circularitza s’integra dins de la cèl·lula hoste.
Expressa un cDNA corresponent al meu gen, no corresponent als gens del virus.
24 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 25 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Vectors per a plantes Aconseguir regenerar una planta sencera i és relativament més fàcil que en animals: Traiem un tros de fulla, puntes de les arrels que estan en divisió molt activa i fent el cultiu adient aconseguim transformar aquestes cèl·lules en un teixit de cèl·lules desdiferenciades o anomenades cal·lus. Aquest està format per cèl·lules desdiferenciades, es poden disgregar, fer créixer en cultiu i eliminar la paret cel·lular i obtenir protoplast més fàcil de transformar. Aconseguir qualsevol teixit de la planta en les condicions adients. Podem obtenir la planta sencera però serà transgènica perquè hem modificat les cèl·lules de les quals deriva qualsevol teixit de la planta.
Plasmidi Ti  sistema per transformar cèl·lules vegetals, propi de cèl·lules bacterianes i concretament de Agrobacterium tumefaciens. És gros, té 200.000 bases i dins del plasmidi és responsable de que aquest bacteri pugui infectar cèl·lules vegetals i produir un tumor anomenat call. Aquest tumor aconsegueix fer moltes cèl·lules que sintetitzen aminoàcids que són la font d’aliment del bacteri. Aquest Agrobacterium és dels pocs casos que es coneix de transferència de material genètic procariota a una cèl·lula eucariota (patogen vegetal).
Infecció per Agrobacterium 26 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Del plasmidi Ti ens interessa la regió DNA-T i està flanquejada per dues regions anomenades LB (esquerra) i RB (dret) que en aquest DNA-T trobarem gens per la síntesi de hormones vegetals i per la síntesi d’uns aminoàcids que anomenem OPINES.
Les hormones vegetals promouen la divisió accelerada de les cèl·lules vegetals tot produint el tumor. Les opines són els aminoàcids de font d’aliment del bacteri.
A banda d’aquest DNA-T és un plasmidi de conjugació i presenta els gens TRA, porta els enzims que degradaran els aminoàcids de font d’aliment del plasmidi i porten una regió de conjugació.
La regió que ens falta és la regió VIR. Aquesta fa referència a virulència. Aquesta història funciona de tal manera que les cèl·lules vegetals tenen el seu nucli i tenim el Agrobacterium amb el plasmidi TI i tenim gens per la biosíntesi d’hormones i d’aminoàcids. Quan la cèl·lula vegetal està danyada i es trenca la membrana cel·lular s’allibera un compost anomenat acetosfiringona i aquesta atrau Agrobacterium, el qual queda adherit a la paret de les cèl·lules vegetals.
Un cop s’ha adherit comença l’expressió dels gens VIR. Un dels gens VIR permet l’entrada d’aquest compost a l’interior de la cèl·lula bacteriana i aquest compost fenòlic un cop dins s’acomplexa amb una de les proteïnes dels gens VIR i aquest complex activa l’expressió d’altres gens VIR. Entre d’altres, un gen VIR codifica per activitat endonucleasa i aquesta es fa servir per tallar els extrems del DNA-T que és de doble cadena només talla una de les dues cadenes. L’endonucleasa reconeix els extrems de DNA-T i deixa una cadena tal qual i l’altre la talla. Aquest plasmidi Ti haurà fet saltar una de les dues cadenes de la doble hèlix i això es pot reparar per mecanismes de reparació.
27 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) El DNA-T en ssDNA s’associa a una altre proteïna relacionada amb els gens VIR. Això afavoreix que el DNA-T surti del bacteri i arribi al citosol de la cèl·lula vegetal.
Mitjançant un procés que no veurem entra a la cèl·lula vegetal.
Un cop al citosol vegetal aquest ssDNA associat a proteïnes VIR pot arribar al nucli perquè alguna de les proteïnes associades al ssDNA amb codificació pels gens VIR codifica per senyals de localització nuclear, les quals són petites seqüències reconegudes per les importines (proteïnes que permeten importar el que sigui del citosol cap al nucli mitjançant el complex de porus nuclear).
Un cop tenim un ssDNA-T dins del nucli s’integra al genoma en una posició a l’atzar i un cop integrat es transforma en dsDNA o bé abans de integrar-se es transforma en dsDNA-T. Un cop ho fa, comença l’expressió dels gens que hi ha codificats (codifica per hormones auxines o citoquines que provoquen la formació del tumor o bé codifica per les opines).
Les opines surten de la cèl·lula vegetal i arriben al bacteri que tindrà, per tant, una font d’aliment ja que el bacteri té enzims que les degraden per fer-les servir d’aliment.
Vectors basats en Ti 2 estratègies per aconseguir que el plasmidi TI s’integri al genoma vegetal. Es basen en l’ús dels plasmidis TI desarmats. Aquest plasmidi li hem substituït el DNA-T intern i no tindrà la síntesi per hormones ni les opines sinó que tindrà el gen a clonar (gen d’interès) més el marcador de selecció.
Vector llançadora que permeten replicar en Agrobacterium i en una soca bacteriana tipus E. coli.
Es tracta de que tenim el plasmidi TI que conté aquest DNA-T desarmat i té un origen de replicació per Agrobacterium o per una soca de E. coli i tindrà una regió 28 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) policonnectora. Introduïm el gen d’interès en la regió policonnectora i tenim un plasmidi TI desarmat.
Amb aquesta construcció transformo soques de E. coli.
Introducció de gens a Agrobacterium Selecciono les que han transformat, fem créixer el cultiu i per obtenir gran quantitat tenim dues opcions, podem agafar directament el bacteri i introduir-lo en una soca d’Agrobacterium o bé barrejar el cultiu de E. coli i Agrobacterium i per conjugació es passa el plasmidi d’una espècie a una altre. Acabem amb una soca d’Agrobacterium que porta la construcció feta prèviament + plasmidi TI i les regions homòlogues presenten recombinació homòloga. El resultat és que la meva construcció s’integra al plasmidi. Després de la selecció acabo amb el meu gen d’interès i 29 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) marcador de selecció i a cantó i cantó les regions LB i RB. El plasmidi conté els gens VIR per moure el que tinc entre la regió LB i RB cap a la cèl·lula vegetal.
Un mini TI conté el gen que codifica per la regió que ens interessa. Aquest miniTI l’introdueixo dins d’una soca d’E. coli. Extrec el plasmidi que tinc en prou quantitat i el faig servir per transformar una soca d’Agrobacterium modificada genèticament prèviament que només té els gens VIR.
30 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) S’expressen els gens VIR, s’expressa la endonucleasa codificada amb un dels gens VIR i actuarà entre la regió RB i LB del miniTI. Es produeix el tall en aquests llocs i es produirà un ssDNA que anirà a parar a la cèl·lula vegetal que s’integrarà al genoma vegetal i posteriorment s’ha de seleccionar les cèl·lules vegetals que han incorporat aquest fragment. Anem a la forma de cal·lus. Obtinc la planta.
Obtenció de plantes transgèniques: regeneració de la planta Agafo una fulla i tallo uns discs. Medi de cultiu i al voltant del tall tindrem cèl·lules que hem danyat. Les cèl·lules danyades desprenen acetociringona i infecto amb Agrobacterium. Faran tota la feina que hem dit abans i produirà cal·lus. Ho fiquem en un medi que hi hagi antibiòtic per poder seleccionar aquelles cèl·lules vegetals que han incorporat el gen. Medi que pugui induir la diferenciació de la cèl·lula desdiferenciada, es transporten aquests brots amb tot allò que pugui fer que es produeixin arrels... a tots els teixits de la planta tenim els gens d’interès.
Transgènics resistents a herbicides, resistents a patògens vegetals, plantes ornamentals, petits arbres de nadal (gen de luciferasa).
Per transformar cèl·lules vegetals es pot utilitzar material genètic de virus: Emprar com a vectors genomes virals: - Virus de DNA: el seu genoma es pot manipular inserit en vectors plasmídics Caulimovirus  accepta inserits curts Geminivirus  molt eficients per aconseguir als nivells d’expressió de proteïnes recombinants - Virus de RNA o Tobacco mosaic virus o Potato virus X (PVX) o o No integració en el genoma, ni passar a línia germinal, no es pot aconseguir una transformació estable. Infeccions sistèmiques ràpides. Tota la planta es pot fer servir per produir la proteïna codificada pel gen induït a través del vector viral.
Emprat biolística (més endavant) 31 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Marcadors de selecció (cèl·lules eucariotes) (inserit = marcador + gen a clonar) Verd  cèl·lules vegetals transformades Vermell  cèl·lules animals transformades Marcador selecció endogen: gen que codifica per una proteïna que reverteix una mutació de la cèl·lula hoste Marcador selecció exogen: confereixen una propietat nova a la cèl·lula que transformem APH: Si tenen inhibida la droga podran fer síntesi proteica i per tant sobreviuen.
DHFR: afegim Mtx i inhibeix la DHFR però les cèl·lules que han incorporat la variant resistent, tot i tenir l’enzim inhibit com tenen la variant presentaran resistència HPH: posem Higromicina B que inhibeix la síntesi proteica però pot créixer TK: fiquem al medi aminopteridina i el que passa és que les cèl·lules són TK negatives però si s’han transformat amb el marcador de selecció podem sintetitzar pel nucleòtid HGPRT: fiquem àcid micofenòlic però les transformades sí poden sintetitzar GMP a partir de xantina ADA: fiquem Xil-A que provoca danys al DNA (mort cel·lular) i les cèl·lules transformades expressen ADA que inhibeixen Xil-A Ús de TK i de XGPRT com a sistemes de selecció positius MEDI HAT: hipoxantina, aminopteridina i timidina.
32 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Via salvatge o de reciclatge: aprofita tots els productes de degradació d’una cadena d’àcid nucleic.
Vies de novo: sintetitzo nucleòtids a partir de molècules molt senzilles sobre un anell de ribosa que hem activat Les meves cèl·lules al medi HAT, la H bloqueja tota la via de novo i no podem sintetitzar nucleòtids per aquesta via. L’altre via només funciona si tenim timidina quinasa (TK) i fosforibosil transferasa (HGPRT). Si fiquem H i T (substrats dels enzims esmentats anteriorment). Es tracta de bloquejar una de les vies i ficar els substrats dels enzims de l’altre via i només aquelles cèl·lules que incorporin els gens per codificar els enzims podran utilitzar aquella via per sintetitzar nucleòtids.
Transformació amb Cl2Ca Sistema basat en l’ús d’agents químics per transformar cèl·lules eucariotes o procariotes utilitzem sempre el clorur de calci (sal).
Cultiu bacterià el faig créixer fins la fase exponencial de creixement, es formen porus en la membrana de la cèl·lula bacteriana i s’obtenen cèl·lules competents.
33 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Un cop tinc les cèl·lules en aquest estat, afegim el producte de reacció de lligament.
Normalment, les membranes cel·lulars tenen càrrega negativa i el clorur de calci fa un complex amb el DNA apantallant les càrregues negatives per facilitar la unió a la membrana.
Xoc tèrmic de 2 minuts que permet que aquest DNA (DNA recombinant) que té unit o interaccionant amb la membrana de la cèl·lula bacteriana passi a l’interior a través de porus. Després deixem que es tanqui la membrana.
Aquests protocols per procariotes NO ENS SERVEIXEN PER LA INTRODUCCIÓ O TRANSFORMACIÓ DE PROCARIOTES EN VECTORS MOLT GRANS (PACs i BACs).
Transformació per lipofecció Formació de liposomes (membranes o bicapes lipídiques que adopten forma esfèrica) i es poden aconseguir barrejant diferents tipus de lípids i sonicant. Quan es formen els liposomes el DNA queda encapsulat i els liposomes es troben en cremes per les arrugues. Aquesta membrana o bicapa lipídica esfèrica, com més igual sigui la composició de la bicapa lipídica a la membrana cel·lular quan posem en contacte els 34 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) liposomes amb la membrana es produeix una fusió i el contingut del liposoma va a parar a l’interior de la cèl·lula i part del contingut va a parar a l’interior del nucli.
Transformació per electroporació PACs i BACs s’introdueixen a les cèl·lules per electroporació perquè el mètode anterior no serveix. Serveix per transformar tant eucariotes com procariotes.
Procariotes amb vectors molt grans concretament. Agafem el cultiu i el posem en suspensió en un medi i posar-lo dins d’una cubeta. Afegim el DNA que volem introduir dins de les cèl·lules i aquesta cubeta porta dos elèctrodes que es poden connectar a una font que generarà un voltatge. Apliquem el voltatge controlat durant un temps relativament curt i aquesta descàrrega elèctrica provoca porus a la membrana elèctrica mitjançant els quals el DNA s’introdueix a les cèl·lules i part d’aquest pot arribar al nucli. Posteriorment fem un procés de selecció per veure els que l’han incorporat.
35 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Resum tipus de transformacions Biolística La biolística consisteix en disparar. El que fem és agafar partícules de tungstè o d’or (1 micròmetre de diàmetre) i es col·loquen en una solució que conté el meu DNA (vector amb el gen inserit) i al voltant de les partícules hi ha DNA introduït a les cèl·lules.
Col·loquem el teixit vegetal que ha de ser transformat i això seria la secció d’una d’aquestes pistoles. El canó, percutor, la bala i un obturador. El que fem és col·locar en aquest sistema de partícules la meva bala. Tenim un petit forat al obturador.
Disparo, el percutor fa sortir la bala disparada i davant de la bala hi ha les partícules que sortiran disparades per un forat que reté la bala. Aquestes partícules surten disparades al teixit vegetal. Al punt on impacten s’ho carreguen tot però allà on arriben al voltant amb menys velocitat, les cèl·lules no es moren i la bola permet la entrada dins de la cèl·lula amb el DNA que embolcalla les partícules. Agafo la part del teixit en un medi que permet regenerar les plantes. Arriba al nucli i a determinats orgànuls (mitocondri i cloroplasts). S’ha utilitzat en animals (teràpia gènica i lesions cutànies).
Principalment s’utilitza en cèl·lules vegetals.
36 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Microinjecció Cèl·lules animals. Consisteix en agafar una cèl·lula, manipular la cèl·lula i es tracta de creuar mascle i femella dels organismes que siguin i aïllar un ou fertilitzat en un estadi primerenc on estan els dos nuclis. Aïllo els ous fecundats i s’aguanten en una pipeta.
En una xeringa extremadament prima introduïm el gen que interessa dins del pronucli masculí (més gros, es veu més bé i és més fàcil d’introduir). Els òvuls es fiquen a una mare de lloguer i portarà a terme el embaràs. Donarà lloc a diferents teixits que portin el gen que nosaltres ens interessa. Quin d’aquests aliments porten en algun dels teixits del cos el gen d’interès amb PCR agafant mostres. Les rates es creuen i es pot aconseguir homozigots que poguessin generar organismes que portessin en tots els teixits del seu cos el gens que ens interessa. Transformem una sola cèl·lula cada vegada i és més difícil de realitzar que els altres processos.
37 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) 38 ...

Tags:
Comprar Previsualizar