Tema 17. Vía PI3K AKT (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 3º curso
Asignatura Cáncer
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 03/05/2016
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3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CÁNCER TEMA 17 Principales vías de señalización en cáncer: Vía PI3K/AKT La vía PI3K/AKT es la otra gran vía activada por receptores con actividad tirosina kinasa. Se trata de la vía más frecuentemente alterada en cáncer.
PI3K o fosfatidilinositol-3-kinasa es una kinasa que cataliza la fosforilación del fosfatidilinositol disfofato (PIP2) de la membrana para transformarlo en fosfatidilinositol trifosfato (PIP3). Es decir, es una kinasa que fosforila lípidos.
Podemos encontrar muchas PI3K diferentes que se agrupan en cuatro clases: clase IA, clase IB, clase II y clase III.
La mayoría de las PI3K están formadas por dos subunidades: una subunidad reguladora y otra subunidad catalítica.
Nosotros hablaremos sobre todo de la PI3K de tipo IA formada por las subunidad catalítica p110 α y por la subunidad reguladora p85α que es la que está más frecuentemente activada en cáncer. La mayoría de los datos de esta kinasa son extrapolables al resto de clases.
En función de cuál sea el estímulo recibido por las células, del tipo celular, … actuará uno de los tipos de PI3K.
VÍA PI3K/AKT La vía se activa fundamentalmente a partir de receptores con actividad tirosina kinasa, aunque también puede activarse a partir de receptores GPCR o de otros estímulos.
Tras la interacción del ligando con el receptor, las proteínas adaptadoras que se unen a los docking sites del receptor (residuos fosforilados) atraen a PI3K a la membrana. Una vez en la membrana, PI3K fosforila el PIP2 convirtiéndolo en PIP3, que actúa como 2º mensajero fundamental en la activación de la kinasa AKT (también llamada pKB).
El PIP3 de la membrana es reconocido por la propia AKT y por otra kinasa, PDK1.
AKT necesita ser fosforilada en la treonina 308 para activarse y esta fosforilación es llevada a cabo por la PDK-1. Además, para ser completamente activa, AKT necesita pasar por una segunda fosforilación, esta vez en la serina 473. Este segunda fosforilación es llevada a cabo por el complejo proteico mTOR2 (mTORC2).
1 CÁNCER Curso 2015/2016 Una vez la kinasa AKT está completamente activa, puede ser regulada por fosfatasas (el papel de las fosfatasas en la regulación es controvertido).
Se han descrito 3 AKTs diferentes, bastante homólogas entre ellas. Todas ellas requieren dos fosforilaciones para activarse.
AKT tiene mucho targets celulares a los que fosforila que están implicados en una gran cantidad de procesos que se encuentran activados en cáncer (los targets de AKT regulan procesos implicados en la transformación neoplásica).
- GSK3 está implicado en la regulación del ciclo celular y del metabolismo.
- AKT también fosforila factores, como FOXO, BAD, NFkB, que suprimen la apoptosis.
- A través de MMD2, AKT activa al supresor tumoral p53.
- A través del complejo proteico TSC1/2, AKT regula la actividad del complejo mTOR1 que regula la traducción proteica y la autofagia.
2 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Los complejos mTOR 1 y mTOR2 tiene a la proteína mTOR como elemento central. La diferencia entre ambos son las proteínas adaptadoras que se unen a mTOR, que hacen que pueda comportarse como sustrato de AKT o como regulador.
Además, la vía puede activarse de forma directa, de forma indirecta por la unión de adaptadores al receptor, o por la unión de Ras al receptor.
Mutaciones en PI3K La kinasa PI3K se encuentra muy frecuentemente mutada en cánceres, siendo la subunidad catalítica de la clase IA (110α) en donde podemos encontrar más mutaciones.
En la subunidad catalítica, podemos encontrar mutaciones puntuales y alteraciones en el número de copias (amplificaciones) que producen la ganancia de función de la kinasa.
Los porcentajes en los que encontramos las mutaciones son muy variables en función del tipo de tumor.
3 CÁNCER Curso 2015/2016 En el caso de la subunidad reguladora, podemos encontrar (en la PI3K de clase IA - subunidad p85α) alteraciones de pérdida de función, que hacen que la kinasa adquiera actividad constitutiva.
 La alteraciones más frecuentes en PI3K son las que se dan en la subunidad catalítica.
En el siguiente estudio se ha hecho un análisis en casos de cáncer de endometrio de las alteraciones de la subunidad catalítica y su correlación con mutaciones en PTEN o K-Ras.
Como puede verse en la imagen, las alteraciones más frecuentes de la subunidad catalítica se produce en los aminoácidos 542, 545 y 1047  son 3 hot spots (puntos calientes de mutación). Estas mutaciones hacen que la subunidad catalítica tenga actividad constitutiva.
Mutaciones en AKT Como ya hemos comentado, podemos encontrar tres formas de distintas de AKT, muy similares en cuento a secuencia.
Esta proteína fue identificada como un oncogen viral del retrovirus AKT8, que causaba timomas en ratones. Este virus se lleva una copia mutada del gen AKT, que da a la kinasa actividad constitutiva.
AKT no está mutada tan frecuentemente en tumores. Como podemos comprobar en la siguiente tabla, los porcentajes en los que encontramos AKT mutado en diferentes tumores son relativamente bajos.
Lo más frecuente son las amplificaciones del gen.
Las mutaciones en AKT son mutaciones de ganancia de función que hacen que tenga más actividad de la que corresponde y que la vía de señalización en la que participa se encuentre sobreactivada.
El elemento más importante de la regulación es la fosfatasa PTEN, también llamada NMAC (Mutated in Multiple Cancers) que es un supresor tumoral. PTEN antagoniza la función de PI3K: desfosforila PIP3, conviriténdolo en PIP2.
4 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV In vitro se ha observado que PTEN tiene actividad dual: aparte de ser una fosfatasa de lípidos, también desfosforila proteínas. No hay evidencias in vivo de que esto ocurra realmente.
Si PTEN está correcto (no está alterado), inhibe la activación de la kinasa AKT, inhibiendo toda la vía de señalización.
Además, aparte de la función de fosfatasa dual (y antagonista de PI3K)A, se han observado otras funciones de PTEN.
PTEN pueden translocarse al núcleo (no solo se encuentra en el citosol), donde regula la estabilidad genómica. El papel de PTEN en el núcleo en relación a la tumorogénesis aún no está claro.
Si PTEN no puede entrar al núcleo, se genera una gran inestabilidad genómica por lo que este supresor tumoral tiene un papel muy importante en la adquisición del fenotipo tumoral.
En el siguiente estudio vemos un análisis inmunohistoquímico de PTEN en el que se comparan 4 anticuerpos comerciales diferentes.
Algunos de estos marcadores daban marcaje en el núcleo y por lo que se pensó en un inicio que los marcadores eran inespecíficos (aún no se sabía que PTEN transloca al núcleo).
Alteraciones en PTEN Podemos encontrar pequeñas deleciones, deleciones del gen completo, mutaciones Frameshift que generan proteínas truncadas (que generalmente pierden al completo su función) y mutaciones puntuales que normalmente bloquean la actividad fosfatasa.
Las mutaciones en PTEN implicadas en tumorogénesis serán siempre mutaciones de pérdida de función (ya que es un supresor tumoral), que se traducen en ganancia de función de la vía PI3K/AKT.
5 CÁNCER Curso 2015/2016 PTEN es uno de los genes que pueden experimentar silenciamiento epigenético mediante la metilación de su promotor. Además, el gen está sometido a una regulación transcripcional en la que interviene una gran cantidad de factores de transcripción.
La vía Notch puede activar una serie de factores represores de la expresión de PTEN.
La gran regulación que gira en torno a PTEN implica que muchos de los elementos reguladores de su activación y de su expresión pueden encontrarse mutados: PTEN puede tener alterada su expresión pese a no estar mutado.
PTEN tiene en su estructura múltiples residuos susceptibles a modificación post-traduccional. Estas modificaciones tendrán múltiples efectos sobre la función de PTEN. Por ejemplo, la lisina que se encuentra en posición 13 es importante para que PTEN se sumoilice y se trasloque al núcleo (donde regula la estabilidad genómica).
PTEN es uno de los supresores tumorales que se encuentran mutados más frecuentemente. La incidencia de sus mutaciones es especialmente alta en casos de cáncer de próstata y endometrio.
Este último año se ha observado que PTEN puede presentar un fenómeno de dominancia negativa.
El gen puede estar mutado o delecionado, y las consecuencias de ambas alteraciones son diferentes.
Aunque falta por contrastar y refutar estos descubrimientos, se ha visto que una mutación puntual de PTEN puede desencadenar en un fenotipo más grave que una deleción por el fenómeno de dominancia negativa.
PTEN también necesita estar en forma de dímero para ser funcional. Si una copia mutada de la proteína forma un dímero con una copia normal, la copia mutada inhibe la actividad de todo el dímero (y, por tanto, la copia normal se encuentra inhibida por la mutada). En el caso de que haya una deleción, faltará un trozo de PTEN pero la copia normal del dímero compensa la función. Hay que recordar que al tratarse de un supresor tumoral hará falta que los dos alelos estén alterados para que se manifieste en el fenotipo, por lo que la deleción total de PTEN no tendrá ningún efecto si se produce en uno de los dos alelos solamente (se formarán los dímeros con la copia correcta).
6 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Son las mutaciones de carácter recesivo (es decir, aquellas en las que, para que se manifiesten en el fenotipo, deben estar mutados los dos alelos) las que causan los síndromes familiares.
PTEN es uno de los supresores tumorales responsables de síndromes de cáncer hereditario o familiar. El Síndrome de Cowden se caracteriza por la aparición de pequeños tumores en la piel o en la lengua. El individuo hereda una copia mutada de PTEN por lo que tiene predisposición al desarrollo de diferentes cánceres, sobre todo cáncer de mama, colon, endometrio y próstata (el incremento de PIP3 implica crecimiento celular).
Modelos animales para PTEN Se han estudiado las mutaciones de PTEN en muchos modelos animales.
El ratón knock out de PTEN (-/-) es letal embrionario  no supera la gastrulación. Se sabe que PTEN resulta importante en la formación de la gástrula.
Sí que es posible obtener animales heterocigotos (+/-) que solo tienen mutada una de las dos copias del gen. Estos animales constituyen un buen modelo para el síndrome de Cowden (tienen el mismo genotipo) y desarrollan diferentes patologías que pueden observarse en los pacientes.
Por lo observado en estos ratones, parece ser que PTEN es importante para el mantenimiento de la homeostasis.
Estos ratones constituyen un buen ejemplo del fenómeno de haploinsuficiencia ya que basta con perder una copia de PTEN para que se desarrollen tumores. Se producen muchas mutaciones, seguramente debidas al posible papel de PTEN en el mantenimiento de la estabilidad genómica.
El 100% de las hembras KO heterocigotas (+/-) desarrollan cáncer de endometrio. Ocurre algo similar con los machos y el cáncer de próstata. Además, estos ratones también desarrollan muchos linfomas.
Se han hecho muchos estudios manipulando PTEN genéticamente para estudiar de qué manera regula la vía PI3K/AKT y cuáles son las proteínas importantes en la regulación.
En el siguiente estudio se hicieron unos ratones deficientes para PDK1 (es la kinasa que se desplaza a la membrana y fosforila a AKT). Estos animales se cruzaron con animales con PTEN mutado. Por tanto, los animales que se obtenían de este cruce tenían por un lado una mutación (en PTEN) que provoca sobreactivacion de la vía y por otro lado una mutación (PDK1) que inhibe la vía por debajo de la mutación de PTEN. Como puede verse en las gráficas de % de ratones con tumores y de % de supervivencia, estos ratones desarrollaban menos tumores y tenían una supervivencia muy alta.
7 CÁNCER Curso 2015/2016 El hecho de que el KO de PTEN sea letal embrionario, dificulta el estudio (por la pérdida embrionaria) de la mutación en homocigosis de PTEN.
Para solventar este problema, se usan los mutantes condicionales. Se elabora en primer lugar una construcción genética con el gen flaqueado por dos secuencias LoxP. Este PTEN será completamente funcional ya que no tiene ninguna mutación. Cruzamos un animal que ha incorporado esta construcción en su genoma con otro animal que exprese Cre bajo el control de un promotor que únicamente se expresa en un tejido (en este caso, el investigador usó el promotor de la probasina, una proteína que solo se expresa en la próstata). La proteína Cre reconoce los loci LoxP y escinde todo lo que queda entre ellos.
El ratón resultante del cruce tendrá PTEN en todas sus células salvo en las de la próstata ya que en la próstata han expresado Cre que ha escindido PTEN. Estos ratones desarrollan carcinomas de próstata a una edad muy temprana por la inhibición total de PTEN.
Para generar estos ratones, el padre debe ser heterocigoto para LoxP-PTEN-LoxP y Cre. La madre también debe tener LoxP-PTEN-LoxP, bien en homocigosis o en heterocigosis. Haciendo el cruce de esta manera, obtenemos controles para el estudio.
De esta manera han generado un animal que permite eliminar las copias de PTEN para ver sus efectos en tumorogénesis También se han hecho ratones KO inducibles: el animal tiene las copias de PTEN normales pero, en el momento en que se quiera podemos inyectar una droga (Tamoxifen) que induce la pérdida de PTEN.
Como resultado de este experimento podemos ver que, a las 6-8 semanas de la deleción de PTEN, el 100% de los animales ha desarrollado un carcinoma.
Estos animales con PTEN mutado lo que hacen es reproducir el fenotipo que se observa en humanos.
8 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Podemos encontrar alteraciones de PTEN en muchos tumores (en la siguiente tabla podemos ver los % en los que aparece).
La vía PI3K/AKT en terapéutica Como se trata de una vía tan frecuentemente alterada en muchos cánceres, se han desarrollado multitud de fármacos destinados a frenar la señalización por esta vía, sobre todo para las alteraciones en PTEN y PI3K (que están muy implicados en carcinogénesis).
Se han desarrollado proteínas inhibidoras de la actividad de PI3K, mTOR, AKT, … e inhibidores duales.
Rapálogos Son homólogos de la rapamicina, que es un inmunosupresor. Fueron los primeros inhibidores sintetizados y se emplean actualmente en clínica. Entre ellos destacan el Everolimus y el Temserolimus (todos los rapálogos terminan en -imus).
Estos fármacos han sido testados en primer lugar en animales.
9 CÁNCER Curso 2015/2016 Tras el tratamiento durante tres semanas con Everolimus en ratón con mutación de PTEN, el animal ha mejorado considerablemente: ha cambiado la postura, vuelve a comer de nuevo, … En las fotos podemos ver cómo ha reducido mucho el tamaño del tumor de tiroides.
La esperanza de vida de los ratones se ha doblado.
Como se trata de fármacos inmunosupresores, presentan efectos secundarios considerables.
Los tumores acaban desarrollando resistencia a los fármacos. Esto hace necesario el desarrollo de nuevas generaciones de fármacos. Los fármacos de nueva generación tienen su actividad supresora bastante disminuida frente a su actividad como antitumoral.
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