Tema 7 - Quantificació àcids nucleics (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 13
Fecha de subida 15/04/2016
Descargas 22
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tema 7 – Quantificació per PCR QUANTIFICACIÓ D’ÀCIDS NUCLEICS Per PCR podem distingir mutacions, variacions en l’estat de metilació, podem fer quantificacions...
Tenim diferents tipus de PCR: la convencional, la PCR a temps real i la PCR digital.
PCR CONVENCIONAL La PCR convencional té una fase exponencial on podem quantificar el número de molècules en un moment determinat seguint la següent equació: 𝑸 = 𝒎(𝟏 + 𝑬)𝒏 On: - n són els cicles.
Q és la quantitat de DNA en un moment determinat.
m són les quantitats de còpies inicials.
E és l’eficiència de la reacció.
Segons la quantitat de molècules de les que partim, observarem diferències en el creixement exponencial. Com més quantitat tinguem a l’inici, menys estona es tarda en assolir el punt mig del creixement exponencial.
Si l’eficiència fos del 100% les corbes serien el doble/la meitat... però només passa a la fase exponencial.
Però en aquest tipus de PCR tenim un problema: - - Partint de la mateixa quantitat de DNA, podem obtenir una quantitat final de productes diferent (segons com s’ha donat la PCR, la Taq...), tot i que la fase exponencial haurà sigut igual.
Partint de diferents quantitats de DNA, també obtenim diferents quantitats finals (podem haver començat amb n molècules i tenir-ne més que si hem començat amb 2n).
177 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Així doncs, no és viable analitzar el producte final per quantificar.
Hi ha anàlisis només es té en compte la fase exponencial, que ofereix una mica de precisió.
Les PCR semiquantitatives aturen la PCR en la fase exponencial i analitzen el producte que hi ha en diferents PCR’s. Ara bé, això no és fiable. Per tant la PCR convencional no serveix per quantificar.
PCR A TEMPS REAL S’han introduït sistemes de lectura òptica en els termocicladors de manera que permeten seguir el procés de la PCR en temps real. Aquesta PCR és molt més precisa que la convencional.
El seguiment es pot fer a través de colorants fluorescents amb afinitat pel DNA de doble cadena. Com més DNA de doble cadena, més fluorescència observarem. Per tant, el sistema òptic haurà de permetre llegir la quantitat de fluorescència al llarg del temps de cadascun dels dials on es produeix la PCR.
Necessitem: - - Font d’il·luminació: que excitarà els fluorocroms. Pot emetre una o diferents longituds d’ona.
Sistema de lectura de la fluorescència: amb lents diferents per llegir diferents longituds d’ona.
178 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Detecció del DNA per SYBR Green I El primer colorant utilitzat va ser el bromur d’etidi. Actualment s’utilitza el SYBR Green I, que s’uneix al DNA en el solc menor de la doble hèlix.
En solució, el SYBR Green I que no s’uneix al DNA emet molt poca fluorescència, mentre que la seva unió al DNA potencia l’emissió de fluorescència. És per això que a la fluorescència que llegim de la PCR li hem de restar la fluorescència que emet de manera lliure (s’han de fer els “blancs”).
El SYBR Green I és molt estable (únicament perd un 6% d’activitat al llarg de 30 cicles d’amplificació).
La lectura de la fluorescència no és contínua, perquè sinó aniríem veient pujades i baixades de fluorescència. Al programa li indiquem el moment en què ha de fer la lectura, que normalment és cap al final de la fase d’extensió de cada cicle.
Si la quantitat de DNA es va duplicant, la lectura de fluorescència també ho farà.
Hem de tenir en compte que la fluorescència als primers cicles quasi no es detectarà perquè el nivell de fluorescència està per sota el nivell de resolució del lector. A partir d’un moment determinat sí que començarem a veure fluorescència.
179 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Quantificació No existeix una relació lineal entre quantitat inicial de DNA i la quantitat final, tot i que si ens fixem en les corbes de fluorescència, les primeres corbes que comencen a créixer son les que tenen més DNA inicial.
Hem d’escollir un llindar (threshold), a partir del qual començar a quantificar. El cicle en què posem el llindar de fluorescència està per sobre el nivell de resolució i està relacionat directament amb la quantitat inicial de DNA. El cicle on posem el llindar sí que ens pot indicar la quantitat inicial de DNA, de manera que el llindar ens pot ajudar a quantificar.
La fluorescència es pot representar a escala logarítmica de manera que ens aparegui una recta (més fàcil d’analitzar).
180 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 El llindar de fluorescència que considerarem en la PCR és arbitrari, l’escull l’investigador, però mai ha d’estar per sota el nivell de resolució del sistema. Si definim un altre llindar, les diferències entre cicles es mantindran.
Per poder estimar la quantitat de còpies inicials (m) hem de saber la quantitat de còpies que hi ha en un cicle determinat. La quantitat de fluorescència ens determina la quantitat de DNA en un cicle. Donat que en la representació gràfica tenim Q i n, podem calcular m (quantitat inicial de molècules). L’eficàcia de la PCR s’obté del pendent de la recta (a escala logarítmica).
Com més alt sigui el pendent, més eficaç és la tècnica.
𝑸 = 𝒎(𝟏 + 𝑬)𝒏 𝑬 = 𝟏𝟎 (− 𝟏 ) 𝒑𝒆𝒏𝒅𝒆𝒏𝒕 −𝟏 Es considera que l’eficiència és bona entre 0,9 i 1,0. El pendent ideal se situa a 3,3.
181 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Ara bé, necessitem un punt de referència per determinar el patró de fluorescència base. Les cases comercials ofereixen patrons de calibratge del DNA, corresponents a un estàndard de concentracions molt ben calibrades. Sobre aquests patrons s’ha de fer una PCR per determinar la quantitat de fluorescència que correspon a una determinada quantitat de DNA.
Sobre la recta que obtenim en aquest patró de calibratge, determinem el llindar i un cop tenim això ja podem fer les altres PCR.
Sempre que els valors de les PCR analitzades es trobin dins els valors de la recta del patró, les PCR seran correctes i les quantificacions bones. Si els valors són més grans o més petits, voldrà dir que les mesures no són bones.
182 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 La quantificació pot ser: - - ABSOLUTA. Precisem d’un estàndard de concentracions molt ben calibrades. Serveix per detectar: o Contaminacions víriques o bacterianes.
o Presència de transgens.
RELATIVA. No necessitem patrons de DNA, sinó gens de referència (gen constitucional); s’ha de comparar envers un control endogen per normalitzar les dades. L’expressió d’aquest control endogen no varia entre mostres comparades.
Serveix per detectar: o Expressió diferencial entre teixits.
o Expressió diferencial en resposta a un fàrmac.
Aquests controls poden ser:    GAPDH.
β-Actina.
Subunitat ribosomal de 18S.
Expressió diferencial depenent de teixit Variació de l’expressió en resposta a un fàrmac (quantificació relativa) Situació: utilitzem un gen constitucional, que anomenarem mostra A, que talla al cicle 16 (16 Ct).
Després tenim el gen que analitzem amb el fàrmac, que anomenarem mostra B, que talla al cicle 17 (17 Ct; hi ha un cicle de diferència, 1 Ct). Si l’eficiència fos 1, el gen A s’expressaria 2 vegades més que B (A>B = 21).
Si el gen sense el fàrmac talla al 21, llavors s’expressa 16 vegades mes (24). Per tant, en aquest cas, el fàrmac redueix 8 vegades l’expressió del gen; el tractament produeix una disminució de l’expressió del blanc.
A>B = 24, ja que A: 17Ct i B=21Ct 183 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En aquest altres exemple no hi ha variació de l’expressió del blanc entre els teixits.
Formació de dímers d’encebador Sovint, quan fem la PCR, a més de créixer la corba corresponent al nombre de còpies, també creix la corba corresponent al control, tot i que té 0 còpies de DNA i per aquest motiu esperaríem que fos una recta.
Això ens indica que s’està amplificant el dímer d’encebadors, i això és una prova que hi ha inespecificita.
184 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Anàlisi de les corbes de fusió L’amplificació inespecífica dels dímers d’encebadors altera els resultats. Per eliminar aquesta inespecificitat fem servir corbes de fusió.
A la PCR li afegim un pas més, de manera que la PCR queda: 1. Augmentem la temperatura (95ºC) per desnaturalitzar el material 2. Baixem la temperatura per sota de la temperatura de fusió esperada, tot permetent que es doni la renaturalització.
3. Augmentem gradualment la temperatura (≈0,2 ºC/segon) mentre es fa un seguiment de l’emissió fluorescent. Des d’aquest moment programem el lector perquè faci una lectura contínua de fluorescència.
La corba que ens apareixerà anirà decreixent fins arribar a un punt en què baixarà de cop.
Si enlloc de representar la quantitat de fluorescència representem la variació de fluorescència per unitat de temps, la corba es transforma i ens apareix un pic corresponent a la Tm.
Si en aquesta corba surten dos pics, ens està indicant que s’han amplificat dos productes, cadascun d’ells amb una Tm diferent. Si mirem les corbes que corresponen al control veurem que hi ha un pic que coincideix en ambdós casos i es el dels dímers d’encebadors (té un pic inferior al del producte amplificat).
185 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Imaginem que la Tm dels encebadors és de 78ºC i la dels productes a 89ºC. Per evitar llegir els dímers d’encebadors, es tracta de redissenyar la PCR i introduir una quarta etapa: 4. A la fase d’extensió pujarem a 84 ºC i llegirem la fluorescència, de manera el dímer d’encebadors estarà desnaturalitzat i la lectura correspondrà íntegrament al producte amplificat sense els dímers. Aquesta lectura és fiable. Per fer això hem de saber la Tm de productes i dels dímers d’encebadors.
186 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Avantatges PCR a temps real - Sensibilitat.
Resultats quantitatius.
Temps de reacció (major rapidesa).
No hi ha passos posteriors.
En ser un sistema tancat, generalment no hi ha contaminació.
PCR DIGITAL La PCR Convencional és problemàtica a l’hora de quantificar. Tot i que hi ha estratègies per millorar-la no és aconsellable. La PCR a temps real és la que s’usa amb més freqüència per quantificar. Com a última alternativia tenim la PCR digital, tot i que és la més cara i no tots els laboratoris la poden fer.
En el mercat trobem diferents sistemes i alternatives: - S’usen microfluids en microcanals, micropouets, microgotes...
La PCR digital permet la quantificació absoluta, sense corbes de calibratge.
És més sensible i precisa que la PCR a temps real, però també és més cara. Podem detectar menys d’un 1% de còpies d’una seqüencia determinada en una mescla de molècules de DNA.
Droplet digital PCR (ddPCR) La mostra de DNA i els components de la reacció de PCR se separen en microcompartiments (microgotes) obtingudes per la mescla de dos líquids immiscibles.
187 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Detectarem bàsicament si hi ha amplificació o no (la quantitat de DNA que amplifica no ens importa). Per detectar-lo farem servir el fluorescent SYBR green.
Normalment fem servir aquesta PCR per analitzar algun àcid nucleic en poca quantitat. Si hi ha molt poca quantitat de DNA, la majoria de microgotes no hauran amplificat perquè no tindran DNA. Alguns tindran una còpia de DNA, i molt poques en tindran dues. On hi hagi fluorescència, hi haurà una microgota amb DNA.
Són necessaris3 aparells: - - El primer genera les microgotes. Tot el reactiu passa per un tubet on es reuneix amb un altre líquid oliós que fa que es produeixin les microgotes. Les microgotes es posen en una placa de microeppendorfs.
Això es posa en un termociclador i es fa la PCR. A cada eppendorf hi ha milers de microgotes. Unes tindran DNA i amplficaran (emetran fluorescència) i les altres no.
Això es passa en un 3r aparell que és un detector que captura les microgotes de cada eppendorf, les passa per un microcanal que passa per un detector de fluorescència i cada gota dóna un pic, si no hi ha gota no hi ha pic.
188 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Obtenim gràfics com aquests: El nombre de còpies segueix una distribució de Poisson, ja que la majoria no tenen DNA, algunes tenen 1 còpia i superpoques tenen dues o més còpies.
Un cop fetes les PCR, les microgotes es passen per un tub que llegeix la fluorescència.
Observarem: - Microgotes PCR(-) negatives (amb una mica de fluorescència perquè el fluorocrom emet una mica).
Microgotes PCR (+) positives.
Si sabem el factor de dilució aplicat a la mostra i el volum mig, podem saber quina és la concentració de DNA.
A partir de la proporció de gotes positives podem saber quantes còpies hi ha per gota de mitjana i la concentració de DNA. Com que segueixen una distribució de Poisson, la mitjana de còpies per gota (M) serà: 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑢𝑠 𝑀 = − ln (1 − 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑢𝑠) La proporció va variant i ens dóna informació sobre la quantitat de còpies. És un sistema d’amplificació ràpid i sensible.
189 ...