Temes 15, 16, 17, 18 i 19 (2012)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 1º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2012
Páginas 9
Fecha de subida 24/02/2015
Descargas 7
Subido por

Vista previa del texto

Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana TEMES 15-19: GENÈTICA BACTERIANA (1r Parcial) El DNA és una molècula de doble hèlix amb nucleòtids complementaris enfrontats per ponts d’H. El DNA té: T, A, G, i C. El DNA es replica per transcriure la seva informació a RNA, la cadena que es transcriu es complementària i no conté timina, sinó uracil. Llavors el RNA es tradueix als ribosomes, cada 3 nucleòtids del DNA corresponen a un aminoàcid de la proteïna que sorgirà de la cadena.
REPLICACIÓ DEL DNA La replicació del DNA és semiconservativa, la síntesi de DNA es fa gràcies a la DNA polimerasa que llegeix de 3 a 5. Les helicases obren la doble hèlix, abans de començar la síntesi, la DNA polimerasa necessita un RNA primer sintetitzat per la primasa. La DNA polimerasa sintetitza de 5’ a 3’. En la replicació, una cadena és retardada, tarda més a fer-se ja que està en sentit contrari del sentit en que llegeix la DNA polimerasa, els fragments que es generen s’anomenen fragments d’okazaki (cadascun conté un RNA primer).
Quan es replica una molècula de DNA circular en la nova cadena circular de DNA, una és nova i l’altre és vella.
TRANSCRIPCIÓ La RNA polimerasa fa una còpia del DNA en RNA.
TRADUCCIÓ En aquest RNA, cada triplet d’aminoàcids codifica un aminoàcid que és transportat per un RNAt. El ribosoma fa la traducció i es va movent al llarg de la RNAm (de 5 a 3) i a mesura que fa això la cadena proteica va creixent.
GEN Parlem de GEN com a seqüència contínua de nucleòtids que te una funció biològica, codifica per alguna cosa. Hi ha gens estructurals (codifiquen per proteïnes de l’estructura de la cèl·lula), altres que s’utilitzen per RNA ribosòmic, de promotor i operador (lloc de reconeixement d’altres molècules)...
1.GENOMA BACTERIÀ Són el conjunt total de gens que porta un bacteri (si en el bacteri a més a més del cromosoma, hi ha gens en algun lloc, allò també forma el genoma), el plasmidi també forma part del genoma. El genoma no està recollit en un nucli, a vegades es parla d’una zona més densa (nucleoide) on està el genoma. El gruix del cromosoma està en el cromosoma circular. Els plasmidis normalment codifiquen per gens importants pel bacteri: propietats fenotípiques (resistència…). La replicació del plasmidi és autònoma.
PLASMIDIS Són autoreplicatius, de doble hèlix, hi ha diferent nombre de còpies, tenen un origen de replicació (lloc per on comença la replicació), no són gaire grans, hi 1 Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana ha alguns que són específics d’espècies i altres no, no són imprescindibles pel bacteri però en alguns casos aporten particularitats bones per la cèl·lula. Els plasmidis es classifiquen en funció de les propietats i les espècies on és compatible.
ELEMENTS MÒBILS En el genoma bacterià hi ha elements mòbils: elements genètics amb capacitat de moure’s dins del cromosoma, una de les característiques d’aquests és que allà on s’inserten no ho fan perquè els toqui, sinó que es poden insertar on volen, Aquesta capacitat de moure’s és una cosa que genera canvis genètics i és un element que contribueix en l’evolució. Alguns exemples d’elements mòbils son les seqüències d’inserció (IS), transposons i integrons.
Si una d’aquestes seqüències s’insereix al mig d’un gen, aquest deixa de ser funcional, i si aquest gen formava part d’una seqüència que es traduïa junta, ara es malmet també aquesta seqüència.
Seqüències d’inserció (IS) Les seqüències d’inserció són el tipus més simple d’element mòbil, només es troben gens que participen en la mobilització.
Transposons Els transposons tenen en un extrem una seqüència d’inserció sencera i en l’altra també. Al centre, poden viatjar gens diferents (molt són gens de resistència).
Els transposons a vegades son molt grans, fins i tot poden codificar 25 gens diferents. Si dins d’aquests hi ha gens que codifiquen gens de virulència llavors diem que el transposon és un illot de virulència o patogenicitat.
El transposon pot saltar del cromosoma al plasmidi i també hi pot haver una fusió de plasmidi i genoma i replicar el transposo.
Integrons Els integrons estan formats pel gen de la integrasa i per seqüències de recombinació específica. Els integrons normalment van acompanyats de cassetes gènics: conjunts de gens de resistència antibiòtica que viatgen junts.
De manera que tenim junts el gen de la integrasa. Els integrons estan integrats en un transposo, que té les dues seqüències d’inserció, i tot això està normalment integrat dins d’un plasmidi, que és el que té més capacitat de mobilitat.
2.REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GENÈTICA La manera com els bacteris tenen les capacitats tan ràpides en el canvi de concentracions de nutrients s’explica per tres factors: 1-Producció coordinada d’enzims: tots els enzims necessaris per fer una via metabòlica estan en seqüència dins el genoma. De manera que la transcripció dels enzims necessaris per una via es molt mes rapida perquè la polimerasa no ha d’anar buscant. Un operon és aquell fragment de DNA que inclou els gens que codifiquen els enzims necessaris, davant té un promotor(diana de 2 Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana regulació) i al final té la seqüència d’acabament de la transcripció. Els operons estan regulats de diferent manera: -Alguns operons necessiten la presència de la substància que participa en la via metabòlica perquè s’indueixi la RNA polimerasa mitjançant l’ajuda d’una proteïna activadora i un inductor que s’uneixen al promotor i llavors la RNA polimerasa pot actuar.
2-Transcripció regulada directament per unes proteïnes repressores: Pot ser que la transcripció sigui contínua i que per una determinada circumstància es necessiti parar la síntesi. Amb el qual hi ha una molècula repressora juntament amb la corepressora que paren la transcripció. Ex/ Si s’acumulen concentracions elevades de triptòfan es bloqueja la seva síntesi.
3-Regulació a nivell de la síntesi de les proteïnes pel ribosoma: es pot regular la síntesi de proteïnes bloquejant el pas del ribosoma perquè en la presència d’un lligand el ARNm canvia de conformació.
3.MUTACIONS Són alteracions de la seqüència del DNA del genoma. Les mutacions es donen de forma espontània, si que es cert, que hi ha agents físics o químics que indueixen les mutacions (calor, llum UV, radiacions ionitzants…), també hi ha agents químics que l’alteren(anàlegs d les bases, mutàgens que produeixen canvis d’estructura i substàncies químiques que reaccionen amb el DNA).
Els bacteris tenen mecanismes per evitar les mutacions. Hi ha transició, transversió, mutacions silents (no tenen impacte en el pèptid final)Les de sentit erroni es produeix un canvi d’aminoàcids (mutació conservadora-l’aa nou té característiques o propietats similars al d’abans, mutacions sense sentit la proteïna no és funcional).
Hi ha mutacions que s’anomenen de canvi d’estructura que es donen quan hi ha inserció o deleció de bases (1 o 2 bases) es trastoca la lectura de tots els aminoàcids. La majoria de les vegades dóna lloc a una proteïna sense sentit.
També hi ha mutacions nul·les on un fragment considerable es perd o s’inserta.
MECANISMES DE REPARACIÓ DEL DNA Les mutacions són en relativa freqüència de manera que els bacteris tenen diferents mecanismes de reparació: -Mitjançant enzims -Per escissió: s’elimina el gen incorrecte i es torna a fabricar -Post-replicació: es procura recuperar la informació buscant en DNA extern la seqüència que està mutada.
-SOS: quan hi ha molts gens mutats es pot induïr uns 15 gens que poden bloquejar la replicació, es substitueixen gens mutats per nous. Moltes vegades s’ha de parar la replicació.
-Reparació propensa a error: es quan hi ha hagut una deleció bastant gran del genoma (fins i tot de doble cadena) i el que es fa es anar posant nucleòtids sense seguir cap model de DNA.
Aquestes mutacions que es donen en bacteris tenen una difusió vertical (de mares a filles).
3 Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana No totes les mutacions són perjudicials pel bacteri.
SELECCIÓ DE MUTANTS Al laboratori podem tenir interès per soques que han estat mutades, per exemple seleccionar quines bactèries són resistents. Els mètodes per veure això són diferents. Si volguéssim identificar bactèries que han adquirit resistència per mutació només hem de posar-les en un medi de cultiu amb antibiòtic. Hi ha altres mutacions que no són tant fàcils de veure, per exemple bactèries auxòtrofs, que no poden sintetitzar un determinat compost. El mètode és mitjançant repliques, es té un medi que té tots els nutrients necessaris ( la bactèria no n’ha de sintetitzar cap), totes les catèries que hi ha poden créixer..
A continuació, sobre un motllo es posa la placa d manera que en el motllo queden impregnades les bactèries. Amb aquest motllo es fan fues rèpliques, una placa amb el medi complet i una altra amb un medi mínim. En el medi complet creixeran totes les bactèries i en el medi mínim nomes creixeran les que no tenen mutació. Les cèl·lules mutades són les que creixen en el medi complet però no en el mínim.
MUTACIONS REVERSES I MUTACIONS SUPRESORES MUTACIÓ REVERSA: Mutació que es dóna sobre una mutació. Pot passar que la segona mutació restableixi un altre vegada la soca salvatge o bé que doni una soca diferent però fenotípicament igual.
MUTACIÓ SUPRESSORA: No es dóna justament en el mateix lloc de la primera mutació sinó que en el final del gen o bé en un altre gen però aquesta segona mutació compensa o emmascara la mutació inicial (pot ser intragènica- en el mateix gen, o bé intergènica- en un altre gen).
TEST DE DETECCIÓ DE MUTÀGENS, TAST D’AMES És la detecció de substàncies que produeixen mutació. Es fa a partir del Test d’Ames. Amb aquest mètode s’utilitzen bacteris. Es parteix d’una col·lecció de soques de la Salmonella enterica serovariedad tyiphimirium que és axotròfica per la Histidina (es mor en medis sense Histidina). Dins d’aquesta soca de bacteris i ha diferents varietats però no totes tenen les mateixes mutacions, tot i això, el resultat final és el mateix, a més a més són soques que a través de la mutació afavoreixen que les substàncies del medi penetrin a l’interior. A més a més, presenten un defecte per reparar el seu DNA. Aquest, és un test de reversió i consisteix en tenir un cultiu d’aquestes bactèries auxotròfiques per la histidina. Fem dos cultius, un amb medi mínim però amb una quantitat molt petita d’histidina, en l’altre un medi mínim amb una mica d’histidina i el mutagen a estudiar. Això es posa a l’estufa i es mira les colònies que han sorgit. Totes les bactèries que han fet colònies les anomenem revertents (reversió de la mutació) perquè sinó amb tant poca histidina no haguessin pogut fer cap colònia, això vol dir que han tingut mutacions reverses que hagin pogut fer que les bactèries hagin pogut sintetitzar histamina de nou, Les de la primera placa són revertents espontànies. Si el nombre de colònies és igual o molt similar en la segona placa respecte la primera, les bactèries de la segona seran 4 Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana revertents espontànies. Si n’han aparegut moltes més vol dir que són revertents induïts per mutàgen.
4.INTERCANVI DE GENS EN PROCARIOTES L’intercanvi de DNA a vegades pot ser neutre o conferir advantatges. Aquest DNA nou pot quedar com un material extracromosòmic o bé integrar-se en el genoma. El material extracromosòmic més avantatjós pels bacteris son els que donen resistència, produeixen bacteriocines, toxines que els permeten metabolitzar certes substàncies. Els mecanismes pels quals intercanvien DNA entre cèl·lules (no de mares a filles) són: -Transformació, conjugació i transducció.
La difusió és horitzontal, és a dir, es traspassa informació entre bactèries diferents. Fins i tot dins de la mateixa espècie o bé entre espècies diferent es poden passar informació.
TRANSFORMACIÓ Es va descobrir cap al 1928 pel doctor Griffith, el que es va veure es que si hi havia una població bacteriana de Streptococcus pneumoniae amb paret s’inoculava dins un ratolí el matava. Si s’inoculava el mateix bacteri sense paret no es moria. Si s’inoculaven bactèries amb paret però mortes el ratolí no moria.
Però si posaven Streptococcus pneumoniae amb paret i morts, i streptococcus pneumoniae sense paret, el ratolí moria. En analitzar la sang d’aquest ratolí s’observava que hi havia bacteris amb paret.
Per estudiar com va passar això van agafar Streptococcus pneumoniae capsulat, a continuació van agafar el DNA i les proteïnes que contenia. Per una banda, van tractar això amb una substància que degradava les proteïnes (per tant només ens queda DNA), per altra banda, el van tractar amb una substància que degradava el DNA. Llavors cada preparat es posava en contacte amb bacteris d’aquesta espècie sense paret. Com a conclusió es va veure que el que induïa la paret era el DNA, ja que nomes tenien paret les bactèries que s’havien posat amb contacte amb el DNA sense les proteïnes.
-La transformació consisteix en que els bacteris poden captar el material del medi amb més o menys afinitat. Existeixen uns enzims (a nivell de la paret cel·lular) que incorporen el DNA, però l’incorporen amb una sola hebra, perquè alhora que hi ha la internalització del DNA, hi ha un altre enzim que degrada una hebra.
A més a més, també hi ha enzims que recombinen la molècula de DNA al genoma.
CONJUGACIÓ Existeix un intercanvi directe de DNA entre bactèries. Normalment això es fa mitjançant pilis sexuals (petits conductes que s’estableixen entre cèl·lules i a través del qual les cèl·lules s’apropen i passa aquest DNA). Las conjugació més coneguda és la que ve donada pel factor F (F= fertilitat), el factor F és un plàsmid. La transferènca de material genòmic es dóna de forma unidireccional 5 Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana (d’una cèl·lula a una altra), és a dir, des del que té el factor F (cèl·lula donadora, F+) a la que no el té (cèl·lula receptora, F-).
El factor F està format per tres regions: -té un punt de replicació i gens que codifiquen per la replicació -té una regió de transferència -té una regió d’integració.
Per tant aquest factor F codifica per la transferència d’una còpia d’ell mateix.
Hi ha tres tipus de cèl·lules que contenen el factor F: -F+:el factor F està com a material extracromosòmic -Cèl·lules Hfr (alta freqüència recombinació) :Cèl·lules que tenen el factor F integrat al cromosoma.
-F’: Cèl·lules que tenen el plasmidi del factor F i a més material cromosòmic al plasmidi.
Conjugació des de una F+ fins a una FEs replica el plasmidi, una de les hebres entra a la cèl·lula receptora i mica en mica es va sintetitzant la nova hebra en els dos plasmidis, així, totes dues, tenen una hebra nova i una hebra vella.
Conjugació des de una Hfr Si té el plasmidi integrat al cromosoma, l’origen de replicació està en un punt intermedi del factor F. Quan s’uneixen les cèl·lules i es replica el genoma entra al principi una mica de factor F, llavors entra una part del cromosoma bacterià i si acabéssim de replicar, al final entraria l’última part del factor F.
Tot i això, el genoma no arriba a passar tot, sinó que les bactèries es separen abans. Així, la cèl·lula Hfr només ha de tornar a copiar la part del plasmidi que ha transferit. La cèl·lula que ha rebut el DNA, no té tot el factor F, per tant, no ha arribat a ser F+. Així té un tros de DNA, que en un principi no li serveix per res, així, pot ser que el DNA el degradi o bé que l’incorpori al genoma.
Les cèl·lules Hfr també han estat útils per saber on estan situats els gens en el cromosoma bacterià. Es fa un cultiu amb bacteris F- i bacteris Hsf, es paren els cultius en diferents temps. De manera que en diferents temps es pot veure quin gen han incorporat abans, quin després i així successivament. Per tant es pot dibuixar el mapa dels gens al cromosoma ( que es dibuixa en minuts).
Conjugació bacteris F’ El bacteri F- per tal de tenir un “plasmid” allibera el tros del factor F del genoma però en el procés s’enduu un tros de genoma, per tant no és realment un factor F, sinó que el bacteri segueix sent un F’ i quan transmet el plasmidi, també traspassa informació del seu genoma.
A vegades aquesta conjugació pot ser del cromosoma o de part d’ell.
TRANSDUCCIÓ 6 Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana Es traspassa mitjançant els bacteriòfags. Alguns fags lisogènics, enlloc de desintegrar nomes el seu material genètic del DNA bacterià, no desintegren totalment el seu material, sinó que se n’emporta de bacterià i li’n deixa al bacteri de víric. Llavors els virus que es formen són partícules transductants, perquè quan infectin altres bacteris traspassaran aquesta informació del cromosoma bacterià (del bacteri que han infectat anteriorment) a els bacteris que afectin novament. Aquest fragment pot ser innocu pel bacteri o bé aquest hi pot sortir beneficiat.
Un cop aquestes partícules transductants infecten un nou bacteri pot ser que el material del virus s’incorpori o no en el genoma i per tant alliberi gens d’un altre bacteri.
Els virus que fan els cicle lisogènic s’anomenen atenuats, i els virus que fan el cicle lític s’anomenen virulents.
5.ENGINYERIA GENÈTICA També Rep el nom de tecnologia del DNA recombinant, i són les tècniques que ens han permès manipular i treballar amb DNA i per tant, conèixer-lo millor.
Els processos de clonació són els que han tingut més impacte i han permès més innovacions en aquest camp, gràcies al que coneixem del DNA podem arribar a fer l’enginyeria genètica (conèixer mutacions, recombinacions...) Així podem purificar el DNA, modificar-lo...Utilitzem enzims de restricció i la DNA lligasa per fer vectors de clonació.
ENZIMS DE RESTRICCIÓ Són els enzims que ens permeten tallar el DNA, n’hi ha diversos. Normalment provenen de microorganismes (EcoR1-E-Coli).
No tots els enzims tallen igual, cadascun talla en una diana concreta, reconeixen seqüències concretes al genoma i les tallen, de manera que hi ha dos tipus d’enzims: -Alta freqüència de tall (reconeixen freqüències que es repeteixen molt freqüentment) -Baixa freqüència de tall Segons el tall: -N’hi ha que tallen verticalment -N’hi ha tallen una hebra del DNA i la complementària la tallen uns quants nucleòtids més enllà.
(IMPORTANT: Reconèixer els noms dels enzims per tal de saber la seva diana de restricció en el vector) DNA LLIGASES Permeten unir seqüències de DNA, encara que siguin fragments de DNA no propis del genoma.
VECTORS DE CLONACIÓ 7 Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana Són molècules DNA circular creades al laboratori. El vector ha de tenir una diana d’enzims de restricció per tal d’incorporar DNA forani i ha de continuar podent-se replicar.
Poden tenir una manera de distingir els bacteris que han incorporat el gen dels que no (resistència...).
Els vectors són plasmidis però també poden estar en un bacteriòfag.
Utilitat: -Permet introduir gens dins els bacteri.
-Permet aïllar i expressar gens per obtenir proteïnes útils (insulina, interferó, hormones)...en bacteris i llevats.
-Per preparar grans quantitats d’antígens purificats per a fer una vacuna.
Vector de clonació tipus bacterià El bacteriòfag té un espai reduït, per tant s’ha de tallar un tros no essencial del genoma i s’incorpora el DNA forani.
Procés de clonació 1.Digestió del DNA a clonar amb enzims de restricció Hem de conèixer la seqüència que ens interessa. Hem d’utilitzar enzims de restricció que flanquegin aquest gen (que no el tallin pel mig, que l’abarquin tot).
També s’ha d’utilitzar un enzim que permeti la complementarietat de bases amb el vector (normalment s’utilitza el mateix enzim).
2.Digestió del vector Tallem el vector amb el mateix enzim de restricció.
3.Lligació Posem junts el DNA a transferir i el plasmidi tallat juntament amb lligases. Els extrems seran complementaris i gracies a la lligasa es mantindran units 4.Transformació La transformació es pot afavorir, es pot augmentar la capacitat de les cèl·lules per fer la transformació: -Posar-les en una suspensió de calci i en un gel.
-Per electrotransformació: en el gel es donen impulsos elèctrics Els processos de transformació són molt poc eficients.
5.Selecció de recombinants Es seleccionen les bactèries que incorporen el gen que ens interessa.
Com es recuperen les bactèries que s’han transformat (han incorporat el vector amb el DNA que ens interessava i altres que han incorporat el vector sense el gen que s’ha recircularitzat)? Es fa aprofitant que molts vectors porten resistència. Tots els bacteris que han incorporat el vector tenen resistència a un antibiòtic, per tant si es cultiven en un medi amb antibiòtic creixeran. Tot i això no sabem si han incorporat el DNA o no.
Les bactèries que han incorporat el DNA forani s’anomenaran recombinants.
Per tal de distingit les bactèries recombinants de les que han adquirit el vector sense el gen: en aquest cas utilitzem dos gens de resistències. Tenim vectors am gens amb resistència a la tetraciclina i l’ampicil·lina. Llavors l’enzim 8 Temes 15, 16, 17, 18 i 19: Genètica bacteriana que introdueix el gen talla nomes la tetraciclina, de manera que les bactèries que hagin incorporat el gen no tindran resistència a la tetraciclina, nomes tindran la resistència a l’amfapicina.
Llavors per recuperar les cèl·lules recombinants cultivem la mostra en un medi amb Amfapicina (totes són resistents, per tant, totes creixeran). A continuació fem dues rèpliques a partir d’un motlle de vellut, en un medi de cultiu hi posem Amfapicina i no tetraciclina (creixeran totes les colònies) i en un altre hi posem Amfapicina i Tetraciclina (creixeran les que no tinguin el gen, perquè tindran una dobles resistència). De manera que la resta entre les que han crescut a la primera placa i les que no seran les bactèries recombinants.
Existeix una normativa de Bioseguretat, tant pels OMG com pels organismes no modificats. Es fa una classificació de microorganismes segons la seva perillositat. Es classifiquen en grups de risc de l’1 (el menys perillós) i el 4 (el més greu, patògen, que es propaga més ràpid, no es coneix el tractament....) En funció del grau de risc es segueix un nivell de contenció biològica.
9 ...