Tema 10 Proteómica clínica (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 10
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 10 Proteómica clínica Interés de la proteómica clínica La proteómica clínica engloba las estrategias analíticas que permiten la identificación de biomarcadores así como las herramientas proteómicas aplicables al diagnóstico y al pronóstico de patologías. De hecho, las estrategias empleadas en proteómica vistas hasta ahora pueden ser aplicadas a las muestras clínicas, pasando a ser consideradas proteómica clínica.
Un BIOMARCADOR en un compuesto usado como indicador de un estado biológico. La característica principal de un biomacador es que se trata de una sustancia objetivamente medible, además de indicar la presencia o no de procesos patogénicos. Cuando se trata de una proteína, estamos hablando de un biomarcador proteico. En la siguiente lista podemos ver distintos ejemplos de biomarcadores, como por ejemplo la ferritina, una proteína que indica el estado nutricional de hierro. La proteína C reactiva, otro ejemplo de biomarcador proteico sirve para evaluar si hay inflamación.
El principal problema a la hora de aplicar biomarcadores en el diagnóstico de patologías es que es complicado encontrar el rango en el que dicho marcador debe encontrarse en el organismo. Es decir, podemos encontrar una gran variabilidad en los niveles en los que se encuentran los biomarcadores  cada compuesto puede encontrarse en un gran rango de concentración y es complicado adoptar unos valores estándar que se adecúen a todos los pacientes.
Es necesario destacas los conceptos de sensibilidad y especificidad de un biomarcador: La especificidad hace referencia al % de personas sanas en las que se obtiene resultado negativo (sanos).
La sensibilidad es el % d enfermos que, tras la realización de las pruebas, dan positivo (es decir, son considerados enfermos).
 El biomarcador ideal tiene un 100% de especificidad y de sensibilidad, pero encontrar un marcador que cumpla estas características es una tarea muy complicada.
1 Proteómica clínica Por ejemplo, PSA es el antígeno específico de la próstata que se utiliza como biomarcador en caso de sospecha de cáncer de próstata (se evalúan los niveles de PSA en la orina).
Cuando se encuentra un biomarcador es necesario establecer a partir de qué concentración se considera que el paciente está dentro del grupo de los sanos o de los enfermos. El umbral de concentración de PSA a partir de la cual se considera enfermo al individuo es 4.0g/mL. Si comenzamos a emplear valores más altos como punto de corte, aumenta el valor falsos negativos y disminuye la proporción de falsos positivos. Tomando como valor umbral 4.0 g/ml, se nos están escapando pacientes enfermos que son considerados sanos en función de su concentración de PSA en orina.
Para llegar a ser un buen biomarcador, el parámetro debe superar una serie de fases. Lo normal a la hora de buscar un biomarcador es comenzar a realizar estudios con pocas muestras. Se hacen ensayos proteómicos con muestras de casos y controles para ver qué proteínas se expresan diferencialmente. Una vez se han descubierto posibles biomarcadores, es necesario que éstos sean testados en una muestra mayor de individuos (tanto controles como casos) para analizar qué variabilidad presenta el posible biomarcador. Cada vez se irá ampliando más el tamaño muestral (desde el reducido número de muestras con el que contábamos al inicio). Después, se elabora un gráfico como el que hemos visto de la PSA para deducir cuál debe ser el umbral a partir del cual los pacientes deben considerarse como enfermos.
Se pueden utilizar los diferentes aparatos y técnicas proteómicas que hemos ido estudiando para identificar y cuantificar las proteínas de las muestras biológicas. Estas aproximaciones nos podrán servir también para verificación y para restricciones de muestras, es decir, la proteómica se puede usar en todas las fases del desarrollo de un marcador.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Biomarcadores en plasma En el plasma podemos encontrar una gran variedad de compuestos, ya que recoge contenido de todos los tejidos. Además, es fácilmente accesible: la extracción de sangre es una de las más sencillas y poco molesta para el paciente.
El análisis de proteínas del plasma se lleva a cabo desde hace muchos años y resulta muy informativo.
Hace ya muchos años se describió que en una electroforesis, la sangre se separaba en varias bandas, la más gruesa correspondiente a la albúmina (la proteína plasmática más abundante). Las proteínas del resto de bandas que resultaban de la electroforesis fueron denominadas globulinas, y separadas en alfaglobulinas, beta-globulinas y gamma-globulinas (en la banda gamma de la electroforesis destacan las inmunoglobulinas). En la banda alfa también aparece por ejemplo la alfa-1 antitripsina.
El descubrimiento de este patrón de bandas resultó muy útil ya que se ha comprobado que alteraciones en el patrón de estas proteínas indican alguna patología. Por ejemplo, el aumento de la franja gamma en la que se localizan los anticuerpos se observa en muchas leucemias linfocíticas.
Debido a esto, hoy en día los hospitales cuentan con aparatos de electroforesis capilar, que permiten realizar muchas electroforesis de manera rápida y sencilla para comprobar si hay alteraciones en el patrón de separación.
SELDI-TOF Fue la primera aproximación para realizar este tipo de análisis del plasma de manera rápida. Se trata de un MALDI-TOF modificado: al igual que en un MALDI-TOF tenemos una ionización de láser llevada a cabo gracias a una matriz y un analizador de masas con la diferencia de que la placa de MALDI que incorpora este aparato tiene cierta selectividad hacia un grupo concreto de proteínas. Mientras que la placa de MALDI habitual es simplemente de acero inoxidable, la placa del sistema SELDI puede tener carga positiva, carga negativa, etc. La idea es que al cargar la muestra de sérum sobre la superficie, las proteínas que tengan afinidad por la superficie se quedan enganchadas a esta - se realiza un lavado para deshacernos de aquellas proteínas que no hayan quedado enganchadas.
Después, se añade la matriz sobre la superficie y se lleva a cabo la ionización y el posterior análisis por espectrometría de masas. Se obtiene un espectro de masas de unas pocas proteínas, no de todo el proteoma plasmático.
3 Proteómica clínica Este sistema permite analizar muchas muestras de forma sencilla, facilitando por ejemplo, la comparación entre muestras de pacientes con espectros de masas control  aquellos picos que sean distintos serán biomarcadores de enfermedad.
A continuación se muestra un artículo del primer caso de éxito de esta tecnología. Habla de utilizar patrones proteómicos en sérum para el diagnóstico del cáncer de ovario. Hicieron la prueba con mujeres no afectadas y con mujeres enfermas en diferentes estadios  analizaron sus patrones proteómicos y los clasificaron (afectados, no afectados y new cluster). Vieron que podían diagnosticar este tipo de cáncer con una especificidad y una sensibilidad bastante buenas. Dentro de la comunidad supuso un artículo de referencia hasta el punto en que la mayoría de hospitales que han podido permitírselo han adquirido un SELDI-TOF con el que realizan los análisis de manera rápida.
Dos años más tarde se publicó otro artículo en Nature que pone en duda la efectividad de esta máquina.
Hoy en día casi nadie trabaja con esta máquina.
En el siguiente ejemplo vemos otro estudio en que analizaron el perfil de los péptidos del plasma con el objetivo de poder diagnosticar cáncer. Este trabajo también presenta fallos en la práctica.
Partían de la idea de que en los procesos cancerígenos y metastásicos, los tumores tienen que abrirse camino a través de los tejidos, para lo que suelen liberar proteasas algunas de las cuales son específicas 4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV de cáncer. Gracias a esta especificidad, después del corte podemos obtener péptidos específicos para cada tipo de cáncer. Además, los investigadores tenían la creencia de que estos péptidos resultantes de la digestión por proteasas salían al torrente circulatorio y que por tanto, podían ser detectados en sangre  es decir, podrían ser biomarcadores (específicos de cada tipo de cáncer).
En este estudio contaban con 40 controles y 40 afectados con cáncer de tiroides (training set) y también otro grupo de validación.
Realizaron un análisis del proteoma centrándose en los pequeños péptidos, ya que buscaban restos de la digestión por proteasas específicas de cáncer de tiroides. Llegaron a encontrar 598 péptidos con los que hicieron un análisis multivarianza (PSA) para simplificar las variables (crearon el análisis de componentes principales y convirtieron todas las variables que tenían -60- en 3 0 4 a las que llamaron componentes principales).
Una vez simplificadas las variables, hicieron un gráfico en el que vieron los diferentes patrones (en rojo los controles y en azul los enfermos).
 Se redujo el número de péptidos a 17. Empleando los 17 obtendremos muy buena especificidad pero nos falla un poco la sensibilidad, que llega al óptimo empleando 12 péptidos.
La dificultad es que este estudio está llevado a cabo en un aparato concreto pero es necesario que los resultados sean extrapolables a todos los centros para que este método pueda servir para diagnóstico.
Este tipo de técnicas sirven para la fase de descubrimiento: se organizan las muestras y se encuentran marcadores potenciales que necesitan pasar por un proceso de verificación.
5 Proteómica clínica Transicionalmente, se habían seguido estrategias basadas en ELISA, que son más caras y requieren mucho tiempo de trabajo.
Se planteó si la proteómica dirigida podía ayudar a seguir estos pasos de forma más dirigida. Esto nos permitiría emplear espectrómetros de masas que no tienen tanta resolución pero son más robustos y sensibles. En el siguiente artículo se puso a prueba se definiendo un péptido proteotípico para cada proteína de interés clínico del plasma y estableciendo los parámetros necesarios para su detección.
Los resultados fueron bastante satisfactorios: con protocolos comunes e instrumentos estandarizados se consiguen resultados muy reproducibles. El artículo también plantea si el paso de descubrimiento de marcadores mediante la proteómica dirigida se lleva hasta la clínica.
Ellos afirmaron que la mejor opción era la proteómica dirigida acorta el tiempo y reduce el presupuesto además de permitir analizar simultáneamente múltiples analitos en la misma muestra.
Es un sistema automatizable.
Por muy buenos que hayan sido los resultados de los estudios de proteómica dirigida, de momento no se plantea aplicarla a la clínica.
A continuación tenemos un ejemplo de validación de biomarcadores. Encontraron dos proteínas aumentadas en el sérum de mujeres embarazadas que estaban esperando niños con síndrome de Down.
En el ensayo se intentan validar estas dos proteínas como marcadores de la enfermedad.
Para cada proteína se buscó un péptido proteotípico que iba a ser analizado a una relación masa/carga concreta. Sí que se encontraron que los niveles de las proteínas eran diferentes en ambas condiciones (Down - control) sobre todo en una de las dos proteínas.
Para descubrir un biomarcador nos sirven las técnicas clásicas pero a la hora de validarlos necesitamos otro tipo de ayudas.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV MALDI imaging Esta técnica consiste en coger un corte de un tejido y recubrirlo con matriz de MALDI. Después, se dispara un láser contra distintas zonas del tejido (el láser ionizará la matriz y automáticamente se ionizarán las proteínas del tejido) y adquirimos de cada uno de estos puntos el espectro de masas. Un software define y encuentra las relaciones masa/carga concretas presentes en cada zona del tejido y obtiene una coloración virtual de tejido en función de las relaciones encontradas - cada relación masa/carga se colorea de un color. Así, podemos ver como a lo largo del tejido se distribuye una determinada relación masa/carga.
La resolución no es demasiado buena: la resolución del disparo del láser es de 10µm, que está bien para analizar tejidos pero ya no para analizar la organización subcelular.
En la siguiente imagen podemos ver un esquema del flujo de trabajo (Workflow) a seguir.
El código de colores obtenido representa la intensidad de la señal.
Se empleó este sistema para conocer la distribución de unas proteínas determinadas.
Por ejemplo, se ha usado para detectar insulina en el páncreas (se localizan los Islotes de Langerhans).
7 Proteómica clínica También permita distinguir tejidos como podemos ver en la siguiente imagen.
Donde más expectativas ha generado esta técnica es en el terreno de la oncología, donde se puede usar para intentar definir la presencia o distribución de células potencialmente cancerígenas en los tejidos.
Se cree que esta técnica podría aportar un extra a la detección con anticuerpos que se hace actualmente ya que MALDI Imaging permite definir la presencia de algunas relaciones masa/carga características de algunos tumores o estadios.
Probablemente esta técnica es menos subjetiva ya que se obtienen más datos de intensidad de señal.
La principal desventaja de esta técnica es que resulta más cara. Además, aún falta realizar todo el trabajo previo necesario antes de su utilización, es decir, no se conocen las relaciones masa/carga características de los tumores.
Identificación de las proteínas a partir del espectro de masas Una vez tenemos el espectro de masas de cada región del tejido, es necesario identificar a qué proteína corresponde cada pico. Para ello se han desarrollado estrategias tanto top-down como bottom-up.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Dentro de las estrategias Bottom-up tenemos la digestión in situ.
Como aproximación Top-Down destaca la fragmentación dentro del espectrómetro sin digestión previa. La idea es simple: se coge la masa que nos interesa, se aísla y se fragmenta. Aparecen una serie de iones de los cuales queremos definir su secuencia.
Generalmente, la mayoría de los péptidos están por debajo de los 4000Da (los de mayor tamaño son una minoría). El mayor éxito de identificación se consigue cuando nos encontramos ante relaciones masa/carga pequeñas.
En la gráfica vemos representados en negro los péptidos que se han identificado de cada proteína. En general se identifican péptidos de los extremos.
Acostumbran a ser fragmentos proteolíticos de proteínas más grandes ya que en el proceso de extracción del tejido, etc. es posible que las proteínas sufran proteólisis.
9 Proteómica clínica MALDI Imaging no solo sirve para proteínas sino que también se usa para metabolitos y moléculas más pequeñas (en este campo, los estudios están más avanzados). En la siguiente imagen vemos un estudio en el que se analizaba la distribución de diferentes neurotransmisores en el sistema nervioso central en distintas condiciones.
MALDI-Imaging también genera interés desde el punto de vista de la distribución de fármacos.
Identificación y clasificación de microorganismos - MALDI Biotyper El MALDI Biotyper sirve para identificar microorganismos. Es probablemente la única de las técnicas de este tipo que están funcionando y es operativa.
Tenemos un microorganismo aislado en una placa. Se coge una colonia del microorganismo y se disuelve con disolventes. Después, la colocamos sobre una placa de MALDI (con matriz de MALDI) y disparamos el láser. Obtenemos el espectro de masas del aislamiento, que será característico de cada microorganismo.
El problema es que para identificar a qué microorganismo corresponde el espectro hay que comprar con una base de datos y que la única desarrollada es privada.
Por lo demás, la técnica funciona muy bien y no requiere un espectrómetro demasiado potente.
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