bioquimica ultim parcial (DNA) (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Veterinaria - 1º curso
Asignatura bioquímica
Año del apunte 2014
Páginas 70
Fecha de subida 12/11/2014
Descargas 32
Subido por

Vista previa del texto

INTRODUCCIÓ ALS ÀCIDS NUCLEICS LLEIS DE L’HERÈNCIA Mendel va establir les lleis  de  l’herència  a  partir  del  creuament  de  línies  pures  de  pesoleres  diferents.
Va establir que: - Els pares transmeten factors discrets (gens) a la descendència - Cada individu hereta dos factors que codifiquen pel mateix tret o per dos trets alternatius del mateix caràcter (al·lels) - No tots els al·lels són idèntics (homozigots, heterozigots) - La  presència  d’un  al·lel  no  assegura  que  el  tret  que  codifica  es  manifesti  (dominants  i  recessius) Els  al·lels  són  les  diferents  variants  d’un  mateix  gen.  Un  individu  pot  ser  homozigot,  si  té  els  dos  al·lels   iguals, o heterozigot, si els té diferents.
Un gen és un fragment de DNA que codifica per una cadena polipeptídica (proteïna) o per un RNA.
ÀCIDS NUCLEICS El DNA és un polímer de nucleòtids. Un nucleòtid és una pentosa (ribosa o desoxiribosa) unida a un fosfat  pel  C5’  i  a  una  base  orgànica  pel  C1’.
Existeixen 5 bases orgàniques diferents: Adenina, Guanina, Timina, Uracil i Citosina. Aquestes bases pertanyen a dos tipus diferents: purina i pirimidina.
El  DNA  està  format  per  A,  C,  G  i  T.  L’RNA  té  U  en  comptes  de  T.
Cada  nucleòtid  està  unit  a  l’altre  mitjançant  enllaços  fosfodiéster  (units  pel  fosfat).
ESTRUCTURA DEL DNA Cada molècula de DNA està formada per dues cadenes enrotllades en forma de doble hèlix. Les bases de  cada  cadena  s’aparellen  per  complementarietat,  formant  ponts  d’hidrogen  que  les  mantenen  unides:   G=C  (2  ponts  d’H)  i  T-A  (1  pont  d’H).
El DNA és la molècula que conté el material genètic en les cèl·lules eucariotes. Es troba en el nucli i és una molècula lineal (cada cromosoma està format per una única fibra lineal de DNA). En canvi, en les cèl·lules procariotes, el DNA és una molècula circular.
Els virus poden tenir tant DNA com RNA com a material genètic.
El   conjunt   de   DNA   d’un   organisme   s’anomena   GENOMA.   El   conjunt   de   proteïnes   d’una   cèl·lula   determinada  s’anomena  PROTEOMA.
No totes les cèl·lules expressen totes les proteïnes ni les mateixes. Algunes proteïnes només s’expressen  en  fases  determinades  de  la  vida  de  la  cèl·lula.
EL DNA FORMA COMPLEXES AMB PROTEÏNES El DNA està complexat amb proteïnes, està compactat, per tal de poder-lo contenir dins el nucli. Aquest complex DNA-proteïnes és el que es coneix com CROMATINA. Hi ha dos tipus de cromatina: - Eucromatina  correspon   als   gens   que   més   s’expressen   en   la   cèl·lula   i   que,   per   tant,   estan   menys compactats (color més clar), el que facilita la seva transcripció - Heterocromatina  es troba més compactada (color més fosc) i correspon als gens que no s’expressen  (o   s’expressen   poc)  en   la   cèl·lula.   Hi   ha  dos   tipus  d’heterocromatina:   constitutiva,   que correspon a zones repetitives del DNA sense informació genètica, i facultativa, que correspon a zones del DNA que porten informació  genètica  que  no  s’expressa  normalment.
Les modificacions covalents (acetilacions, fosforilacions...) canvien el grau de compactament de la cromatina. És a dir, existeixen diferents graus de compactació de la cromatina.
Els cromosomes corresponen a DNA compactat  amb  proteïnes.  Cada  cromosoma  (d’una  cromàtide)  és   una única fibra de DNA compactada. Els telòmers són els extrems dels cromosomes i estan formats per seqüències repetitives de DNA.
Un cromosoma metafàsic està format per dues cromàtides, ja que  el  DNA  s’ha  replicat  prèviament.   REPLICACIÓ DEL DNA La replicació del DNA és una replicació semi-conservativa: la nova molècula de DNA posseeix una cadena de nova formació i una motlle (conservada de la molècula mare).
La replicació es dóna per aparellament de les bases nitrogenades.
Els enzims que repliquen el DNA es troben en uns complexos multi-enzimàtics: les DNA-polimerases.
Aquests enzims poden cometre errors durant la síntesi de la nova cadena, per aquesta raó, també hi ha uns enzims que reconeixen aquests errors i els corregeixen.
El cicle cel·lular té varies fases. En la fase S es dóna la replicació del DNA.
La cèl·lula té checkpoints, on atura o retarda el cicle cel·lular per revisar si el seu DNA conté errors per poder-los  reparar  (el  cicle  es  para  fins  que  es  repara  l’error).  Aquests  checkpoints depenen de quinases.
Un error en les quinases pot produir cèl·lules tumorals.
Si la cèl·lula no pot reparar el DNA, entra en apoptosi.
TRANSCRIPCIÓ (SÍNTESI D’RNA) El procés de transcripció consisteix en sintetitzar una cadena de RNAm a partir del DNA. Aquest procés és diferent en eucariotes i en procariotes.
L’enzim   que   s’encarrega   de   transcriure   l’RNAm   és   la   RNA-polimerasa. Aquest enzim copia una cola cadena   del   DNA   (la   regió   d’un   gen   que   codifica   per   una   proteïna).   La   RNA-polimerasa és capaç de reconèixer on comença i on acaba un gen. La síntesi de RNAm es dóna per complementarietat de bases, substituint la T per U (uracil).
En   eucariotes,   com   que   existeix   una   separació   entre  nucli   i   citosol,   l’RNAm   ha   de  sortir   fóra   el   nucli   i   processar-se  (s’ha  de  modificar  per  poder  sortir  del  nucli).
PROMOTORS La RNA-polimerasa reconeix regions que es troben davant del gen: són les regions promotores. Es tracta  de  seqüències  determinades  que  indiquen  l’inici  o  la  finalització  del  gen  i,  per  tant,  de  la  síntesi   proteica i de RNAm.
En eucariotes, el procés de transcripció és molt complex.
EXONS I INTRONS En procariotes, la informació genètica és continua.
En eucariotes, hi ha regions que codifiquen per proteïnes (exons) i regions no codificants (introns), que solen ser majors als exons. És a dir, els gens estan interromputs, la informació no és continua.
Durant la transcripció es dóna el procés de splicing,   que   consisteix   en   l’eliminació   dels   introns   del   RNAm.  Un  cop  s’han  eliminat  els  introns  es  considera  que  l’RNAm  està  madur.
Durant la transcripció es produeix la hibridació dels àcids nucleics: una cadena del DNA hibrida amb l’RNA  (d’una  sola  cadena).
La major part del DNA és no codificant: els gens només representen un 30% del DNA i els exons (regions   codificants)   un   1’5%.   És a dir, la major part dels gens estan formats per introns. Els exons corresponen a dominis o plegaments estables de proteïnes.
Com que els introns són majors als exons, hi ha una major probabilitat de que es produeixi un tall accidental pels introns que no pas pels exons, el que generaria una proteïna no estable.
Existeixen mutacions en les regions promotores i en els introns, no només en les regions codificants del DNA. Les mutacions en els introns no solen produir canvis de proteïna, ja que no codifiquen, però existeixen mutacions que canvien els extrems dels introns, amb la qual cosa no poden ser reconeguts per  tal  d’eliminar-los del RNAm madur.
Els introns són, per tant, seqüències de DNA poc conservades, ja que no hi ha una pressió evolutiva sobre elles (perquè no codifiquen per proteïnes). El que es conserva és la posició en què es troben aquests introns (que són les mateixes per les diferents espècies, però les seqüències seran molt diferents).
CODI GENÈTIC El codi genètic associa un aminoàcid determinat a cada triplet o codó de nucleòtids del RNAm.
El   codi   genètic   és   degenerat,   ja   que   més   d’un   codó   codifica   pel   mateix   aminoàcid (64 codons per 20 aminoàcids), però no és ambigu, ja que cada codó dóna un aminoàcid determinat (cada codó codifica per un aminoàcid).
Hi ha 3 codons STOP, que indiquen la finalització de la síntesi de RNAm i proteïna: UAA, UAG i UGA. I només  un  codó  d’iniciació:  AUG.
Els nucleòtids es llegeixen de 3 en 3, no hi ha solapaments. És a dir, cada codó és independent.
El codi genètic és universal, és el mateix per tots els organismes vius.
MARC DE LECTURA Una  mateixa  seqüència  d’aminoàcids  es  pot  llegir  de  3  maneres  diferents  (3  marcs  de  lectura  o  reading frames),  i  cadascuna  donarà  seqüències  d’aminoàcids  diferents,  el  que  generarà proteïnes diferents (si el  marc  de  lectura  d’un  mateix  RNA  és  diferent,  es  sintetitzarà  una  altra  proteïna). En el ribosoma, per tant,  s’ha  de  reconèixer  i  localitzar  el  marc  de  lectura  inicial  corresponent  per  sintetitzar  correctament  la   proteïna.
El primer codó estableix el marc de lectura. El ribosoma ha de trobar aquest primer triplet, que no sempre  es  troba  a  l’inici  del  RNAm,  per  establir  el  marc  de  lectura  correcte. Només un marc de lectura codifica per una proteïna o per un RNA: marc de lectura obert (Open reading frame).
Es  poden  produir  mutacions  que  generen  canvis  en  els  codons:  es  produeix  un  canvi  d’aminoàcids  o   d’un  codó  STOP,  que  provoca  l’acabament  prematur  de  la  proteïna  i,  per  tant,  la  invalida.  Si  la  mutació   es produeix en un aminoàcid que es troba en el centre actiu, aquesta proteïna pot deixar de ser funcional.
També existeixen canvis conservatius que no afecten la funcionalitat de la proteïna, com per exemple el canvi  d’aminoàcids  de  la  mateixa  natura.
Les mutacions en els promotors  provoquen  que  l’RNAm  no  es  pugui  unir  als  ribosomes  i,  per  tant,  que   no es sintetitzi la proteïna.
RNA policistrònic Un   RNA   policistrònic   és   un   RNA   que   codifica   per   més   d’una   proteïna   a   partir   d’un   mateix   RNA.   Existeixen en procariotes (bacteris).
UTR = Untranslated Regions  regions que no transcriuen SÍNTESI DE PROTEÏNES: TRADUCCIÓ Els RNAt actuen com a molècules adaptadores durant la síntesi de proteïnes. La unió dels aminoàcids als RNAt és catalitzada per les aminoacil-tRNA sintetases, que interpreten el codi genètic (asseguren que cada  RNAt  tingui  l’aminoàcid  corresponent  unit) i són capaces de corregir errors. Generalment hi ha una aminoacil-tRNA sintetasa per aminoàcid.
CICLE RIBOSOMAL En un primer moment, les subunitats del ribosoma es troben separades.
La iniciació de la traducció és el pas regulat, ja que es tracta del pas més complicat de la síntesi. Es forma  un  complex  d’iniciació  sobre  la  subunitat  petita  del  ribosoma.  El  missatger  s’uneix  a  la  subunitat   petita. Llavors  entre  el  primer  RNAt  (el  de  la  Met)  i  s’uneix  a  la  subunitat  gran.  Quan  entra  el  segon   RNAt,  es  trenca  l’enllaç  entre  el  primer  aminoàcid  i  el  primer  RNAt  i  es  forma  l’enllaç  entre  el  primer   aminoàcid  i  el  segon:  l’enllaç  peptídic.
El ribosoma es mou al llarg del missatger i va sintetitzant la proteïna fins que arriba al codó STOP.
ESTRUCTURA DEL DNA I DELS CROMOSOMES DNA COM A MOLÈCULA DE L’HERÈNCIA En  un  principi  es  pensava  que  les  proteïnes  eren  les  molècules  portadores  de  l’herència.  Es  van  realitzar 2 experiments per determinar que el  DNA  era  la  molècula  de  l’herència.
 Primer experiment: Griffith (1928) – Avery/ MacLeod/ McCarty (1944) Aquest experiment es va realitzar utilitzant pneumococs, bacteris virulents. Es va determinar que existia una soca de bacteris no virulents, que quan eren inserits en un ratolí, aquest sobrevivia.
Aquesta no-virulència era causada per una mutació dels bacteris que els feia perdre la seva càpsula, el que els feia dèbils davant el sistema immunitari del ratolí.
També es va observar que si es sotmetia a estrès tèrmica (escalfor) els bacteris normals (no mutats, amb càpsula), aquests perdien la seva virulència.
Al 1928 es va observar que si es barrejava bacteris encapsulats morts i bacteris vius però no encapsulats   (no  virulents)   i   s’injectaven   en   un   ratolí,   aquest   moria.   Es   va   determinar,   doncs,   que   existia un factor que podia passar dels bacteris morts als vius i que els feia ser virulents.
Al 1944 es va extreure DNA dels bacteris virulents i es va barrejar amb el dels bacteris no virulents.
Aquest   DNA   estava   tractat   amb   proteases,   per   tal   d’assegurar   que   no   hi   hagués   proteïnes   que   poguessin afectar el resultat. Quan   s’injectava  els   bacteris   no   virulents  (amb   DNA   virulent)   en   un   ratolí, aquest moria. Es va determinar, així, que els bacteris no virulents agafen el DNA dels bacteris virulents morts, el que els transforma en virulents.
 El mateix experiment es va realitzar amb DNA tractat amb DNAases i no es va observar cap resultat,  el  que  determinava  que  el  DNA  era  la  molècula  que  transportava  l’herència.
Segon experiment: Hershey & Chase (1952) Aquest experiment es va realitzar amb virus  de  bacteris  (FAGS)  i  marcatge  d’isòtops  radioactius.  Es   van realitzar dos cultius. En un primer cultiu, es va marcar radioactivament només el DNA, i en l’altre,  només  es  van  marcar  les  proteïnes.  En  el  cultiu  de  bacteris  es  van  afegir  FAGS,  i  es  van  fer servir per infectar un nou cultiu no marcat. Quan es van centrifugar els cultius, es va observar on quedava la radioactivitat, si en el precipitat de bacteris o en el sobrenedant de FAGS.
En el cultiu marcat amb P-32, es va observar que la radioactivitat quedava en el precipitat de bacteris.  D’aquesta  manera,  es  va  determinar  que  els  FAGS  injectaven  el  seu  DNA  als  bacteris.  En   canvi, en el cultiu marcat amb S-35, la radioactivitat quedava en el sobrenedant de FAGS, amb el que es va determinar que les proteïnes dels FAGS no eren injectades dines els bacteris.
ESTRUCTURA DEL DNA Al 1940, Chargaff es va dedicar a estudiar la composició de bases del DNA de diferents espècies. Els seus  experiments  són  anteriors  al  descobriment  de  l’estructura  del  DNA.   Va determinar  que  la  composició  de  bases  del  DNA  d’una  mateixa  espècie  es  manté  constant,  no  varia  ni   amb  l’edat  ni  amb  les  condicions  fisiològiques.  També,  va  arribar  a  la  conclusió  que  el  DNA  de  diferents   teixits  d’una  mateixa  espècie  té  la  mateixa  composició. És a dir, totes les cèl·lules tenen el mateix DNA.
En tots els DNA es compleix que la quantitat de bases complementaries és la mateixa i que la quantitat de bases puríniques és igual a la de bases pirimidíniques.
Els àcids nucleics tenen polaritat estructural: posseeixen  un  extrem  5’  lliure  i  un  extrem  3’  lliure.  El  DNA   es  llegeix  en  direcció  5’  a  3’.
El   mètode   utilitzat   per   descobrir   l’estructura   del   DNA   va   ser   la   difracció   de   rajos   X.   Gràcies   a   aquest   mètode, es va descobrir que la molècula de DNA està formada per dues cadenes enroscades en forma de doble hèlix. Les  diferents  bases  queden  per  dins  de  l’hèlix,  perpendiculars  al  seu  eix  i  unides  entre   elles  (les  complementaries)  per  ponts  d’hidrogen. La doble hèlix fa 20𝐴̇ de  diàmetre  i  hi  ha  entre  10  i  10’5   parells  de  bases  per  volta  d’hèlix.  La  distància  entre  bases  és  de  3’4𝐴̇ i  la  distància  de  la  volta  d’hèlix  és   d’entre   34   i   36𝐴̇. Es   tracta   d’una   hèlix   dextrogira en   la   que   una   de   les   cares   de   l’hèlix   queda   més   exposada  que  l’altra.  D’aquesta  manera  es  distingeixen  dos  solcs:  un  solc  major  que  correspon  a  la  regió   de les bases que queda exposada i que és reconeguda per diferents proteïnes, i un solc menor.
Les bases del DNA poden tenir formes (isòmers) interconvertibles: cetònica i enòlica. La forma cetònica és la més estable, té una vida mitja més llarga. La major part del temps, les bases es troben en forma cetònica. Si   una   de   les   bases   s’incorpora   en   la   forma   isomèrica equivocada, llavors actuen els mecanismes de reparació de la DNA-polimerasa.
Les  cadenes  de  la  doble  hèlix  són  complementàries  i  antiparal·leles.  Entre  les  bases  A  i  T  s’estableixen   dos  ponts  d’H,  mentre  que  entre  les  bases  G  i  C  se  n’estableixen   3.  La  síntesi  de  DNA  s’inicia  en  llocs   rics   en   A   i   T,   ja   que   les   seves   cadenes   són   més   fàcils   de   separar.   A   més,   s’estableixen   interaccions   hidrofòbiques entre les bases apilades que estabilitzen la doble hèlix.
EL SOLC MAJOR ÉS RIC EN INFORMACIÓ En la regió del solc major del DNA queden exposats 4 grups funcionals de les bases. Certes proteïnes són   capaces   de   reconèixer   seqüències   de   bases   que   es   troben   en   el   solc   major   per   tal   d’unir-se al DNA. Les proteïnes poden reconèixer la simetria entre bases, poden  diferenciar  una  base  de  l’altra  per   l’asimetria   del   solc   major.   És a dir, el reconeixement de certes proteïnes es realitza a través del la interacció amb el solc major.
A  =  acceptor  d’H  (ponts  d’H),  D  =  donador  de  ponts  d’H,  M  =  metil,  H  =  hidrogen El DNA pot adquirir diverses formes teòriques: La forma A no existeix in vivo,  sinó  que  és  artefacte  de  la  cristal·lització.  Es  tracta  d’un  RNA  de  doble   cadena. La forma B és la del DNA cel·lular: hèlix dextrogira. La forma Z és una hèlix levogira que es troba en regions on hi ha C i G alternades.
REPLICACIÓ DEL DNA La replicació del DNA és una replicació semi-conservativa: es conserva una de les cadenes motlle de la molècula anterior i es sintetitza una nova cadena complementaria a la motlle.
DESNATURALITZACIÓ DEL DNA Quan es sotmet una molècula de DNA a estrès tèrmic,  els  ponts  d’H  que  mantenen  unides  les  bases  es   trenquen i les cadenes es poden separar. Però, si es torna a refredar, les cadenes es tornen a ajuntar. És a dir, el DNA es pot renaturalitzar.
Els nucleòtids absorbeixen més la llum quan estan separats que quan estan formant una cadena. I absorbeixen encara menys llum quan estan formant una doble hèlix. L’efecte  hipercrònic  és  l’increment de  l’absorbància  del  DNA  degut  a  la  desnaturalització  de  la  molècula.
En la temperatura de fusió (tm) el 50% del DNA està desnaturalitzat.
Cada molècula de DNA té una temperatura de fusió (tm) diferents, que depèn de la seva composició de bases: com més rica en G i C, més difícil de desnaturalitzar és la molècula i la seva tm és més elevada.
Per aquesta raó, el DNA es comença a replicar per llocs rics en A i T.
HIBRIDACIÓ DEL DNA Com més properes són dues espècies, més semblants són les seves seqüències de DNA i més híbrids es  formen.  D’aquesta  manera  es  pot  determinar  experimentalment  l’emparentament  de  les  espècies.
ORGANITZACIÓ DEL GENOMA En  els  procariotes,  els  gens  i  les  proteïnes  són  col·lineals.  Els  gens  i  cromosomes  d’eucariotes  són  molt complexos. Estan formats per exons, part del gen que codifica per proteïnes, i introns, regions que no codifiquen per proteïnes. Només les mutacions als exons afecten la seqüència de la proteïna. Les seqüències dels exons estan molt conservades, però les dels introns són més variades. En gens homòlegs, les posicions dels introns estan conservades. Molts exons codifiquen regions de proteïnes amb funcions determinades.
SÚPERENRROTLLAMENT DEL DNA El DNA és una molècula molt llarga i, per encabir-la dins el nucli,  s’enrotlla  i  s’uneix  a  proteïnes.  Per  tal   que   la   molècula   de   DNA   s’enrotlli   se   li   ha   d’introduir   una   tensió.   Aquesta   es   produeix   gràcies   a   les   topoisomerases I i II.
 Topoisomerasa I  La   molècula   de   DNA   ha   de   ser  circular:   ha   d’estar   fixada   pels   dos   extrems. La topoisomerasa I talla una de les cadenes, la desenrosca una volta i la torna a fixar. A mida que es repeteix aquest procés,  el  DNA  s’enrosca  cada  cop  més.
Topoisomerasa II La topoisomerasa II talla les dues cadenes,  en  passa  una  pel  mig  de  l’altra i les torna a tancar.
Gràcies a aquest procés es produeixen dos súperenrrotllaments. En la cèl·lula es produeixen súperenrrotllaments negatius per tal de facilitar la separació de les cadenes. La topoisomerasa II talla les dues cadenes i introdueix 2 súperenrrotllaments negatius.
El DNA es pot plegar de dues formes: - Plectonèmica  plegament sense proteïnes - Solenoïdal  per dins el solenoide hi passen proteïnes que mantenen estable el plegament.
Aquest tipus de plegament no és estable en solució aquosa En la cèl·lula, el DNA està plegat en forma solenoïdal i acomplexat amb proteïnes (nucleosomes).
El  DNA  es  prepara  per  la  replicació  traient  voltes  d’hèlix,  el  que  genera  un  menor  cost  energètic  per  la   cèl·lula.
ESTRUCTURA DELS CROMOSOMES No tots els gens  que  es  troben  en  el  DNA  s’expressen.  Els  gens  que  no  s’expressen  solen  estar  en  un   major  grau  d’empaquetament  que  els  que  s’expressen  sovint  en  una  cèl·lula.
En les cèl·lules, sobretot en les eucariotes, el DNA es troba unit a proteïnes. Els nucleosomes són agregats de proteïnes envoltats per DNA.
Les  histones  són  proteïnes  de  pH  bàsic  que  s’uneixen  al  DNA  (de  pH  àcid).  Neutralitzen  els  grups  fosfat  i   ajuden  al  plegament  de  la  molècula  de  DNA.  La  partícula  “core”  del  DNA  (partícula  mínima)  està  formada   per 8 histones (4 histones diferents amb dues còpies cada una, formant un octàmer) i una molècula de DNA de 146 pb (parells de bases) unit fortament a les histones.
La longitud del DNA linker varia entre 8 i 114 pb.
TIPUS I PROPIETATS DE LES HISTONES Les  histones  són  proteïnes  bàsiques,  per  tal  d’estabilitzar  la  càrrega  negativa  del  DNA.
La H1 està unida al DNA linker, és a dir, no forma part del nucleosoma. És la histona més gran de totes. H3 i H4 són tetràmers i H2A i H2B són dímers.
Les   histones   són   proteïnes   molt   conservades   evolutivament,   amb   pocs   canvis   d’aminoàcids entre diferents espècies.
Les histones del nucleosoma tenen estructures molt semblants. Totes tenen una regió C-terminal en hèlix-𝛼 i unes cues N-terminal que sobresurten per fora del nucleosoma i li donen el pas de rosca necessari perquè el DNA es plegui.
Aquestes cues, a més, són susceptibles a patir modificacions covalents per alguns enzims, el que influeix   en   els   diferents   nivells   d’empaquetament   del  DNA:   les   acetilacions   de   les  cues   provoquen   la   relaxació  del  nucleosoma;;  les  fosforilacions  provoquen  un  major  grau  d’empaquetament  del  DNA.
En el nucleosoma, les histones H3 i H4 formen un disc per sobre i per sota del qual hi ha dos H2A i dos H2B.
Al  voltant  d’aquest  disc  s’hi  uneix  el  DNA.
La  H1  s’uneix  en  la  regió  del  DNA  linker  i  fa  que  el  DNA  encara  es  plegui  més,  fa  que  els  nucleosomes   quedin  més  compactats.  D’aquesta manera es forma la fibra de 30nm, en la qual hi ha 6 nucleosomes per  volta  d’hèlix.
La  fibra  de  30nm  representa  el  major  grau  d’empaquetament  del  DNA.
En   els   cromosomes,   hi   ha   escàfols   on   s’uneixen   les   fibres   de   30nm   per   tal   de  compactar-se encara més. La  fibra  de  30nm  s’enrotlla  al  voltant  de  l’escàfol  fent  loops  i  formant  rossetes  de  6  loops.
En  eucariotes,  el  DNA  té  diferents  graus  d’empaquetament,  que  no  es  mantenen  al  llar  de  la  cèl·lula  ni   del cicle cel·lular. El greu de compactació dependrà de  l’activitat  transcripcional  dels  gens  que  formin  la   molècula de DNA.
REPLICACIÓ DEL DNA REPLICACIÓ DEL DNA La  replicació  del  DNA  és  semiconservativa.  Aquest  fet  es  va  establir  gràcies  a  l’experiment  de  MeselsonStahl (1957). En aquest experiment es va centrifugar el DNA amb gradient de CsCl (clorur de cesi) per tal de separar les molècules en funció de la seva densitat, ja que tot el DNA té la mateixa densitat. Llavors, van deixar passar dos cicles de replicació i es va observar que en el segon cicle apareixia una banda de densitat intermèdia.
N15, isòtop pesant del N L’aparició  de  la  banda  de  densitat  intermèdia  implica  que  la  replicació  no  és  conservativa.   En el segon cicle de replicació del DNA, els resultats obtinguts   només   s’explicaven   si   la   replicació   era   semiconservativa.  Si  la  replicació  del  DNA  hagués  estat  dispersiva,  s’hauria  obtingut  en  tots  els  cicles  la   banda del DNA híbrid.
Les dues cadenes del DNA es repliquen simultàniament. La replicació comença sempre al mateix lloc: origen de replicació. En bacteris, el DNA comença a replicar-se  a  partir  d’un  únic  lloc  no  aleatori,  sinó  que   es   tracta   d’una   regió   que   es   troba  en   posició   fixa.   És  a   dir,   els   cromosomes   bacterians   tenen   un   únic   origen de replicació. En  eucariotes,  en  canvi,  hi  ha  més  d’un  origen  de  replicació  per  cromosoma.  Això  és   degut   a   què   el   DNA   d’eucariotes   és   una   molècula   molt   més   llarga,   i   si   només   tingués   un   origen   de   replicació, la seva replicació seria molt més lenta.
A   partir   de   l’origen   de replicació, les dues cadenes de la molècula es van separant i el DNA es va replicant.
El DNA té un origen central de replicació. La replicació és bidireccional i simultània. Hi ha dues forques de replicació.
INICIACIÓ La iniciació de la replicació consisteix   en   separar   les   cadenes   en   l’origen   de   replicació   i   unir-hi la maquinària per transcriure-les.
ORIGEN DE REPLICACIÓ Els orígens de replicació són regions de DNA que es repeteixen, són regions riques en A i T que faciliten  l’obertura  de  les  cadenes,  ja  que  l’enllaç  entre  les  bases  és  menys  fort.  En E. Coli, la regió del cromosoma  corresponent  a  l’origen  de  replicació  s’anomena OriC. Aquesta regió ha estat conservada entre diferents espècies bacterianes.
L’abundància   de   A   i   T   en   l’origen   de   replicació   facilita   l’obertura   de   les   cadenes. Les regions senyalades en blau són les regions reconegudes per proteïnes. Aquestes proteïnes  s’uneixen  al  DNA   i  formen  agregats,  el  que  provoca  que  el  DNA  s’enrotlli  i  es  creï  una  tensió  que  fa  que  la  doble  hèlix  es   separi per alleugerir-la.   Quan   la   doble   hèlix   s’obra,   entren   els   enzims   de   replicació   i   el  complex   de   proteïnes es desfà. La unió  de  les  proteïnes  requereix  una  despesa  d’ATP.
MECANISME  DE  L’INICI  DE  REPLICACIÓ Les proteïnes DnaA i HU torsionen el DNA i fan que les dues cadenes es separin en les regions riques en A i T. La proteïna DnaB és una helicasa que separa les dues cadenes formant dues forques de replicació. Les cadenes senzilles es mantenen separades per les proteïnes SSB (Single Stranded Binding proteins),  que  s’uneixen  al  DNA  de  la  cadena  senzilla  i  l’estabilitzen  per  mantenir-lo obert per tal que es pugui replicar.
Al separar-se les cadenes, el DNA es superenrotlla par darrere les forques de replicació. Els superenrotllaments són desfets per la DNA-girasa, una topoisomerasa de tipus II.
La   primasa   interacciona   amb   l’helicasa   i   amb   les   proteïnes   SSB.   La   primasa   sintetitza un únic encebador  per  a  la  cadena  continua  i,  en  la  retardada,  un  encebador  per  a  cada  fragment  d’Okazaki.
ELONGACIÓ La DNA-polimerasa   va   sintetitzant   la   cadena   en   direcció   5’    3’.   En   la   cadena   continua   es   fa   de   manera continuada, mentre que en la cadena  retardada  es  van  afegint  fragments  d’Okazaki.
La DNA-lligasa uneix els fragments de DNA un cop eliminats els primers dels  fragments  d’Okazaki.
La DNA-lligasa actua   en   dues   fases:   en   la   primera,   l’enzim   reacciona   amb   ATP   i   forma   un   complex   covalent entre enzim i AMP;;  en  la  segona,  l’AMP  es  transfereix  a  l’extrem  5’  del  DNA,  es  forma  l’enllaç   fosfodiéster  i  s’allibera  l’AMP.
ESTRUCTURA DE LA DNA-POLIMERASA III La DNA-polimerasa II té diverses subunitats: posseeix un centre catalític per on passa la cadena de DNA motlle i es va copiant.
L’elevada   processivitat   de   la   DNA-polimerasa III és deguda a la subunitat 𝛽. Dues subunitats 𝛽 formen una grapa que envolta el DNA. La grapa és un dímer que manté unit el DNA.
La  síntesi  de  les  dues  cadenes  es  fa  d’una  manera  coordinada.  El  complex  enzimàtic  responsable  de   la  síntesi  s’anomena  replisoma.  El  replisoma  avança  en  el  mateix  sentit  que  la  forca  de  replicació.  La   cadena discontinua forma un llaç.
Periòdicament, la DNA-polimerasa  s’uneix  a  la  helicasa,  sintetitza  un  nou  primer i es dissocia.
El primer és transferit a la DNA-polimerasa.
Quan  s’acaba  la  síntesi  del  fragment  d’Okazaki,  s’afegeix  la  nova  subunitat  𝛽 al complex catalític.
Es carrega una subunitat 𝛽 i  s’inicia  la  síntesi  d’un  altre  fragment  d’Okazaki.
FINALITZACIÓ Al   finalitzar   l’elongació,   les   dues  cadenes   motlle   encara   es   troben   unides.   La   DNA-topoisomerasa IV talla i separa els cromosomes (cada un anirà a una de les cèl·lules filles).
SÍNTESI DEL DNA DNA-POLIMERASA Les DNA-polimerases són proteïnes que sintetitzen DNA. No poden sintetitzar el DNA a partir del no res, sinó que necessiten primers, un extrem de cadena per anar-hi afegint nucleòtids. La DNApolimerasa necessita dNTPs (el substrat de la DNA-polimerasa I són els dNTPs), una cadena motlle i una cadena encebadora o primer (cadena amb un –OH   lliure   en   posició   3’   que   realitza   un   atac   nucleofílic  al  fosfat  de  l’altre  nucleòtid,  formant  un  enllaç  fosfodiéster  i  alliberant  un  Pi).
La  síntesi  de  DNA  es  realitza  en  direcció  5’   3’.  La  cadena  sintetitzada  és  antiparal·lela  a  la  motlle.
La RNA-polimerasa primasa sintetitza els primers que permeten a la DNA-polimerasa sintetitzar DNA.
Les dues cadenes complementàries a les motlle es sintetitzen de maneres diferents. La cadena continua   es   sintetitza   seguint   la   mateixa   direcció   d’obriment   de   la   cadena   de   DNA   (5’    3’).   En   la   cadena   retardada,   s’afegeixen   els   primers a mesura que la cadena s’obra   i   la   síntesi   es   realitza   en   sentit  contrari  (3’   5’).
Com  que  en  la  replicació  del  DNA  hi  ha  dos  forques  de  replicació,  la  cadena  continua  d’una  cadena   motlle  és  la  cadena  retardada  de  l’altra.
Els  fragments  d’Okazaki  són fragments de DNA que contenen RNA dels primers. Un cop sintetitzada la cadena, aquests primers s’han  d’eliminar.
Les DNA-polimerases poden corregir errors produïts durant la replicació. Detecten errors en la incorporació de bases o de la cadena mare i els  corregeixen.  Es  tracta  d’enzims  que  posseeixen  dos   centres  actius,  un  dels  quals  és  una  hidrolasa,  un  centre  hidrolític  que  talla  l’enllaç  mal  format.
Un error en la replicació suposa una mutació del DNA. Les DNA-polimerases posseeixen activitats reparadores per tal de minimitzar les mutacions que es puguin produir.
Les DNA-polimerases I i III són importants per replicació. La polimerasa III és la que sintetitza la major part  del  DNA,  mentre  que  la  polimerasa  I  s’encarrega  d’eliminar  els  primers de RNA, per la qual cosa té activitat   exonucleasa   (l’activitat   exonucleasa   5’    3’   elimina   els   RNA   dels   fragments   d’Okazaki   i   substitueix el RNA eliminat per DNA).
La processivitat de les DNA-polimerases és una mesura relacionada amb la seva rapidesa per sintetitzar DNA. Si la DNA-polimerasa no es desenganxa del DNA per formar enllaços fosfodiéster, va més ràpid, és a dir, té major processivitat. Si es desenganxa, va més lenta i té menor processivitat.
La DNA-polimerasa I té dos dominis separables: el domini polimerasa sintetitza el DNA i el domini exonucleasa elimina el primer de RNA.
A  mesura  que  es  va  sintetitzant  DNA,  l’activitat  exonucleasa  va  eliminant  el  RNA.
La DNA-lligasa uneix els extrems de DNA.
REPLICACIÓ DEL DNA EN EUCARIOTES La replicació del DNA en eucariotes és més lenta. Hi ha molts orígens de replicació per cromosoma, ja que el DNA és més llarg. Algunes de les proteïnes implicades en la iniciació són destruïdes per proteòlisi.
La DNA-polimerasa 𝛼 és  l’encarregada  d’iniciar  la  síntesi.  Té  activitat primasa (posa els primers) però no exonucleasa. La DNA-polimerasa 𝛼 és substituïda per la DNA-polimerasa 𝛿 (equivalent a la DNApolimerasa III de E. Coli). La PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) és un homòleg de la subunitat 𝛽 de E. Coli.
TELÒMERS En els extrems dels cromosomes lineals, la DNA-polimerasa no pot substituir els encebadors de RNA per DNA.
Els telòmers són estructures especialitzades que es troben als extrems dels cromosomes lineals dels eucariotes. Depenent de la llargada dels telòmers, una cèl·lula pot tenir més o menys cicles cel·lulars. Els telòmers  són  afegits  per  la  telomerasa.  La  telomerasa  és  un  enzim  format  per  RNA  i  proteïna.  L’RNA  de   l’enzim   actua   com   a   motlle   i   es   fa   servir   per   sintetitzar   DNA.   Les   cèl·lules   somàtiques perden les telomerases   i   per   aquesta   raó   envelleixen,   ja   que   a   cada   cicle  cel·lular,   s’escurcen   cada   cop   més   els   telòmers.
MODEL DE TELÒMER El DNA dels telòmers es troba unit a proteïnes que li fan tenir una estructura circular.
REPLICACIÓ DE LA CROMATINA Quan es replica el DNA, els nucleosomes que es troben units a la molècula es destrueixen, i a mida que el DNA es va replicant, es va associant amb nucleosomes. La CAF (Cromatine Assembly Factor) fixa histones i les ajuda a fusionar amb el DNA. Les histones noves i velles (provinents dels nucleosomes desensamblats)  es  distribueixen  a  l’atzar.
Hi   ha   caràcters   (gens)   que   depenen   del   grau   d’acteliació   o   metilació   de   les   histones   que   formen   els   nucleosomes. Les acetilacions de les histones provoquen que el DNA es trobi més relaxat, mentre que les  metilacions  compacten  el  DNA.  S’hereta  un  component  que  fa  que  el  DNA  estigui  més  compactat  i   que  el  gen  no  s’expressi.  És  el  que  s’anomena  herència  epigenètica.
REPARACIÓ DEL DNA REPARACIÓ DEL DNA Per determinar   la   importància   de   l’activitat   correctora  de   la   DNA-polimerasa es va realitzar el següent experiment: es va substituir una DNA-polimerasa normal per una amb la subunitat correctora no activa.
Al  llarg  del  temps,  es  va  observar  l’elevat  desenvolupament de tumors degut a les mutacions del DNA dels individus amb la DNA-polimerasa amb la subunitat correctora inactiva, amb la qual cosa el percentatge  de  morts  era  molt  elevat.  D’aquesta  manera  es  va  establir  que  l’activitat  correctora  d’errors   de la DNA-polimerasa  era  essencial  per  la  supervivència  de  l’individu  (i  de  l’espècie).
Activitat  5’ 3’  endonucleasa  de  la  DNA-polimerasa i incidència de càncer Existeixen,  també,  altres  mecanismes  de  correcció  d’errors: - Reparació de bases mal aparellades - Reparació directa - Reparació per escissió de nucleòtids - Reparació per escissió de base REPARACIÓ DE BASES MAL APARELLADES (MISMATCH REPAIR) Es   tracta   d’un   sistema   de   reparació   d’errors   produïts   durant   la   replicació.   El   sistema   és   capaç   de   reconèixer la cadena mare de la filla: repara només els errors en la cadena filla, prenent la cadena mare com a correcta.
Existeixen regions de bases en el DNA, seqüències específiques, que són reconegudes per metilases, enzims que metilen aquestes regions. Com que les cadenes  filles  que  s’estan  replicant  encara  no  tenen   aquestes metilacions, es pot diferenciar la cadena mare de la filla i, per tant, reconèixer i reparar errors de replicació en la cadena filla. Un cop la cadena filla està metilada, ja no es poden diferenciar. Així, fins  que  la  cadena  filla  no  està  metilada  no  s’inicia  un  altre  cicle  de  replicació.
La proteïna MutS reconeix bases mal aparellades per la distorsió que provoquen a la doble hèlix. La proteïna   MutH,   enzim   endonucleasa   que   només   s’activa   si   forma complexos amb MutS i MutL, únicament talla la cadena no metilada.
Les exonucleases tallen la cadena filla amb la mutació per tal que torni a ser replicada per la DNApolimerasa.
REPARACIÓ DIRECTA (DIRECT REPAIR) Existeixen enzims específics que s’encarreguen  de  reparar  mutacions  del  DNA.
Ex.: La   fotoliasa   repara   els   dímers   de   timina:   trenca   l’anell   de   ciclobutà.   La   metiltransferasa   repara   metilacions de les bases (de les guanines), eliminant els grups metil afegits. La metiltransferasa no és tècnicament   un   enzim,   ja   que   cada   proteïna   només   s’utilitza   un   cop   (un   enzim   es   caracteritza   per   catalitzar  una  reacció  més  d’un  cop):  elimina  un  metil,  que  queda  unit  a  l’enzim,  i  es  degradada.
REPARACIÓ PER ESCISSIÓ DE NUCLEÒTIDS se lleva todo el nucleotido Aquest mecanisme de reparació serveix per reparar escissions del DNA. Els enzims detecten la mutació i tallen la cadena abans i després de la mutació (la exonucleasa talla la cadena pels dos costats).  El  tros  de  cadena  que  s’ha  tallat  es  sintetitza  de  nou.
En  bacteris  s’anomena  sistema UvrABC.
REPARACIÓ PER ESCISSIÓ DE BASE se lleva solo una base.
Ex.: En   la   desaminació  espontània   de   la  citosina  a   uracil,   l’uracil s’ha   d’eliminar.   Aquest   canvi  és  un   dels més comuns en la cèl·lula. De fet, en el DNA no hi ha uracil ja que no existeixen mecanismes capaços de determinar els uracils naturals dels formats per mutació de la citosina.
Les DNA-glicosilases són els enzims que reconeixen específicament aquests canvis de bases i trenquen   l’enllaç   entre   la   base   i   la   pentosa,   quedant   una   zona   del   DNA   sense   base.   Les   APendonucleases  detecten  els  llocs  on  s’ha  eliminat  una  base  i  tallen  la  cadena  de  DNA  en  aquell  punt   per tal que torni a ser replicada per la DNA-polimerasa.
La DNA-lligasa uneix les diferents cadenes del DNA.
També  existeixen  mutacions  on  es  talla  l’enllaç  entre  la  base  i  la  pentosa  (es  crea  un  lloc  AP).  Llavors   actuen directament les endonucleases.
MUTACIONS ESPONTÀNIES Les mutacions espontànies més freqüents són: - Desaminacions cambia la base - Depurinitzacions  es  trenca  l’enllaç  entre  la  pentosa  i  la  base Es   tracten   de   mutacions   espontànies   sense   l’acció   d’agents   mutàgens.   Si   les   bases   muten,   ja   no   s’aparellen  bé.
AGENTS MUTAGÈNICS La radiació UV provoca interaccions covalents entre bases aparellades.
Els  canvis  de  bases  produïts  per  les  mutacions  poden  o  no  causar  un  canvi  d’aminoàcid  en  la  proteïna.   És  a  dir,  no  totes  les  mutacions  s’expressen.
ANÀLEGS DE BASES El 5-bromouracil és un anàleg de la Timina. El 5-bromouracil té dues formes: enol i ceto. En la seva forma   ceto  s’aparella   amb   l’adenina,   i   en   la   seva   forma   enol  s’aparella   amb   la  guanina   (indueix   un   canvi en una base). Ambdues formes són igual de freqüents, estan en equilibri.
AGENTS ALQUILANTS Els agents alquilants metilen les bases.
Ex.: La metilació de la guanina en forma enol estabilitza la base (O6-metilguanina) i fa que ja no s’aparelli  amb  la  citosina,  sinó  amb  la  timina.  És  a  dir,  provoca  el  canvi  en  una  base.
AGENTS DESAMINANTS Els agents desaminants eliminen grups amino de les bases. Solen  ser  precursors  de  l’àcid  nitrós:  nitrit   de sodi, nitrat de sodi o nitrosamina.
Ex.: La  desaminació  de  l’Adenina,  que  passa  a  ser  Hipoxantina,  provoca  que  aquesta  s’aparelli  amb   la  citosina  i,  per  tant,  provoca  el  canvi  d’un  nucleòtid durant la replicació.
AGENTS OXIDANTS Els agents oxidants afegeixen oxígens.
Ex.: La oxo-dGuanina  s’aparella  amb  l’adenina  en  comptes  de  la  citosina.
AGENTS INTERCALANTS Els agents intercalants són molècules aromàtiques plantes que es col·loquen entre les cadenes (entre bases) i produeixen errors en la replicació. No produeixen canvis de bases sinó errors de la DNA- polimerasa, que com que es troba aquesta molècula al mig comet errors que no es corregeixen (els errors  es  troben  en  excés  i  l’activitat  correctora  no  dóna  abast  per  corregir-los tots).
Ex.: Bromur  d’etidi AGENTS FÍSICS Els raigs UV provoquen la formació de dímers de timina. Es crea un enllaç covalent entre dues timines, el que provoca que la DNA-polimerasa cometi errors durant la replicació. El producte més freqüent  és  la  formació  d’un  anell  de  ciclobutà.
MALALTIES ASSOCIADES A DEFECTES EN LA REPARACIÓ DEL DNA Els gens CareTakers són gens de reparació del DNA. Les mutacions o defectes en aquests gens provoquen malalties hereditàries.
 Xerodrema pigmentosum Causada per defectes en els gens de reparació per escissió de nucleòtids (7 gens). En humans, existeixen només 7 gens que intervenen en la reparació per escissió de nucleòtids.
 Càncer de colon hereditari sense poliposi (HNPCC) Causada per defectes en els gens de reparació de bases mal aparellades (4-5 gens).
TEST D’AMES El  test  d’ames  és  un  sistema  que  serveix  per  detectar  productes  mutagènics  (cancerígens).
S’utilitzen   soques   determinades  de   bacteris  de   la  salmonella   que  necessiten  un   medi   determinat   per   proliferar.  En  presència  d’un  agent  mutagen,  apareixen  més  reversions (colònies mutades) del normal.
En alguns casos aquest test no funciona.
Ex.: L’aflotoxina  B1  produeix  càncer  de  fetge.  El complex oxidat en el fetge interacciona amb el DNA i provoca  errors  en  la  replicació.  Es  tracta  d’un  producte  que  en  sí  no  és cancerigen, sinó que el mateix organisme el fa cancerigen (producte de la seva oxidació en el fetge).
TRANSCRIPCIÓ TRANSCRIPCIÓ A diferència de la replicació, en la transcripció només es copia una part de la cadena de DNA, la part que correspon al gen que es vol expressar.
Existeixen diferències segons si es tracta de cèl·lules eucariotes o procariotes.
En procariotes, com que no hi ha separació i nucli (no tenen nucli definit), la transcripció i la traducció es donen simultàniament. En eucariotes, en canvi, el procés és més complicat: en primer lloc es genera un transcrit  primari  que  conté  tant  els  exons  com  els  introns.  La  maduració  del  RNAm  d’eucariotes  consisteix   en  l’eliminació  dels  introns  i  la  unió  dels  exons.
Una de les cadenes de DNA es fa servir com a motlle per transcriure el RNAm. La cadena de RNA és complementaria i antiparal·lela a la motlle, però amb U en comptes de T.
En la transcripció es copia una sola cadena del DNA, però la informació del gen pot estar en les dues cadenes. La regió promotora indica on comença, amb quina freqüència es transcriu i a quina de les dues cadenes es troba el gen, que serà la cadena que es prendrà com a motlle.
La  regió  promotora  indica  l’inici  de  la  síntesi  de  RNAm;;  la  regió  terminal indica la fi de la síntesi PASSOS DE LA TRANSCRIPCIÓ  Inici És el pas més complex de la transcripció.
- Formació del complex tancat  la RNA-polimerasa  s’uneix  al  DNA  per  la  regió  promotora Formació del complex obert  s’obren   les   dues   cadenes   i   es   forma   la   bombolla   de   transcripció (regió de cadena no aparellada)  Elongació  Finalització TRANSCRIPCIÓ EN PROCARIOTES PROMOTORS Seqüències consens dels promotors de procariotes Es tracta de regions conservades amb abundància de certes bases. Són seqüències consens, és a dir, seqüències amb bases determinades abundants.
L’UP  element  només  es  troba  en  alguns  tipus  de  promotors,  els  dels  gens  més  transcrits Les seqüències promotores actuen com a reguladors de la transcripció dels gens.
Ex.: En els gens molt transcrits, els seus promotors tenen seqüències similars a la seqüència consens.
Això  provoca  que  la  polimerasa  s’hi  uneixi  amb  més  afinitat  i  que,  per  tant,  hi  hagi  més  transcripció  i,   com a conseqüència, que augmenti la concentració de la proteïna dins la cèl·lula.
El gen lac codifica per la 𝛽-galactosidasa, enzim que metabolitza la galactosa Així, com és similars a la seqüència consens siguin les seqüències de nucleòtids de les regions promotores, amb més afinitat  s’hi  unirà  la  RNA-polimerasa.
ESTRUCTURA DE LA RNA-POLIMERASA La RNA-polimerasa  té  una  forma  de  “pinça  de  cranc”. L’enzim  està  format  per: - 2 subunitats 𝛽 (𝛽 i 𝛽′)  que  conformen  el  centre  actiu  (catalític)  de  l’enzim - 2 subunitats 𝛼 que reconeixen els promotors UPstream element - 1 subunitat 𝜔 - 1 subunitat 𝜎 que  reconeix  específicament  els  promotors  i  marxa  quan  s’inicia  la  síntesi ESTRUCTURA DE LA SUBUNITAT 𝜎 𝜎 Les hèlix-  𝛼 reconeixen les diferents seqüències dels promotors intercalant-se al solc major del DNA.
Per  aquesta  raó,  els  promotors  estan  separats  d’una  distància  determinada,  la  distància  entre  dues   hèlix-  𝛼.
La subunitat 𝜎 està formada per un domini C-terminal,  que  reconeix  l’UP-element, i per un domini Nterminal format per dues subunitats: 𝜎4 i 𝜎2.
𝜎4 reconeix el DNA i 𝜎2 reconeix el DNA i separa les cadenes.
Hi ha varies subunitats 𝜎 que reconeixen promotors diferents.
Promotors diferents reconeguts per diferents subunitats 𝜎 Els promotors estàndard són reconeguts pel factor 𝜎 . El factor 𝜎 s’uneix   als   promotors   que   responen al xoc tèrmic (per elevada temperatura). El factor 𝜎 és activat quan no hi ha amoni en el medi.
En condicions sense estrès tèrmic, les xaperones mantenen segrestat el factor 𝜎 i, per tant, no és funcional. Quan la cèl·lula és sotmesa a estrès tèrmic, alliberen el factor i permeten la transcripció dels gens   per   adaptar   la   cèl·lula   a   l’estrès   tèrmic.   Quan   augmenta   la   temperatura,   augmenta   el   nombre de proteïnes desnaturalitzades; les xaperones alliberen el factor 𝜎 que tenen segrestat per anar a plegar les proteïnes desnaturalitzades.
A diferència de la DNA-polimerasa, la RNA-polimerasa no corregeix errors de transcripció, ja que la cadena  copiada  és  una  cadena  curta  i,  per  tant,  hi  ha  poca  probabilitat  d’errors.  A  més,  es  transcriuen   moltes  còpies  d’un  mateix  gen  i  la  síntesi  del  RNAm  és  processiva  (continua, la RNA-polimerasa no es separa de la cadena).
FINALITZACIÓ DEPENENT DE 𝝆 (RHO) Existeix   una   seqüència   en   el   DNA   que   indica   quan   s’acaba   la   síntesi   de   RNAm.   Llavors,   intervé   la   proteïna 𝜌,  que  actua  com  a  helicasa  separant  l’híbrid  DNA-RNAm amb  despesa  d’ATP.
Es forma un loop en  l’RNAm  que  desestabilitza  la  unió  de  l’híbrid  DNA-RNAm.  En  l’extrem  3’  de  l’RNAm   queda  una  seqüència  d’U  sense  aparellar  i,  com  que  es  tracta  de  l’aparellament  més  feble,  tendeix  a   desenganxar-se del DNA.
TRANSCRIPCIÓ EN EUCARIOTES RNA-POLIMERASES D’EUCARIOTES En eucariotes existeixen 3 RNA-polimerases, que sintetitzen 4 rRNA diferents: La RNA-polimerasa II és la més important de les RNA-polimerases  d’eucariotes:  sintetitza  l’RNAm que codifica per proteïnes. Els rRNA que sintetitza la RNA-polimerasa I es transcriuen com a un únic transcrit que es talla, posteriorment, en 3 (la s ve de small).
L’𝛼-amanitina és el principi actiu de les amanites (bolets).
Per tal que la iniciació sigui eficient i específica, a més de la RNA-polimerasa és necessària la presència   d’unes   proteïnes   anomenades   factors   d’iniciació.   Els   factors   d’iniciació   generals   (GTF   – General Transcription Factor) permeten la síntesi de RNA in vitro. In vivo el DNA forma complexos amb histones  i  altres  proteïnes  i  no  n’hi  ha  prou  amb  els  GTF  per  a  iniciar  la  transcripció.
PROMOTORS DE LA RNA-POLIMERASA II Els promotors són regions reconegudes pels factors de transcripció.
Promotors específics de la RNA-polimerasa II. TBP = TATA Binding Protein Per  a  l’òptima  expressió  dels  gens  sovint  calen  altres  seqüències  reguladores.
Les RNA-polimerases I i III reconeixen diferents promotors, que són reconeguts per complexes diferents.  La  TBP  forma  part  d’algun  d’ells.
FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ La   unió   en   el   DNA   d’aquests   factors   es   produeix   de   manera   seqüencial   (ensamblatge   per   parts).   El   primer factor que entra és la TBP. Com que té una estructura de fulla 𝛽, torsiona el DNA al unir-se.
Algunes  d’aquestes  proteïnes  tenen  activitat  helicasa,  per  tal  d’obrir  la  doble  hèlix  de  DNA  i  formar  el   complex obert.
La RNA-polimerasa   s’ha   de   fosforilar   per   tal   que   s’iniciï   la   síntesi   de   RNAm.   Llavors,   s’alliberen   els   factors  d’iniciació  i  s’uneixen  els  d’elongació.  Qui  fosforila  la  RNA-polimerasa és la TFIIH, que posseeix activitat quinasa.
Els factors de transcripció basal, que és el mínim que requereix un gen per expressar-se, són: Els factors són complexos multi-enzimàtics. El TFIIH és capaç de reparar mutacions en el DNA.
Per tal de regular la transcripció in vivo calen, a més del GTF, el complex mediador, reguladors transcripcionals i, en alguns casos, enzims que modifiquin els nucleosomes.
Els factors de transcripció no interaccionen directament amb la RNA-polimerasa, sinó que interaccionen amb un mediador.
La HAT (Histona Acetil Transferasa) acetila les histones i descompacta el DNA perquè la RNApolimerasa pugui passar amb més facilitat.
FACTORS  D’ELONGACIÓ Durant  l’elongació,  s’uneixen  a  la  polimerasa  una  sèrie  de  factors  diferents.
Pol II = Polimerasa II Alguns   d’aquests   factors   estimulen   l’elongació   (factors   d’elongació)   i   altres   s’utilitzen   durant   el   processament del RNAm.
INHIBIDORS DE LES RNA-POLIMERASES L’actinomicina  D  i  l’acridina  són  agents  intercalants  que  inhibeixen  la  RNA-polimerasa: posseeixen anells aromàtics plans que es col·loquen entre les bases i bloquegen la RNA-polimerasa. No actuen directament sobre la RNA-polimerasa, per aquesta raó són inhibidors tant de procariotes com d’eucariotes. La rifamipicina és un inhibidor específic de la RNA-polimerasa  de  procariotes.  S’uneix  a la subunitat 𝛽 i  no  permet  l’elongació.  S’utilitza  com  antibiòtic  en  el  tractament  de  la  tuberculosi.
La 𝛼-amanitina és un inhibidor de la RNA-polimerasa II. El seu efecte principal és el bloqueig de la síntesi de RNAm. A altes concentracions també inhibeix la RNA-polimerasa III.
REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA REGULACIÓ TRANSCRIPCIONAL EN PROCARIOTES Elements principals dels promotors de procariotes OPERÓ LACTOSA Un  operó  és  una  unitat  d’expressió  gènica  coordinada.
Existeixen proteïnes que es necessiten en moments determinats de la vida de la cèl·lula. En procariotes, si no hi ha glucosa en el medi, es pot metabolitzar la lactosa. El bacteri respon a la presència  de  lactosa  (i  a  l’absència  de  glucosa)  augmentant  la  síntesi  de  𝛽-galactosidasa.
A  més  del  promotor,  existeixen  dos  llocs  més  d’unió  de  la  RNA-polimerasa.  L’RNAm  sintetitzat  és  un   RNA  policistrònic  (amb  més  d’un  gen):  conté  3  gens.
Si   no   hi   ha   lactosa   en   el   medi,   la   proteïna   repressora   (regulada   per   l’expressió   del   gen)   s’uneix   a   l’operador,   amb   la   qual   cosa   la   RNA-polimerasa   no   s’hi   pot   unir.   El   repressor   s’expressa   constitutivament.
Quan  hi  ha  lactosa  en  el  medi,  la  lactosa  actua  com  a  un  inductor  (la  lactosa  no  és  l’inductor  directe,   sinó que ho és la alolactosa): s’uneix   al   repressor i el desenganxa del DNA, permetent la síntesi d’RNAm.  És  a  dir,  l’inductor  s’uneix  al  repressor  i  disminueix  la  seva  afinitat  pel  DNA.
Es requereix una elevada concentració de lactosa en el medi per iniciar el seu metabolisme.
Sempre hi ha una expressió  basal  (mínima)  d’aquests  gens,  ja  que  sinó  el  sistema  no  funcionaria.
La   seqüència   de   l’operador   lac és gairebé palindròmica: es llegeix igual en els dos sentits. És una seqüència amb simetria radial.
El  repressor  s’uneix  a  l’operador  i  actua  sempre com un dímer.
Dímer de repressor lac unit al DNA També  existeixen  inductors  sintètics,  com  l’isopropiltiogalactòsid  (IPTG).
La RNA-polimerasa també interacciona amb la CAP (Catabolit Activated Protein): la CAP interacciona amb el CTD de la subunitat 𝛼 de la RNA-polimerasa.
La RNA-polimerasa  no  s’uneix  bé  al  promotor  en  absència  de  CAP.  La  proteïna  CAP  només  s’uneix  al   DNA quan no hi ha glucosa en el medi (sinó es troba en el citosol). La concentració intracel·lular d’AMPc  augmenta  en  absència  de  glucosa. És  a  dir,  la  CAP  únicament  s’uneix  al  DNA  quan  està  unida   a AMPc.
Si hi ha lactosa i glucosa en el medi, els bacteris no sintetitzen 𝛽-galactosidasa. En presència de glucosa,  els  bacteris  no  sintetitzen  AMPc  (que  es  sintetitza  en  absència  de  glucosa,  senyal  de  “gana”)  i,   per tant, no metabolitzen la lactosa. Així, el gen de la 𝛽-galactosidasa és un gen regulat per lactosa i per glucosa.
Si   no   hi   ha   glucosa   en   el   medi,   augmenta   el   nivell   d’AMPc   i   la   CAP   s’uneix   al   DNA.   Llavors,   si   augmenta la concentració de lactosa, es sintetitzarà 𝛽-galactosidasa. Si la CAP no està unida al DNA, la síntesi de 𝛽-galactosidasa no es durà a terme. Per tant, la CAP és una proteïna activadora de la síntesi de 𝛽-galactosidasa de la RNA-polimerasa.
Cada sucre té el seu repressor específic, però tots ells estan regulats per la concentració de glucosa. El bacteri prioritza la consumició de glucosa abans dels altres sucres.
També existeixen co-repressors (Ex.: Els enzims que sintetitzen els aminoàcids només són necessaris quan  no  hi  ha  l’aminoàcid  en  el  medi.  El  repressor  s’uneix  quan  hi  ha  l’aminoàcid.  El  co-repressor és un repressor unit a Trp).
REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA EN EUCARIOTES En eucariotes, les seqüències reguladores (o enhacers) poden estar en els introns, i poden estar molt allunyades en la seqüència de nucleòtids dels promotors (poden estar a moltes kilobases dels promotors i poden estar upstream o downstream), però gràcies al plegament del DNA estan més properes. El funcionament dels enhacers és independent de la seva orientació.
ESTRUCTURA DELS ACTIVADORS Els  activadors  s’uneixen  com  a  dímers.  Tenen  2  dominis:  un  d’unió  al  DNA,  que   reconeix seqüències determinades,  i  un  domini  activador,  on  s’ancoren  diferents  proteïnes  que  faciliten  la  transcripció.
Les proteïnes activadores no interaccionen directament amb la RNA-polimerasa, sinó que ho fan mitjançant un mediador o factor de transcripció basal. És a dir, els activadors poden interaccionar amb elements de la maquinària de transcripció diferents de la RNA-polimerasa.
Els activadors recluten proteïnes modificadores dels nucleosomes que faciliten la unió de la maquinària de transcripció al promotor (molècules unides als activadors que faciliten la transcripció). A més, el complexe regulador de la cromatina s’uneix  i mou els nucleosomes, exposant els promotors per tal que altres proteïnes hi interaccionin. Els dos sistemes poden actuar a la vegada.
MODIFICACIÓ DE LES HISTONES EN EL NUCLEOSOMA Les histones es poden modificar covalentment en les regions N-terminal.  L’acetilació  de  les  histones, per la HAT (histona acetil transferasa), està relacionada amb el desplegament del DNA, mentre que la metilació de les histones, per la HMT (histona metil transferasa) o per la DNA metil transferasa, està relacionada  amb  la  inactivació  de  l’expressió  gènica. És a dir, les modificacions de les histones estan relacionades   amb   el   grau   de   compactament   del   DNA   i   aquest   està   relacionat   amb   l’activitat   transcriptora dels gens: com més acetilades estiguin les histones, menys compactat estarà el DNA i hi haurà més expressió del gen. En canvi, com més metilades estiguin les histones, més compactat estarà el DNA i hi haurà menys expressió gènica.
La   fosforilació   i   la   ubiquitinació   de   les   histones   també   participen   en   l’expressió   gènica. En els nucleosomes  també  hi  ha  cromodominis,  dominis  d’unió  a  grups  metil, i  bromodominis,  dominis  d’unió  a   grups  acetil,  que  intervenen  en  la  regulació  de  l’expressió  gènica.
Resumint,  la  regulació  de  l’expressió  gènica  a  eucariotes  és  molt  complexa  i  varia  segons  el  gen.
AÏLLADORS El enhacers són regions molt allunyades dels promotors. Existeixen seqüències aïlladores que fan que l’enhacer  actuï  només  sobre  un  promotor.  És  a  dir,  els  aïlladors  inhibeixen  l’acció  dels  enhacers  sobre   els promotors.
REPRESSORS Els  repressors  tenen  diversos  mecanismes  d’actuació: - Competeixen amb els activadors unint-se en el mateix lloc (mecanisme de competència) - Competeixen amb els activadors inhibint-los (inhibició al·lostèrica) - Inhibeixen la RNA-polimerasa a través del mediador (repressió directa) - Recluten proteïnes que dificulten la síntesi de RNAm (repressió indirecta) REGULACIÓ DELS FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ Els   factors   de   transcripció   es   poden   regular   a   través   d’hormones   liposolubles   que   són   capaces   de   reconèixer seqüències determinades i específiques dels promotors.
Els receptors  d’aquestes  hormones  tenen  una  estructura  comú:  posseeixen  3  regions,  en  la  variable  és   on es produeixen les modificacions (acetilacions, metilacions...).
MODEL DE FUNCIONAMENT 1 Les   xaperones,   proteïnes   inhibidores,   bloquegen   l’entrada   del   complex   al   nucli en absència de l’hormona,  inhibint  la  transcripció  del  gen.
MODEL DE FUNCIONAMENT 2 Els receptors estan contínuament units al DNA, però en funció de si hi ha o no hormona, formen complexes amb proteïnes diferents que compacten o descompacten el DNA.
Els   factors   de   transcripció   també   es   poden   regular   a   través   d’hormones   no   liposolubles.   Llavors,   existeixen  altres  mecanismes:  receptors  de  membrana  per  l’hormona  i  activadors  secundaris.
Ex.: Activació de la PKA  Quan  la  PKA  s’activa  entra  en  el  nucli,  on  fosforila  un  factor  de  transcripció   que  s’uneix  a  altres  proteïnes  i  activa  la  maquinària  de  transcripció  basal.
EPIGENÈTICA (IMPRINTING GENÈTIC) L’epigenètica   són   canvis   en   els   gens   deguts   a   canvis   en   les   histones.   Per   tant,   l’herència   no   és   mendeliana (Ex.: Formació  de  híbrids  diferents  en  funció  de  creuar  un  mascle  d’una  espècie  amb  una   femella  d’una  altra  espècie  diferent.  Un  exemple  és  el  mul  somerí,  resultat  de  creuar  un  cavall  amb  una   somera, o el mul eguí, resultat de creuar un ruc i una euga).
SILENCIAMENT GÈNIC PER RNA D’INTERFERÈNCIA (RNAi) Existeixen alguns RNA de molt pocs nucleòtids que es troben dins el introns, molt de tant en tant. Són els siRNA (small interfering RNA) i els miRNA (micro RNA).
El RISC (RNA-induced silencing complex) és un complex multi-proteic  que  incorpora  una  cadena  d’un   siRNA   o   d’un   miRNA.   Utilitza   els   RNA   d’interferència   com   a   motlle   per   reconèixer   un   RNAm   complementari. Quan troba la seva cadena complementària, activa les RNAses  i  trenca  l’RNA.  És  a  dir,   s’elimina   una   cadena   i   la   que   queda   és   parcialment   complementària   al   RNAm.   D’aquesta   manera   s’inhibeix  la  transcripció  dels  RNAm.
Els   RNA   d’interferència   s’utilitzen   de   manera   artificial   per   eliminar   una   proteïna   d’una   cèl·lula. La proteïna   s’elimina   definitivament   de   la   cèl·lula   ja   que   es   degrada   la   seqüència   del   RNAm   que   la   sintetitza.
PROCESSAMENT DELS RNAs PROCESSAMENT DELS RNAm EN EUCARIOTES El processament dels RNAm en eucariotes comporta diferents passos: 1. Es sintetitza un pre-RNAm (o transcrit primari) que conté tant els introns com els exons 2. S’enganxa   el   CAP   a   l’extrem   5’   del   pre-RNA. Aquest CAP el fa més resistent a les nucleases: allarga la vida dels missatgers perquè no siguin degradats ràpidament 3. Eliminació dels introns i unió dels exons 4. S’afegeix  una  cua  poli-A,  només  d’adenina,  en  l’extrem  3’  del  RNAm L’estructura  CAP  serà  reconeguda  per  una  proteïna  ribosomal  que  enviarà  els  RNAm  al  ribosoma  per  ser   traduïts.
El  CAP  s’afegeix  quan  l’RNAm té una 20-40 nucleòtids. Alguns  factors  d’elongació  actuen  com  a  llocs   d’ancoratge  pels  enzims  que  processen  els  RNAm.
Depenent   de   l’estat   de   fosforilació   de   la   cua   de   la   RNA-polimerasa,   s’enganxen   diferents   enzims   que   actuen en la síntesi de DNA/RNA. És  a  dir,  l’ intercanvi  dels  diferents  enzims  que  processen  l’RNAm  està   regulat per la fosforilació del CTD de la RNA-polimerasa.
ESTRUCTURA CAP El CAP és un nucleòtid de guanina invertit amb la base metilada i, a vegades, la pentosa també, però la metilació  de  la  pentosa  no  es  dóna  sempre  i  depèn  de  l’espècie.
En la formació del CAP intervenen diferents enzims, el més important és la guaniril transferasa, que afegeix  la  guanina  i  crea  l’enllaç  5’3’  difosfat.
POLIADENILACIÓ DELS RNAm La seqüència AAUAAA és la senyal poli-A (poly-A signal).   L’enzim   que   sintetitza   la   cua   poli-A s’anomena  poliadenilat  polimerasa.  La  senyal  de  poliadeilació és necessària per a la finalització.
CPSP = Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor; CstF = Cleavage stimulation Factor La poli-A   polimerasa   afegeix   nucleòtids   d’adenina   (60-70). Les poli-A binding proteins interaccionen amb les proteïnes ribosomals.
ELIMINACIÓ DELS INTRONS (SPLICING) En   el   procés   de   maduració   dels   RNAm   s’han   d’eliminar   els   introns,   seqüències   no   codificants,   i   empalmar  els  exons.  L’RNAm  posseeix  una  seqüència  complementària  a  la  proteïna  a  sintetitzar.
L’splicing es duu a terme a través de dues reaccions de transesterificació successives. Dins del preRNAm  es  trenquen  dos  enllaços  fosfodiéster  i  se’n  formen  dos  de  nous.  En  la  segona  reacció  s’uneixen   els  exons  i  s’allibera  l’intró.  L’ATP  que  es  consumeix  és  necessari  per  a  efectuar  l’splicing amb presició.
Es  trenca  l’enllaç  entre  intró  i  exó,  l’intró  es  cicla,  es  trenca  l’altre  enllaç  intró-exó  i  s’uneixen  els  extrems   dels  exons.  L’intró  és  degradat.
PROCESSAMENT (SPLICING)  DEL  RNAm  DE  L’OVOALBÚMINA CARACTERÍSTIQUES DELS INTRONS NUCLEARS Només  calen  unes  poques  seqüències  de  bases  conservades  en  els  extrems  5’  i  3’  dels  introns.  Si  es   canvien   aquestes   seqüències,   es   poden   produir   errors   en   l’eliminació   dels   introns   i,   per   tant,   es   sintetitzarà una proteïna nova. És a dir, mutacions que es donen en zones no codificants del DNA poden afectar a la proteïna.
Algunes malalties, com la talassèmia, són conseqüència de mutacions que modifiquen els extrems dels introns o originen extrems nous.
PROCESSAMENT (SPLICING) ALTERNATIU Existeixen proteïnes que fan servir llocs alternatius de splicing. Llavors, amb un mateix fragment de DNA es poden codificar duos RNAm diferents i, per tant, dues proteïnes diferents. És a dir, alguns transcrits primaris poden originar més d’un  RNAm  i,  per  tant,  polipèptids  diferents.
Això representa un avantatge evolutiu: en un teixit es produeix una de les dues proteïnes i en un altre teixit  diferent  l’altra,  que  pot  ser  més  curta  o  més  llarga  i  tenir  una  altra  activitat  o  afinitat  pel  mateix substrat.
ESPLICEOSOMA L’splicing dels RNAm és dut a terme per un complex macromolecular anomenat espliceosoma.
L’espliceosoma   està   format   per   5   snRNA   (small nucelar RNA) i unes 150 proteïnes. Moltes de les funcions  de  l’espliceosoma són realitzades pels snRNA.
Small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) in the splicing of mRNA precursors L’espliceosoma   processa   els   introns   perquè   els   snRNA tenen seqüències que hibriden amb els extrems   dels   introns.   D’aquesta   manera,   el   complex   aproxima   en   l’espai   els   llocs   de   tall   d’introns   i   d’unió  d’exons.
El   complex   de   l’espliceosoma   es   forma   de   manera   seqüencial. Per   l’assemblatge   del   complex   cal   consumir ATP.
Interaccions  entre  diferents  RNAs  que  es  donen  durant  l’splicing No hi ha activitat del complex fins que la U4 marxa, ja que inhibeix la U6, que és la unitat catalítica.
Un  cop  eliminat  l’intró,  el  complex  marxa  amb  l’intró unit i aquest és degradat.
INTRONS AUTOCATALÍTICS Els   introns   de   tipus   I   i   II   tenen   la   capacitat   d’autoassemblar-se. És a dir, els introns de tipus I i II no necessiten proteïnes per processar-se, sinó que es processen sols (RNAs amb activitat catalítica).
Aquests   introns   formen   estructures   secundaries   complexes.   L’estructura   dels   introns   és   important:   es   pleguen  de  tal  manera  que  estan  propers  a  l’espai  amb  els  exons.  Això  limita  l’evolució,  ja  que  s’ha  de   conservar  l’estructura  de  l’intró.  Per  aquesta  raó  va  sorgir  la  maquinària  de  l’espliceosoma,  per  evitar  la   conservació  de  l’estructura  dels  introns  i  no  limitar  l’evolució.
Pels introns de tipus I i II no calen proteïnes,   però   l’estructura   dels   introns   és   necessària   per   la   seva   eliminació.  Pels  introns  de  tipus  III  cal  l’espliceosoma:  es  perd  evolutivament  l’estructura  de  l’intró,  només   es manté la dels extrems, i es substitueix per un complex multi-proteic que reconeix els extrems, l’espliceosoma.
PROCESSAMENT DELS INTRONS DE TIPUS I Els introns de tipus I tenen estructures secundaries complexes. La major part de la seqüència és important  per  l’splicing de  l’intró. Són introns lineals.
El  mecanisme  d’eliminació  és  el  mateix,  amb  la  diferència  que  no  són  necessàries  proteïnes.  Els  introns de tipus I tenen un centre actiu amb un nucleòtid G que realitza la primera reacció.
PROCESSAMENT DELS RNAr EN EUCARIOTES Els RNAr solen tenir moltes còpies seguides en els cromosomes. Els RNAr no solen tenir molts introns, però   s’han   d’eliminar   els   fragments no codificants. Aquests fragments no són introns, sinó RNA no codificant entre gens.
Els  diferents  RNAr  deriven  d’un  únic  transcrit  primari  que  conté  els  3  RNAr.
S =sverter (coeficient de sedimentació) En eucariotes, els snoRNA (small nucleolar RNA) ajuden a dirigir les metilacions i al trencament del RNA per alliberar els 3 RNAr.
PROCESSAMENT DELS RNAt Els   RNAt   solen   tenir   bases   modificades.   En   l’extrem   3’   (on   s’uneix   l’aminoàcid),   tenen   una   cua   CCA,   afegida per la tRNA nucleotidil transferasa. Tenen introns de tipus IV, que són processats per enzims que reconeixen  l’estructura  de  l’enllaç.
El  processament  es  duu  a  terme  en  2  passos:  una  nucleasa  reconeix  l’intró  i  una  lligasa  junta  els  dos   extrems.
Existeixen enzims que processen els RNAt pels extrems.
CODI GENÈTIC CODI GENÈTIC El codi genètic és un codi de 3 lletres, ja que és la única manera de combinar les 4 bases existents per poder llegir els 20 aminoàcids diferents: 4 3 = 64 opcions.
Els triplets de nucleòtids que codifiquen els aminoàcids  s’anomenen  codons.  La  seqüència  d’aminoàcids   d’una  proteïna  està  definida  per  una  seqüència  linear  continua  de  codons.
Els codons no es sobreposen (no comparteixen nucleòtids), sinó que es llegeixen de 3 en 3. Entre codons no hi ha signes de puntuació.
El codi genètic no és ambigu: cada codó codifica per un aminoàcid determinat. I també és degenerat, ja que  cada  aminoàcid  és  codificat  per  més  d’un  codó.
Només  hi  ha  un  codó  d’iniciació  (AUG)  i  3  codons  STOP.
MARC DE LECTURA (READING FRAME) En una seqüència de DNA hi ha tres possibles marcs de lectura (reading frames).
El primer codó estableix el marc de lectura. Per tant, el ribosoma ha de trobar el primer codó del missatger per establir el marc de lectura correcte. Només un marc de lectura codifica per una proteïna.
El marc de lectura obert (open reading frame) és el marc de lectura que codifica per una proteïna.
El mecanisme de reconeixement del primer codó varia segons si es tracta de cèl·lules eucariotes o procariotes. En les cèl·lules procariotes   es   produeix   per   aparellament   complementari   entre   l’RNAm   i   l’RNAr  de  la  subunitat  petita.  En  eucariotes,  en  canvi,  es  reconeix  la  regió  k.
CARACTERÍSTIQUES DEL CODI GENÈTIC - És  degenerat:  hi  ha  aminoàcids  codificats  per  més  d’un  triplet - No és ambigu: cada triplet codifica per un aminoàcid determinat - Els  triplets  es  llegeixen  en  sentit  5’3’ - Els codons no es sobreposen, no comparteixen nucleòtids - És gairebé universal: tots els organismes tenen més o menys el mateix CODI GENÈTIC EN ALGUNS ORGÀNULS En alguns orgànuls, el codi genètic presenta lleugeres diferències a causa de mutacions que han aparegut  al  llarg  de  l’evolució.
Les mutacions més freqüents són aquelles en què el codó STOP varia. En canvi, les mutacions que fan variar aminoàcids són menys freqüents.
ADAPTADORS Al 1955, Crick va predir que existien unes molècules adaptadores que llegien el codi genètic del RNAm i li assignaven un aminoàcid.
Els  adaptadors  són  els  RNAt.  L’anticodó  del  RNAt  s’aparella  de  forma  antiparal·lela  amb  el codó.
No  hi  ha  comprovació  de  l’aminoàcid,  només  de  l’aparellament  codó-anticodó.
No hi ha un RNAt per cada codó. El nombre de RNAt és inferior al nombre de codons: hi ha RNAt que reconeixen  més  d’un  codó.
Alguns  RNAt  tenen  en  la  posició  1  de  l’anticodó una base modificada poc comú: inosina. La primera base de  l’anticodó  pot  reconèixer  més  d’una  base  del  codó.
HIPÒTESI DEL BALANCEIG (WOBBLE) 1. Les  dues  primeres  bases  d’un  codó  sempre  formen  aparellaments  forts  del  tipus  Watson  i  Crick amb   les   corresponents   bases   de   l’anticodó   i   confereixen   la   majoria   de   l’especificitat   del   codi   genètic.  L’aparellament  entre  les  dues  primeres  bases  és  el  més  determinant.
2. La  primera  base  d’alguns  anticodons  determina  el  número  de  codons  que  por  llegir  el RNAt. És a dir,  permet  a  un  mateix  RNAt  reconèixer  més  d’un  codó.  El  nombre  màxim  de  codons  que  pot  llegir   un RNAt és 3.
3. Quan  un  aminoàcid  és  codificat  per  més  d’un  codó,  aquells  que  es  diferencien  en  alguna  de  les   dues primeres bases són reconeguts per RNAt diferents.
4. Per a traduir els 61 codons són necessaris com a mínim 32 RNAt (31 + 1, el de la Met iniciadora).
Hi ha dos RNAt per la metionina: un per la Met inicial i un per les que es troben dins la proteïna.
ESTRUCTURA DELS RNAt Els RNAt són transportats al ribosoma per unes proteïnes. Els transportadors difereixen segons si són iniciadors  o  d’elongació.
Els  RNAt  tenen  una  estructura  secundaria  característica:  4  braços  que  s’anomenen  diferent  segons  les   bases que hi predominen.
L’estructura  3D  dels RNAt és un plegament en forma de L.
La  base  en  la  posició  5’  de  l’anticodó  és  la  que  té  més  llibertat  de  rotació.  Té  llibertat  de  moviment  ja   que   no   es   troba   encabida   entre   dues   bases,   el   que   li   permet   reconèixer   més   d’una   base.   Les  altres   bases, en canvi,  estan  fixes  (no  tenen  rotació)  i  són  les  que  donen  l’especificitat  al  codi  genètic.
TRADUCCIÓN TRADUCCIÓN El mecanismo de traducción es similar tanto en eucariotas como en procariotas. La traducción es el paso de un alfabeto de 4 letras (4 nucleótidos del RNA) a un alfabeto de 20 letras (20 aminoácidos). Tiene lugar en los ribosomas, que son macrocomplejos formados por 3 RNA distintos (RNAr) y por más de 50 proteínas ribosomales. La mayoría de las proteínas son prescindibles: facilitan el proceso de traducción pero no son esenciales. Son ribozimas compuestos por 2 subunidades, cuya parte funcional son los RNAr que los forman (un ribozima es un RNA con actividad catalítica). Esto lleva a la hipótesis que sitúa el RNA como inicio de la vida.
En la síntesis proteica participan tanto RNAm, RNAt, que son las moléculas adaptadoras entre los dos códigos (nucleótidos – aminoácidos), y RNAr. Hay una unión específica de un aminoácido para cada RNAt.
La traducción consiste en la adición sucesiva de aminoácidos en el extremo carboxilo de la cadena peptídica en crecimiento y en la formación del enlace peptídico.
La cadena crece desde el extremo N-terminal hacia el C-terminal. El extremo N-terminal se conserva.
ETAPAS Y COMPONENTES REQUERIDOS EN LA SÍNTESIS PROTEICA ETAPAS DE LA TRADUCCIÓN La traducción conlleva diferentes etapas: 1. Activación de los aminoácidos 2. Iniciación 3. Elongación 4. Finalización y liberación de la cadena Tanto la iniciación como la elongación y la finalización tienen lugar simultáneamente. Además, las tres fases coinciden con la intervención de una serie de factores, proteínas esenciales para la síntesis.
ACTIVACIÓN DE LOS AMINOÁCIDOS ESTRUCTURA DE LOS RNAt Los  RNAt  se  leen  en  dirección  5’3’.  Poseen  un  fosfato  libre  en  el  extremo  5’  y  un  OH  libre  en  el   extremo   3’,   donde   cargan   el   aminoácido.   Además   de   poseer   3   aminoácidos   característicos   en   el   extremo   3’:   ACC,   que   no   varían.   Los   diferentes   RNAt   poseen   características   comunes   entre   ellos,   pero no son idénticos. La presencia de nucleótidos modificados en los RNAt es muy frecuente: evita que se formen enlaces por complementariedad, lo que permite conservar la estructura de la molécula.
El codón del RNAm y el anticodón del RNAt son complementarios y antiparalelos. El aminoácido se une en  el  extremo  3’  del  RNAt  para  formar  un  aminoacil-tRNA.
Las aminoacil-tRNA sintetasas catalizan la unión de un aminoácido a su correspondiente RNAt. Son unas actividades enzimáticas que cargan un aminoácido a su correspondiente anticodón. Interpretan el código genético. Las aminoacil-tRNA sintetasas tienen un centro catalítico y un centro corrector: en uno se coloca el aminoácido y el otro verifica que el aminoácido colocado es el correcto. La tasa de error de la aminoacil-tRNA sintetasa es de 1 cada 104.
Generalmente, hay una aminoacil-tRNA sintetasa para cada aminoácido.
Las aminoacil-tRNA sintetasas llevan a cabo 2 reacciones: - La activación del aminoácido por unión a AMP - La transferencia del aminoácido activado a su correspondiente RNAt La primera reacción no es termodinámicamente favorable a no ser que se hidrolice el pirofosfato. La segunda reacción depende del producto de la primera.
Existen 2 tipos de aminoacil-tRNA sintetasa que difieren en su actividad catalítica, aunque el resultado final es el mismo para ambas.
Una de las aminoacil-tRNA sintetasas posee un estado intermedio: el aminoacil es transferido a posición  2  y  es  convertido  a  posición  3’.
Las aminoacil-tRNA sintetasas de clase II suelen ser dímeros o tetrámeros, mientras que las que clase I suelen ser monómeros.
La mayor parte de las aminoacil-tRNA sintetasas controlan centros de corrección (catalíticos) además de los de activación (Ej.: El centro de corrección de la treonil-tRNA sintetasa hidroliza la Ser-tRNAThr (RNAt cargado de manera errónea) pero no la Thr-tRNAThr).
El   extremo   3’   de   los   RNAt   puede   moverse   del   centro   catalítico   al   centro   corrector,   donde   se   puede   editar sin disociarse de la sintetasa.
Las aminoacil-tRNA sintetasas son las únicas moléculas que conocen el código genético. El mecanismo de reconocimiento de la aminoacil-tRNA sintetasa difiere para cada aminoácido y para cada pareja sintetasa-tRNA. Los enzimas reconocen regiones determinadas del tRNA, que no siempre coinciden con la región del anticodón.
Las aminoacil-tRNA sintetasas reconoces el brazo receptor. No todas reconocen en loop del anticodón del RNAt.
RIBOSOMAS En los ribosomas, no se encuentran proteínas a menos de 18 𝐴̇ del centro activo. El RNAr no tiene una función estructural, sino catalítica, por lo que se cree que pudo ser el componente original del ribosoma.
Por ello son ribozimas.
En bacterias hay unos 20.000 ribosomas por bacteria, lo que representa 1 4 de la masa bacteriana.
Los ribosomas de eucariotas y procariotas poseen una estructura semejante, pero se diferencian en tamaño: los ribosomas de eucariotas son de mayor tamaño que los de procariotas.
Las proteínas empiezan su síntesis por el extremo N-terminal. Los RNAm se empiezan a leer por el extremo  5’.  Es  decir,  se  leen  en  la  misma  dirección  en  que  se  transcriben (el sentido de la traducción es el mismo que el de la transcripción).
En procariotas, debida a la ausencia de núcleo, el ribosoma se une al RNAm a medida que se va transcribiendo. El RNAm puede ser traducido simultáneamente por muchos ribosomas (polisomas).
El RNAr juega un papel central en la función de los ribosomas (representa 2/3 de la masa). La actividad peptidil transferasa, la de la formación del enlace peptídico, corresponde al RNAr 23S. Las proteínas están localizadas en la superficie ribosomal y tienen una función estructural. No son esenciales para la actividad catalítica.
Existen tres sitios donde se fijan los RNAt. El sitio de unión de los RNAt se encuentra en la interfase entre las subunidades ribosomales (formado por RNAr).
E = exit (sitio de liberación del RNAt), P = peptidil (sitio de formación de la proteína, el RNAt se encuentra unido al péptido creciente. Sitio de unión del RNAt de la formilmetionina), A = aminoacil (sitio de unión de los aminoacil-tRNA) Mientras que en procariotas los ribosomas tienen 3 centros activos, en eucariotas sólo hay 2, el sitio E no existe.
CICLO RIBOSOMAL 1. Unión de la subunidad pequeña al RNAm y al RNAt cargado con el primer aminoácido: formilmetionina 2. Unión de la subunidad grande 3. Disolución del complejo INICIACIÓN El primer aminoácido es una metionina modificada: la formilmetionina.
SECUENCIA INICIADORA EN PROCARIOTAS En procariotas, no siempre la primera metionina es el codón de inicio. La secuencia Shine-Dalgarno se encuentra a unos 10 nucleótidos upstream del codón de inicio. Esta secuencia es complementaria a  una  secuencia  consenso  presente  en  el  extremo  3’  del  RNAr  16S.
La interacción entre estos RNA (RNAr – RNAm) posiciona el codón de iniciación AUG en el sitio P del ribosoma para iniciar la síntesis de proteína.
En procariotas, el aminoácido iniciador es la N-formilmetionina. La metionina se formila después de unir-se al RNAt iniciador (tRNAfMet), diferente del tRNAMet. Existe una única Met-tRNA sintasa que carga el tRNAfMet y el tRNAMet.
Durante la traducción, los ribosomas tienen 3 moléculas de RNAt que hacen de puente entre los sitios A, P y E de la subunidad 30S y 50S. El RNAm se encuentra unido a la subunidad 30S.
El fMet-tRNAfMet es el único que entra en el sitio P del ribosoma, los demás entran por el sitio A.
El IF3 se une a la subunidad 30S y bloquea la unión de la subunidad grande hasta que se une el RNAm a la subunidad pequeña. El IF1 evita la unión de otros aminoacil-tRNA en el sitio A, ocupándolo.
La IF2, una proteína G con actividad GTPasa, transporta el fMet-tRNAfMet al ribosoma. De esta manera se forma el complejo de iniciación 30S.
Cuando se forma el aparejamiento codón-anticodón se liberan los IF1 y IF3 y entra la subunidad 50S.
El ensamblaje de las subunidades del ribosoma indica que hay actividad traductora, sino se mantienen separadas.
La subunidad grande activa la actividad GTPasa del IF2, hidrolizando el GTP y liberándose. De esta manera se forma el complejo de iniciación 70S.
El ribosoma ya está preparado para la fase de elongación: los sitios E y A están libres y la fMettRNAfMet se encuentra en el sitio P.
ELONGACIÓN El resto de los aminoacil-tRNA son transportados al sitio A del ribosoma asociados al EF-Tu. El EF-Tu también es una proteína G, y requiere GTP para unirse al aminoacil-tRNA y al ribosoma. Cuando se ha formado correctamente la unión codón-anticodón, el GTP se hidroliza. La energía de la hidrólisis contribuye a la fidelidad de la síntesis. Una vez hidrolizado el GTP, el EF-Tu sale del ribosoma. El EFTu unido a GDP no tiene afinidad por los aminoacil-tRNA.
El intercambio de GDP por GTP es catalizado por el EF-Ts: elimina el GDP e introduce GTP para activar de nuevo el EF-Tu. El EF-Tu no interacciona con el fMet-tRNAfMet, por lo que no es transportado al sitio A.
La elongación es un proceso cíclico en el que se introducen los aminoacil-tRNA complementarios al codón y se genera el enlace peptídico FORMACIÓN DEL ENLACE PEPTÍDICO El RNAr 23S, que interacciona con los extremos CCA de los RNAt, es responsable de la actividad peptidiltransferasa. El grupo amino de los aminoacil-tRNA del sitio A ataca el enlace éster entre el tRNAMet y la fMet del sitio P.
De esta manera, la fMet del sitio P se une al segundo aminoácido y se forma un enlace peptídico. Los dos aminoácidos están unidos al RNAt del segundo aminoácido. Se produce un desplazamiento del ribosoma a lo largo del RNAm que coloca el RNAt con los dos aminoácidos en el sitio P. El primer RNAt pasa al sitio E, de donde se desprenderá del ribosoma.
El EF-G (translocasa) es una GTPasa que sólo se une al ribosoma cuando tiene GTP unido. El EF-G se une en el sitio A de la subunidad grande. Cuando se hidroliza el GTP, provoca un cambio conformacional del EF-G que hace que ocupe el sitio A de la subunidad pequeña y empuje el RNAt al sitio P.
Hipótesis de cómo se produce el movimiento del ribosoma La disociación del EF-G deja el ribosoma preparado para un nuevo ciclo. Este proceso cíclico se repite para cada uno de los aminoácidos de la proteína.
FINALIZACIÓN Los codones de finalización no son reconocidos por ningún aminoacil-tRNA y sí por proteínas llamadas factores de liberación (RF): RF1 y RF2; el RF3 no reconoce ningún codón, sino que ayuda. Los RF activan la hidrólisis del enlace entre el péptido y el último RNAt: la actividad peptidil transferasa transfiere el polipéptido a una molécula de agua en el sitio de un aminoácido. El último RNAt se libera desde el sitio P.
Liberación del péptido y desensamblaje del complejo El factor de reciclaje del ribosoma (Ribosome Release Factor o RRF), junto con el EF-G, son necesarios para la liberación del RNAm, el RNAt y las dos subunidades ribosomales de manera dependiente de GTP.
TRADUCCIÓN EN EUCARIOTAS La traducción en eucariotas posee los mismos fundamentos estructurales y mecanismos que la traducción en procariotas. La diferencia está en que los pasos son más complejos e intervienen más proteínas.
DIFERENCIAS CON LA TRADUCCIÓN EN PROCARIOTAS Las principales diferencias se encuentran en la fase de iniciación de la traducción.
- Ribosomas de 80S: 60S + 40S - El aminoácido indicador es la Met y no la fMet, aunque se carga en un RNAt diferente del de la Met de la cadena - El codón de inicio es siempre AUG y no posee la secuencia rica en purinas (Shine-Dalgarno). El codón de inicio  es  el  AUG  que  se  encuentra  más  cerca  del  extremo  5’  del  RNAm,  por  lo  que  el   mecanismo de reconocimiento es diferente - El complejo elF4F se desplaza a lo largo del RNAm para encontrar el primer AUG. Se requiere una actividad helicasa porque el RNAm es propenso a tener estructuras secundarias La   estructura   del   RNAm  es  circular:   el   CAP   de   5’  y   la   cola   poliA   de   3’   están   unidos   al   mismo   complejo de factores - Hay un único factor de finalización Lo que se desplaza es el complejo de factores con el primer RNAt y la subunidad pequeña del ribosoma. Este movimiento requiere un gasto de energía Los mecanismos de traducción de procariotas también son los mismos que para mitocondrias y cloroplastos.
COSTE ENERGÉTICO DE LA TRADUCCIÓN Un error en la traducción provoca un gasto energético adicional, ya que hay que repararlo. Cada enlace peptídico tiene un coste de 4 enlaces de alta energía que se gastan para obtener una mayor fidelidad del proceso (disminución de la tasa de error).
INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS Los inhibidores de la síntesis de proteínas son compuestos comúnmente utilizados como antibióticos. La mayoría actúan a nivel del ribosoma, algunos modifican el RNAr disminuyendo su actividad.
PUROMICINA Es un compuesto análogo de los aminoacil-tRNA de eucariotas y procariotas, tiene una estructura similar.
Entra en el sitio A del ribosoma, se une covalentemente al último aminoácido y provoca la finalización prematura de la síntesis proteica.
TETRACICLINA Se une al sitio A de la subunidad pequeña, bloqueando la entrada de los aminoacil-tRNA. Actúa en procariotas y mitocondrias.
CLORAMFENICOL Inhibe la peptidil transferasa de la subunidad ribosomal 50S en procariotas y mitocondrias.
STREPTOMICINA En procariotas, provoca errores en la lectura de los RNAm a bajas concentraciones. A altas concentraciones inhibe la iniciación al interferir con la unión de la fMet-tRNAfMet a los ribosomas.
CILOHEXIMIDA Inhibe la actividad peptidil transferasa de la subunidad 50S en eucariotas.
TOXINA DE LA DIFTERIA Producida por Corynebacterium diphtheriae provoca la modificación covalente (o ADP-ribosilación) del eEF2 (translocasa), deteniendo la translocación de la síntesis proteica en eucariotas.
RICINA Producida por Ricinus communis, la ricina es el tercer tóxico más conocido. El compuesto tiene actividad N-glicosida sobre el nucleótido de adenosina 4324 del RNAr 28S (conservado). Evita la unión de los factores de elongación, por lo que inactiva del todo el ribosoma. La dosis letal de ricina en un adulto es de 500 𝜇g.
PLEGAMIENTO Y PROCESAMIENTO POSTRADUCCIONALES Después de la traducción se debe pasar de una cadena lineal a una cadena con estructura tridimensional (conformación nativa). Esta conformación no depende del ribosoma, sino de las diferentes interacciones entre los grupos de aminoácidos. Este paso se realiza gracias a interacciones débiles: puentes de hidrógeno, interacciones de Van der Waals, interacciones iónicas e interacciones hidrofóbicas.
El plegamiento suele ser cotraduccional.
Modificaciones postraduccionales: - Eliminación de los residuos N-terminal (fMet,  Met…) - Modificación de los residuos N-terminal y/o C-terminal (N-acetilación…) - Pérdida de las secuencias señal del extremo N-terminal: se eliminan las secuencias que determinan el destino de la proteína - Modificaciones de aminoácidos individuales (fosforilación,   carboxilación…)   que   implican   una   modificación de la proteína - Adición de cadenas carbohidratadas (N- a Asn o O- a Ser o Thr) - Adición  de  grupos  isoprenil  (Ras  y  otras  proteínas  G,  lamins…):  adición  de  grupos  hidrofóbicos - Adición de grupos prostéticos  (hemo  a  la  hemoglobina  o  citocromo  c…) - Procesamiento  proteolítico  (proinsulina,  tripsinógeno…) - Formación de puentes disulfuro, importantes para la estructura de la proteína El plegamiento no siempre se consigue. Por esta razón, existen mecanismos celulares para eliminar las proteínas mal plegadas.
...