Resum 2n Parcial (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 20
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 3
Subido por

Vista previa del texto

ANÈMIA  DE  FANCONI   Autosòmica recessiva (subtipus lligat a X) 1/400.000 rara CLÍNICA: És un defecte en els mecanismes de reparació del DNA.
- Problemes sanguinis: o Pancitopènia: baix numero de cèl·lules sanguínies, tant glòbuls blancs (problemes immunològics), vermells (anèmia i debilitat).
o Bone marrow failure la medul·la no funciona be pel que es formen menys cèl·lules sanguínies o Anèmia pel baix nombre de cèl·lules sanguínies que hi ha - Malformacions en: polzes, dits, esquelètiques (braços curts), anomalies ronyó o cor, microcefàlia i microftàlmia, microsòmia (baixos), problemes GI i hipogonadisme (homes) - Predisposició a càncer de MAMA I OVARI - Risc a desenvolupar TUMORS SÒLIDS i LEUCÈMIA MIELOIDE CRÒNICA (hematològics) o Sobretot SCC (carcinoma de cèl·lules escamoses) al coll i cap - Cèl·lules sensibles a radioteràpia i quimioteràpia (difícil tractament).
- Resposta inflamatòria anormal (moltes citoquines)...
A nivell de cèl·lula: - Inestabilitat cromosòmica - Sensibilitat a oxigen i aldehids - Excés apoptosi - Problemes en reparació de ruptures dobles del DNA NO es diagnostiquen quan SÓN PETITS, sinó entre 5-10 anys, quan es fa evident l’anèmia com a conseqüència de la bone marrow failure. Al néixer tenen poques HSC però suficients, amb el temps es van morint pels errors que acumulen i es fa present la bone marrow failure. à possible implicació amb la mala reparació del dany que produeixen els aldehids que hi ha en el nostre cos de forma normal. Els models postulen que poden morir com a causa del procés apoptòtic controlat per p53, per l’acumulació de citocines o bé de alteracions cromosòmiques.
La predisposició a càncer s’explica perquè, si les cèl·lules tenen errors al DNA, poden morir o sobreviure i acumular mutacions, el que acaba produint càncer. à implicació via BRCA Defectes en la reparació ICLR (Interstrand crosslink repair): normalment quan hi ha una unió intercadena la forquilla de replicació queda parada, es fa un gap gràcies als enzims de reparació i es repara per recombinació homòloga.
A la FA, es generen trencaments cromatídics que es fusionen amb altres cromosomes, formant estructures triradials o quadriradials. (eina diagnòstica).
DIAGNÒSTIC PRIMARI: à Test amb DEB: avalua el nivell de fragilitat cromosòmica de les cèl·lules. Es fan tres cultius, dos dels quals es tracten amb DEB (Diepoxibutà), que és un agent que genera DNA crosslinker.
Es paren les metafases i es miren al microscopi. à en els pacients de FA les cèl·lules tractades amb DEB presenten un nombre molt elevat de trencaments/cèl·lula.
à Test amb MMC (explicat més endavant)   1   Mosaicisme i complicacions al diagnòstic amb DEB: Important tenir en compte l’elevat nombre d’afectats en MOSAIC (20% d’afectats). Això es pot deure en molts casos perquè un afectat en línia somàtica per FA, s’hi ha donat una mutació reversa que ha revertit el fenotip, les cèl·lules s’han dividit, i, per tant, hi ha dues poblacions cel·lulars. Això COMPLICA EL DIAGNÒSTIC. à Estudiar fibroblasts de la pell.
Gens mutats 16 en total (actualment s’ha trobat un 17è, FANCS). 5 amb predisposició al càncer de mama.
FANC-B està al cromosoma X, per tant si està mutat hi hauria una herència XL.
Tots els gens implicats en la via de reparació d’intercrosslinks / via BRCA = MATEIX FENOTIP (produït per diferents mutacions en gens FANC), l’important no és quina molècula de la via estigui afectada, sinó que s’afecti la via, sigui com sigui.
Les cèl·lules de FA no són resistents a MMC (myomycin C – DNA closslinker), amb poca dosi, ja moren. És una altra eina de diagnòstic.
DIAGNÒSTIC GENÈTIC A Espanya, la majoria són FA-A (mutació a FANC-A). Hi ha una mutació típica de gitanos d’Espanya.
- Estratègia UAB per Genotipar 143 pacients (FANC-A): o MLPA + seqüenciació dels exons més mutats: 13,36 i 38 o Després els altres exons, de més a menys freqüència mutats Mutacions recurrents al món: - Gitanos espanyols-- > 295 C>T de FANCA.
- Test de complementació + MMC + seqüenciació Transferir a les cèl·lules FA el gen A, B, C o D i fer un test de MMC, per veure si es restableix la resistència a aquest, si no es restableix, provar un altre gen. Un cop se sospita quin gen és, seqüenciar.
- Seqüenciació: detecció de MUTACIONS PUNTUALS Es fa una PCR amb primers intrònics.
- MLPA: detecció de GRANS DELECIONS i DUPLICACIONS Es necessita molt poc DNA, també permet detectar TRISOMIES.
Es molt fiable, però tenim un problema amb els pseudogens (com per exemple el de FANCD2, que no s’expressa), per evitar detectar-los amb la MLPA - seqüenciem cDNA (es a dir, el gen que s’expressa) - o bé dissenyem primers que només s’uneixen al gen.
- Whole exome sequencing Important assegurar una bona cobertura. Tècnica bona per detectar NOVES MUTACIONS també GRANS DELECIONS a través de l’anàlisi de la cobertura.
  2   FANCQ (ERCC) implicat en 3 patologies Codifica per la XFP nucleasa, que participa en 2 vies: - NER (reparació per escissió de nucleòtids), que es dona quan hi ha dímers de T (produïts per llum UV) - ICLR(reparació d’intercrosslinks) Depenent de la mutació en ERCC tindrem 3 síndromes: - XP: Afectat NER, baixa UDS (unscheduled DNA synthesis, la de NER) i sensibilitat a llum - FA: afectat ICLR, tenen anèmia - Progeria: Afectats NER i ICLR, tenen sensibilitat a llum i anèmia TRACTAMENT Tradicional - Andrògens, EPO (danazol): per estimular que es produeixin cèl·lules sanguínies - Transfusions de sang - Trasplantament d’HSC fent: o Trasplantament de medul·la òssia: § Problemes: compatibilitat HLA, GVHD (graft vs host disease), pacients de FA son hipersensibles a Qt/Rt (malament per fer immunosupressió), tumors secundaris. à pràcticament el 100% dels trasplantatsà CONTROL ESTRICTE o Sang de cordó umbilical (UCB) o HSC mobilitzades Basat en la genètica - Save sibling / Saviour baby: seleccionem un embrió per DGP perquè sigui histocompatible i a més, sa. Probabilitat, 3/16. Probabilitat empírica, menor.
- Teràpia gènica: basat en aïllar les HSC CD34+ de la medul·la òssia, es corregeix el genotip mitjançant TRANSDUCCIÓ amb un vector lentiviral i es fa un trasplantament al nen. NO HI HA PROBLEMES DE GVHD. El vector lentiviral és millor i més segur (promotor dèbil). Resultats bons en ratolins o Es recomana fer FANCOSTEM I FANCOLEM. És a dir, extreure les HSC CD34+ quan el pacient és jove, esperar si surt donant, i si no, fem la teràpia gènica quan els símptomes ja siguin greus - Estudis amb mutació reversa Futur - Inducció de iPS des de fibroblasts: es basa en agafar fibroblasts del pacient, fer teràpia gènica per arreglar el gen, i mitjançant uns FT aconseguir que passin a iPS, llavors mitjançant citoquines que passin a HSC: o Problema: es necessiten factors estressants per les cèl·lules que activen vies de resposta al dany en el DNA, com la de p53, per tant, moltes cèl·lules moren. Si inhibim la resposta de p53 s’aconsegueix una lleugera millora.
- Genome editing: aconseguir corregir la mutació per o Reparació de la mutació amb § Nucleases: Zinc finger, Talen, CRISPR/Cas9. Es faria un DSB al gen que es reparà per NHEJ, llavors si té errors, es pot revertir la mutació § Recombinació homòloga: es fa un DSB al gen i es posa un plasmidi amb el gen correcte, per recombinació, el gen correcte s’integrarà o Trobar un lloc segur (save harbour) per integrar el gen: el locus AAVS1 és considerar un save harbour. Es fa utilitzant un vector amb braços homòlegs   3   Les teràpies per corregir el gen en FA, en resum són: Les cèl·lules es poden agafar del pacient HSCCD34 + quan és jove i congelar-les o bé fer unes iPS i després reprogramar-les.
Malaltia pionera (la primera en): transplantament de sang de cordó umbilical, save sibling, estudis de teràpia gènica, la primera en generar iPS sanes, model per entendre processos biològics, estudiar més fàrmacs i gens pel càncer.
PRADER  –  WILLI  i  ANGELMAN  (1)   ANGELMAN: hiperactius, retràs mental, atracció aigua PRADER-WILLI: hipotonia, hipogonadisme, TOC CAUSA GENÈTICA Regió d’imprinting 15q11-13: - Normal: s’expressa UBE3A del matern perquè IC-AS metila IC-PW i ZNF127, NDN, SNRPN i IPW del patern, gràcies a que IC-PW no està metilat i es pot expressar.
PW: falta copia paterna. Només s’expressa UBE3A i no la resta.
o Causes: deleció al·lel patern, disomia materna, mutació centre IC, translocació equilibrada AS: falta copia materna. No s’expressa UBE3A.
o Causa: deleció al·lel matern, disomia paterna, mutació en UBE3A (de novo o heretada), mutació imprinting i translocació equilibrada.
o UBE3A s’expressa en cervell i es una ubiquitin ligasa. S’acumulen productes al cervell.
DIAGNÒSTIC GENÈTIC -   Normal: 1 metilat (mare) 1 no metilat (pare) AS: 2 no metilats, o bé un (si hi ha deleció) PW: 2 metilats, o bé un (si hi ha deleció) 4   - Anàlisi de metilació Pels gens SNRPN i D15S63, estan metilats diferencialment, per dos mètodes: - Southern blot: enzims de restricció sensibles a metilació, no tallen si les C estan metilades - MS_PCR + bisulfit (Cà U, Cm àC): i es fan primers específics, amb C i U. AS té els dos metilats i PW els dos no metilats.
- FISH/Cariotip: Per detectar reordenacions cromosòmiques (cariotip) i delecions (FISH).
Diferents sondes segons el síndrome.
- Anàlisi de microsatèl·lits: Permet determinar l’origen dels cromosomes d’un individu (isodisomia o heterodisomia) - MS – MLPA Ens permet determinar el patró de metilació o si hi ha delecions en els cromosomes.
2 fases: - La primera MLPA normal, per detectar s hi ha deleció o no - La segona, amb enzims sensibles a metilació, si no està metilat talla i no hi haurà pic, si ho està, si - Anàlisi de l’IC Si totes les proves anteriors han donat negatiu.
Es fa per seqüenciació o MS-MLPA.
- Anàlisi de UBE3A: Per aquells casos de AS que són deguts a mutacions en el gen.
Per seqüenciació directa dels exons del gen.
TRACTAMENT -   PW: GH (hormona creixement) per enfortir musculatura i fàrmacs si hi ha mal comportament AS: teràpies per parlar, fàrmacs anti-epilèptics, sedants (afavoreixen son), tractament experimental per intentar activar UBE3A patern.
5   CONSELL GENÈTIC Es pot fer: - DGP quan hi ha un progenitor portador. Difícil avaluar estat de metilació - DP per extracció de vellositats coriòniques o amniocentesi. Quan pares tenen alguna alteració a la regió o per detectar trisomia del 15, quan hi ha edat materna avançada o per detectar translocacions robertsonianes al 15.
Edat materna avançada es un factor de risc de recurrència per disomia materna.
Implicacions ètiques: - PW: per falta de control de la ingesta, es pot acceptar que pot decidir, seguir una mica de control o hospitalitzar-loà autonomia vs necessitat d’atenció - Tenen un comportament autista, sense RM, no poden adaptar-se, ser empàtics, interpreten el llenguatge literalment i tenen memòria a curt termini. àL’educació és una gran ajuda MALALTIES  MITOCONDRIALS  (2)   Malalties que afecten funció mitocondrial i els òrgans que necessiten més energia: cervell, cor, múscul...
CAUSA GENÈTICA Pot trobar-se al DNA mitocondrial o al DNA nuclear. La taxa de mutació de novo al nucli és de 10-10 mentre que al mitocondri és 20 vegades major.
- Un mitocondri = molts genomes à pot haver-hi genomes mutats i wt Una cèl·lula = mitocondris wt i mutats o A la divisió cel·lular es reparteixen a l’atzar - Un teixit = cèl·lules afectades i no afectades - Llindar fenotípic: percentatge de mitocondris afectats mínim per expressar malaltia - HETEROPLÀSMIA à complexitat Ens fixarem en mutacions en DNA mitocondrial DIAGNÒSTIC GENÈTIC - Seqüenciació - Sangerà problemes si hi ha barreja de DNAs i amb els homopolímers - NGSà respon bé a l’heteroplàsmia, però es molt cara - HRM profiling (High Resolution Melting Profiling) S’analitza la Tm, comparant ssDNA i dsDNA sota les mateixes concentracions. Posem SYBRgreen (que nomes emet quan s’uneix a dsDNA) i el DNA a baixa temperatura, anem incrementant la temperatura, això ens genera una gràfica on la quantitat de fluorescència va baixant. El pic es la Tm. Si comparem la Tm de la gràfica control amb les de les mostres problema, podrem saber el PERCENTATGE D’HETEROPLÀSMIA.
- dHPLC Aprofita els homoduplex i heterodúplex el que fem es desnaturalitzat i hibridar. Fem una HPLC sobre els 50ºC, de manera que els hetero son menys estables que els homo i surten abans de la columna. El PERCENTATGE D’HETEROPLÀSMIA es calcula mitjançant l’alçada relativa dels pics obtinguts en l’electroforograma.
  6   - TTGE (Temporal Temperature Gradient gel Electrophoresis) Fem un gel on a mida que el DNA corre es va desnaturalitzant (amb Tª), els homoduplex corren més i van a baix i els heterodúplex dalt.
El PERCENTATGE D’HETEROPLÀSMIA es calcula mitjançant la intensitat relativa de les bandes dels homo i heterodúplex.
- Miniseqüenciació: SNaPshot Detecta una MUTACIÓ ESPECÍFICA.
Sondes específiques que cauen abans del SNP i dDNTPs marcats amb fluorescència. Amb l’anàlisi de la fluorescència podem saber quin nucleòtid hi ha. Amb l’anàlisi del % de fluorescència de cada nucleòtid, el PERCENTATGE D’HETEROPLÀSMIA.
- Invader assay Utilitza 3 oligonucleòtids per detectar una MUTACIÓ ESPECÍFICA.
- el primer, alinea 5’ adjacent a la mutació i deixa una regió no alineada pel seu 5’ (5’FLAP) - el segon, també anomenat invader alinea al punt de la mutació. Si s’alinea correctament amb la mutació llavors es deixarà la 5’FLAP sense hibridar i el 5’FLAP es tallarà.
- El tercer, o la FRET probe té un quencher i un fluoròfor.
És parcialment homòleg a la 5’FLAP, si s’uneixen, serà tallat i s’alliberarà fluorescència.
Fluorescència à hi ha la mutació - Real time qPCR es calcula la quantitat de DNA inicial a partir de la quantificació del DNA durant la PCR. Es pot utilitzar per quantificar el PERCENTATGE D’HETEROPLÀSMIA mitjançant la quantificació de la fluorescència o bé - Allele specific probes Sondes específiques per la mutació, si hi alineen, s’allibera fluorescència - ARMS 3 sondes, una universal i dues específiques, una per cada variant electroforograma.
Alineen els oligos que tenen un match mínim i amplifiquen. Capacitat de discriminar entre motlles que difereixen en una base. Es la que més s’utilitza.
CONSELL GENÈTIC El risc depèn del tips de mutació: à DIFÍCIL DE CALCULAR - DNA nuclear: AD, AR o XL - mtDNA: heteroplàsmia - à detectar on està la mutació Les opcions reproductives: - donació d’oòcits / espermatozoides - DP - DGP - Transferència nuclear - Transferència citoplasmàtica   7     PKU  (3)     CAUSA GENÈTICA DIAGNÒSTIC GENÈTIC TRACTAMENT CONSELL GENÈTIC HEAMOCHROMATOSIS,  HH  (4)     Conjunt de malalties per acumulació de ferro al cos. Afecta més homes que dones (perquè les dones eliminen el ferro amb la menstruació).
Hi ha 4 tipus de hemocromatosis.
- Tipus 1: Autosòmica recessiva, gen HFE. Forma més comuna. Hi ha 3 variants del gen: C282, H63D i S65C. CY en forma homozigota es la que comporta més risc, la SC no està clar que hi estigui associada.
o El gen regula l’absorció de ferro. 2 hipòtesis de com ho fa.
- Tipus 2: Molt més severa que la 1. Dos subtipus, 2A i 2B, diferent gen mutat.
Hemojuvelin(HJV) / Hepidicin. AR - Tipus 3: gen muta Tfr2. AR - Tipus 4: gen mutat ferroportina. AD Els símptomes en una fase avançada inclouen: diabetis, cardiomiopatia, cirrosi del fetge i pell de color bronze.
CAUSA GENÈTICA Per mutacions en gens del transport i regulació de ferro.
DIAGNÒSTIC GENÈTIC Després de fer una història familiar, exploració física i bioquímica, test de dany als òrgans, biòpsies à es fa el test genètic.
Es miren les variants del gen HFE.
- PCR - RFLP digestió de fragments de DNA que tenen una diana per un enzim, coneixent les llargades del producte, podrem saber si hi ha la mutació, ja que sabem quines llargades tenen els al·lels tallats amb un enzim si estan mutats o no.
- Anàlisi d’heterodúplex hibridem el producte de PCR amb un heterodúplex generator que és homòleg al al·lel mutat però té una deleció de 3 pb prop del lloc de la mutació. Això ens permet distingir entre els 2 homozigots.
- SSCP permet distingir diferents al·lels per canvis conformacions causats per la mutació.
  8   TRACTAMENT No hi ha tractament definitiu - extreure sang de tant en tan (phlebotomy/venesection) - quelants del ferro, s’hi uneixen, reduint la seva toxicitat - modificació de la dieta - transplantament de fetge - teràpia hormonal SÍNDROME  DE  RETT  (5)     Malaltia neutodegenerativa, afecta principalment dones.
Com a criteris diagnòstics: tenim unes condicions necessàries i uns criteris d’exclusió (no s’han de complir).
Hi ha dues formes: - Típica / clàssica: té un període de regressió i estabilització i tots els criteris principals - Atípica: té un període de regressió i estabilització i almenys 2/4 criteris principals i 5 de suport.
A més, es distingeixen 5 subvariants de les formes, més lleus pel que fa al sistema motor à forma amb epilèpsia precoç, forma congènita, forma de regressió tardana, forma “frustra” i forma amb conservació del llenguatge.
Es sol donar en DONES perquè en homes sol ser LETAL CAUSA GENÈTICA Herència Dominant lligada al X.
Majoria de casos (95%) per mutacions en MECP2 (regula expressió gènica + repressor transcripcional)à Mutacions puntuals, insercions o delecions.
Hi ha casos amb mutacions en CDKL5 i FOXG1.
La proteïna de MecP2 s’uneix al DNA i promou la metilació, es a dir, el silenciament de diferents gens unint-se a 5mC i 5hmC de les illes CpG dels promotors dels gens. 5hmC està en gran quantitat al cervell i MecP2 s’expressa molt al cervell.
A més, un dels gens que regula és BNDF que a les neurones s’uneix al receptor TrkB produint cascades que intervenen en processos neuronals com el desenvolupament, maduració sinàptica, capacitat d’aprenentatge i memòria, el que explicaria la simptomatologia de Rett.
DIAGNÒSTIC GENÈTIC S’analitzen els gens implicats: MECP2, CDKL5 i FOXG1.
Molta mutació de novo.
- PCR + seqüenciació (exons): Però no es poden detectar delecions o reorganitzacions.
- Southern blot:   9   - MLPA: Permet analitzar ADN molt fragmentat i trobar mutacions en un únic exó.
- CGH: Comparar dos genomes mitjançant un marcatge fluorescent diferencial. Permet detectar DELECIONS I DUPLICACIONS.
TRACTAMENT NO TÉ CURA, per millorar qualitat de vida: - Alimentari: dietes riques en calories i greixos, sonda nasogàstrica - Fisioteràpia: per prevenir problemes a les mans - Exercicis de suport: pels individus que tenen escoliosi - Medicines: per exemple, per les convulsions.
- Estudis del futur que indiquen que els defectes en MecP2 no causen la mort de la neurona sinó certs canvis que podrien ser reversibles.
CONSELL GENÈTIC - Baixa taxa de recurrència perquè moltes mutacions de novo o Risc transmissió <1% Supervivència almenys fins 25 i llavors podria arribar fins als 45 màxim. La mort es dona per convulsions, pneumònia per aspiració, desnutrició i accidents.
  SÍNDROME  DE  KALLMAN  (6)     Malaltia genètica amb hipogonadisme hipogonadotròfic com a conseqüència de dèficits en l’alliberament de GnRH, produeix també anòsmia i hipòsmia (amb aplàsia o hipoplàsia dels bulbs olfactius). També amenorrea primària, fissura palatina al palpebral, sincinèsia bimanual, agenèsia renal unilateral ...
Molts diagnosticats durant pubertat perquè caràcters sexuals no es desenvolupen CAUSA GENÈTICA Mutacions en KAL1 (molècula d’adhesió) DAX (FT nuclear).
Avaluar els gens: - Herència XL: o KAL1 (molècula d’adhesió) - Herència AD o FGFR1, FGF8, CHD7, SOX10 - Herència AR / poligènica o PROKR1, PROK2 DIAGNÒSTIC GENÈTIC Tests hormonals + capacitat d’olorar + test genètic.
- FISH: tenim un kit, el LSI KAL amb sondes que ens permeten detectar DELECIONS EN KAL.
  10   -WES: Sanger per tal de buscar MUTACIONS CONEGUDES.
- MLPA Analitzarem grans DELECIONS / DUPLICACIONS.
-Targeted Variant Analysis S’analitza UN SOL GEN.
TRACTAMENT Basat en induir pubertat i mantenir els nivells hormonals - A nivell d’assolir pubertat (homes): testosterona (tòpica o intravenós) - A nivell de fertilitat: gonadotropines (hCG o FSH) - A nivell de caràcters sexuals secundaris (dones): estrogen i progestina - A nivell de fol·liculogènesi: gonadotropines o GnRH CONSELL GENÈTIC - NO es pot fer DP perquè cada cas té una herència, una penetrància, un gen mutat diferent...
El consell ha d’estar ADAPTAT a CADA FAMILIA. Perquè els símptomes també varien.
INCONTINENTIA  PIGMENTI  (7)  =Bloch  Sulzberg  Syndrome   Herència XD: - Letal en homes - Genodermatosi que afecta a pell, cabell (alopècia), dents (anormalitats), ungles(amorfes), ulls (problemes oftalmològics) i SNC (convulsions, discapacitat mental).
- La simptomatologia cutània apareix en 4 fases: o Vesicular: pàpules, vesícules i pústules seguint la línia de Blascko (per on creixen les cèl·lules de la pell) sobretot a les extremitats.
o Verrugosa: com erupcions hipertròfiques o Hiperpigmentació: lesions lineals o espirals hiperpigmentades o Hipopigmentació: àrees hipopigmentades, sense cabell o atrofiades.
Diagnòstic clínic seguint diferents criteris que estan establerts en una taula, segons si hi ha història familiar o no. Quan no hi ha criteris que ens el permetin diagnosticar, cal fer el diagnòstic genètic.
CAUSA GENÈTICA Mutacions al gen IKBKG (Inhibitor of Kappa B Kinase Gamma, NEMO). Expressivitat variableà perquè depèn de la inactivació del X i perquè el gen participa en molts processos (efecte pleiotròpic).
Està dins d’una duplicació segmental (SD) o LCR (1 i 2) que conté 2 gens: IKPKG i el seu pseudogen (IKPKGP1).
La proteïna que codifica actua con a una subunitat reguladora de l’inhibidor de la quinasa Kappa.
Aquest inhibidor es necessari perquè el factor nuclear, NF-kB estigui actiu, aquest factor regula la resposta immune i inflamatòria i evita l’apoptosi com a conseqüència del senyal TNF-alpha.
  11   Com a causa de la mutació, no es produeix la proteïna i el factor NF-kB no es manté actiuà APOPTOSI.
La mutació més freqüent es produeix per recombinació homòloga no-al·lèlica entre els LCR, produint una deleció dels exons 4-10.
DIAGNÒSTIC GENÈTIC - Long- range PCR: Per tal de detectar la DELECIÓ (exons 4-10) i diferenciar-la de la deleció del pseudogen, que és una variant que es troba en pacients sans.
- Anàlisi de la inactivació del X (PCR + enzim restricció sensibles a metilació) Permet diferenciar d’un PATRÓ D’INACTIVACIÓ al ATZAR d’un altre DESVIAT i saber si hi ha DELECIONS. !! La deleció del gen implica a més, una inactivació desviada del X!! S’ailla el gen HUMARA, del cromosoma X que té un trinucleòtid CAG que segons si el gen es matern o patern, té més o menys repeticions.
Es fan primers per aquestes repeticions, es fa una PCR i s’afegeix un enzim sensible a metilació. Si hi ha metilació, no talla, per tant, només amplifiquen i veurem al gen les bandes corresponents als gens actius.
- Si la inactivació es a l’atzar, el 50% de cèl·lules tindran el cromosoma del pare inactiu (metilat) i el 50% el cromosoma de la mare, això ens dona al gel de la PCR 2 bandes. à NO HI HA DELECIO Si la inactivació és desviada, la major part de les cèl·lules tindran el mateix cromosoma inactiu, per tant només hi haurà una banda à HI HA DELECIÓ.
- Seqüenciació directa: de les REGIONS CODIFICANTS amb primers intrònics. Cal sempre VERIFICAR que la mutació està al gen i no al pseudogen. Per diferenciar-ho es pot fer una Long range PCR on els productes del gen i pseudogen es diferencien per mida, llavors es fa una nested PCR + anàlisi de la seqüencia. La PCR nested es per assegurar l’especificitat de l’amplificació.
- MLPA / rt- qPCR: per detectar REORGANITZACIONS CROMOSÒMIQUES quan no hem trobat delecions o altres mutacions (com puntuals) Requeriments: - necessitem anàlisis paral·lels amb controls + i – - Els resultats de seqüenciació s’han de confirmar amb una segona prova (long range PCR, qPCR, resequenciació amb diferents primers) - Patró de segregació de la mutació Els homes afectats moren (perquè la falta de la proteïna codificada pel gen – crX- és letal): tot i això, se n’han descrit alguns casos, això pot ser perquè: - Síndrome de Klineffelter (47, XXY): - Son mosaics en línia somàtica - Tenen mutacions més lleus del gen TRACTAMENT Només hi ha tractaments pels símptomes, NO hi ha tractament CURATIU.
  12   CONSELL GENÈTIC Un pacient (normalment dona) afectar per IP, pot ser perquè: - Ha heretat mutació - Ha succeït una mutació de novo: normalment prové del PARE Si la mutació que té el pacient és coneguda (ja descrita), es recomana: - test genètics als familiars amb signes clínics - si no hi ha signes clínics, fer test genètic a la mare pel que fa als germans d’un pacient d’IP, depèn de com siguin els pares genèticament: - si la mare és afectada i el germà també, té 1/3 de ser afectada - si no hi ha cap afectat, el risc és inferior al 1%, el risc es pot incrementar si els pares son mosaics en línia germinal o es dóna mutació de novo pel que fa als fills dels pacients afectats: - si es dona à molt risc d’avortament. Risc de transmissió ½ - si es home à no hi ha dades, tots eren mosaics somàtics ( no podien transmetre la mutació) El diagnòstic en un nounat és complicat per implicacions en la salut i en un “sentit de responsabilitat” en contra de fer mal al fill.
HUNTINGTON  (8)     Herència AD: Malaltia neurodegenerativa, afecta a capacitats: motores, psiquiàtriques i cognitives= cos ESTRIAT del cervell s’atrofia.
CAUSA GENÈTICA Gen IT15 (Huntingtina), l’exó 1 té repeticions CAG (Glutamina)à MUTACIÓ DINÀMICA (expansió de triplets)= allargament de glutamines.
Diferents al·lels: - Normals: ≤26 - Intermedis: 27-35 (PREMUTACIÓ) - Mutants: ≥36 (més repeticions, més penetrància) A MAJOR Nº REPETICIONS à més ANTICIPACIÓ (la malaltia s’expressa abans), perquè d’una generació a l’altra la mutació s’expandeix. !!!VIA PATERNA!!! (normalment- gametogènesi més inestable).
Proteïna: sobretot cervell i testicle. Participa en embriogènesi del SN.
L’excés de PolyGlu fa canvis conformacionals a la proteïna , les proteases hi actuen generant fragments que s’acumulen dins les neurones= estrès oxidatiu + APOPTOSI NEURONES. mRNA amb les repeticions pot ser tòxic.
Dos formes segons quan es manifesta: - Forma juvenil (abans dels 20) - Forma adulta (30-50 anys)   13   DIAGNÒSTIC GENÈTIC -Seqüenciació Millor forma de determinar Nº REPETICIONS, però no avarca més de 300-350 pb.
-PCR S’amplifica la regió de les repeticions. Segons el nombre de repeticions els productes són més o menys llargs. Es separen en un gel SDS-PAGE i amb una guia es calcula el nº de repeticions.
Requereix: afegir : - dimetilsulfòxid, DMSO (per evitar que triplets expandits aparellin entre elles) que redueix estabilitat d’estructures secundàries - afegir més Taq (perquè DMSO inhibeix polimerasa) - 7-deaza-dGTP, anàleg de base, perquè no es formin estructures secundàries Si el resultat és que el pacient és homozigot, com diferenciar això de la no-amplificació? Després fem: - PCR del locus adjacent - TP PCR -Southern Blot S’hibrida el DNA (fixat a la membrana de nylon) amb una sonda per les repeticions.
Es sol utilitzar per VALIDAR.
TRACTAMENT NO HI HA CURA Hi ha certs fàrmacs per reduir els símptomes: - bloquejadors de dopamina, ajuden a reduir comportaments i moviments anormals - fàrmacs contra tetrabenazina i amantidina, per controlar moviments - coenzim Q10 per frenar una mica el progrés de la malaltia - estudis amb iRNA per evitar l’expressió de l'al·lel mutat!!! CONSELL GENÈTIC - Risc transmissió à ½ Alt risc de patir-la si tens algun pare afectat, molts prefereixen no saber si tenen la mutació Molts suïcidis Diagnòstic: en individus ja més grans però asimptomàtics i en parelles amb antecedents que volen tenir un fill (DP o DGP) Possibilitat de test d’exclusió fetal (amb marcadors), si els pares no volen saber si tenen l’al·lel.
FIBROSI  QUISTICA  (9)     Herència AR: La disfunció de la proteïna causa un mal transport de Clor, afectant pulmons, aparell digestiu, glàndules sudorípares i vasos deferents (en homes)à insuficiència pancreàtic, diabetis i endobronquitis repetides.
Diagnòstic clàssic: test de la suor, es fa suar al pacient i es calcula el clor que hi ha   14   CAUSA GENÈTICA Gen CFTR (canal de clor) s’expressa a membrana apical de les cèl·lules exocrines epitelials majoritàriament. La mutació més típica: F580del Molta heterogeneïtat genètica (més de 200!!), al·lels es classifiquen en 4 tipus: - causants de FQ - causants de malalties relacionades amb FQ (però no FQ) - mutacions sense conseqüències clíniques - SNPs i polimorfismes DIAGNÒSTIC GENÈTIC -MLPA -NGS (Kit xTAG for Luminex): Panells per 23 mutacions i 4 variants + mutacions molt comunes a NA i el món Passos PCR múltiplex Tractament dels amplicons: elimina els dNTPs i Taq no utilitzats Extensió dels al·lels amb primers específics amb TAG, s’afegeix un producte marcat.
Unió dels TAG a beads amb color que contenen anti-TAG. Cada TAG només s’uneix al seu anti-TAG específic.
- Addició d’una molècula reportera - Obtenim les dades amb el LuminexAnalyser : ens llegeix els beads i el seu color, a més també saben si s’hi ha unit un TAG o no. Els senyals de color s’interpreten per un software.
Screening: - Prenatal: per mirar si els dos pares són portadors de la mutació i calcular el risc de tenir u fill afectat. Es pot fer analitzant els dos pares o bé seqüencialment, primer s’analitza un pare i si és portador, l’altre.
- Neonatal: per tal de detectar els afectats de FQ l’abans possible. Es fa mirant la tripsina, que incrementa abans que la malaltia aparegui.
- CONSELL GENÈTIC - Els pares han de ser portadors, el risc de tenir descendència afectada és ¼.
ALZHEIMER  –  aparició  primerenca  (10)     EOAD- Herència AD: Malaltia neurodegenerativa on s’acumulen plaques amiloides beta i NFTs que contenen la proteïna Tau hiperfosforilada. à pèrdua progressiva de memòria.
Dos tipus d’Alzheimer segons l’edat d’aparició: - EOAD abans 60-65 - LOAD després 60-65 Ens fixem en EOAD.
CAUSA GENÈTICA   15   - - - El gènere femení es considera un factor de risc per l’Alzheimer d’aparició tardana (LOAD) però no en el primerenc (EOAD) Al Alzheimer (AD) hi ha 3 gens nuclears: APP (amyloid precursor protein), PSEN1, PSEN2 o AD- Tipus I à APP 40-50 o AD- Tipus II à PSEN1 40-50 o AD- Tipus IIIà PSEN2 40-75 o En totes, la presència de E4 d’APOE és un factor de risc, disminuint l’edat d’aparició.
o Implicació de factors epigenètics (ambientals – com dieta o tòxics- i intrínsecs com canvis en la metilació) APP: 33 mutacions patogèniques, prop de l’exó 16-17. Hotspot: Val717 (exó 17). L’APP es processa (es trenca) per les secretases gamma, beta i alfa. Hi ha dues maneres de processar-la, la via no patogènica (constitutiva) i la patogènica que genera productes amb capacitat amiloidogènica (d’agrupar-se en plaques), les A-beta. Si hi ha més APP, llavors es fa més la via patogènica i les A-beta s’agrupen en plaques.
PSEN1: molt homòleg amb el 2. 185 mutacions patogèniques. Hotspot: Met146.
PSEN2: molt homòleg amb el 1. 13 mutacions patogèniques.
Tots tenen moltes isoformes degut al splicing alternatiu.
PSEN1 i 2 formen part de la gamma-secretasa, que participa en el trencament de l’APP. Si PSEN1 i 2 estan alterats, la gamma-secretasa no funciona bé es generen més productes tòxics que agreguen entre ells.
DIAGNÒSTIC GENÈTIC S’analitzen els gens en el següent ordre: PSEN1 (tot) > APP (exons 16 i 17) > PSEN2 (tot) > anàlisi delecions > altres (NGS i APOE) 1. Seqüenciació directa: Sanger bi-direccional (PSEN1 > PSEN2) i seqüenciació exons 16 -17 (APP) 2. MLPA, qPCR, aCGH per delecions / duplicacions.
També es pot fer: - NGS (ex/ Illumina RNA-se) per saber nivells d’expressió gènica - Assaig Taqman sobre APOE TRACTAMENT - Cada símptoma es tracta individualment (mèdic i comportamental) - A vegades necessiten persones que els ajudin - Teràpia psíquica i ocupacional CONSELL GENÈTIC Oferir el consell genètic a adults joves afectats o amb risc.
Es pot mirar el risc dels individus asimptomàtics, però que es detecti la mutació no vol dir que hagin de presentar els símptomes típics de la mutació detectada. Consentiment i confidencialitat.
No es pot mirar el risc en nens, això priva al nen de saber, estigmatitza la família i té implicacions educacionals.
- DP: en dones que se sàpiga que porten la mutació i per tant, tenen alt risc - DGP: en casos familiars on s’ha detectat la mutació implicada   16   SÍNDROME  EHLERS-­‐DANLOS  (11)     Herència AR o AD: Alteracions del teixit connectiu que impliquen: hiperlaxitud articular, extensibilitat de la pell i fragilitat dels teixits.
6 tipus segons mutacions, efectes moleculars, bq, gravetat i herència. 5 (tots menys hipermobilitat) es poden diagnosticar genèticament.
Hi ha molt solapament dels símptomes. Els símptomes compartits per tots els SED: - Hiperlaxitud articular: moviments més amplis de les articulacions - Afectacions de la pell: pell mol fina i fràgil (morats), estries - Afectacions del teixit vascular: sagnat fàcil per trencament dels vasos - Afectació d’òrgans interns: trencament, dilatació aorta - Afectació esquelètica: peus plans i escoliosi - Complicacions obstètriques y ginecològiques: ruptures vaginals - Afectacions oculars: glaucoma, estrabisme...
- Complicacions quirúrgiques: hèrnies postoperatòries...
- Afectació neuromuscular : formigueig, mals de cap...
CAUSA GENÈTICA El col·lagen és el component principal de la matriu del teixit connectiu, proporcionant estructura i resistència.
Els gens afectats són gens que participen en: - formació del col·lagen - proteïnes que interaccionen amb col·lagen - COL5A1 (alfa1), COL5A2 (alfa2), COL5A3 (alfa3) qualsevol mutació Tenascina-X (s’associa amb col·lagen a la matriu), procol·lagen tipus III (COL3A1), lisihidroxilasa (PLOD o LH1 ajuda a formació d’estructures entre fibres de col·lagen), ADAMT2 (escissió extrem Nter de procol·lagen un cop excretat) - ...
el col·lagen està format per 3 cadenes alfa, amb triplets Gly-X-Y, que formen una triple hèlix. Les cadenes s’ensamblen dins la cèl·lula, s’alliberen a la matriu on s’hi produeixen uns talls i s’ensamblen.
  17   DIAGNÒSTIC GENÈTIC INFRADIAGNOSTICAT El diagnòstic es basa en: 1- Historial clínic 2- Examen físic: criteris majors i menors 3- Anàlisi genètic à NOMÉS CONFIRMATORI!!! .
Tipus clàssic: COL5A1 i COL5A2 (90% pacients): El procediment es fa per passos, si no es troba res es segueix els passos.
- Seqüenciació directa COL5A1 - Seqüenciació directa COL5A1 - MLPA (no disponible per COL5A2) Tipus hipermobilitat: Tenascina X, nomes en 5%!!!! I desconegut (forma més comuna): Com no es coneix la causa en la majoria de casos, es miren les manifestacions clíniques - Desconegut: estudi de PPRLs (proteoglicans petits rics en leucina) - Tenascina X: o Detecció en sèrum de Tenascina-X o Seqüenciació gen TNX-B Tipus vascular: procol·làgen tipus III (COL3A1) el de pitjor pronòstic - Seqüenciació directa COL3A1 detecta 95% dels casos d’aquest tipus - MLPA 2% dels casos tenen una deleció del genoma (de Mb).
Tipus cifoscoliosi: lisihidroxilasa (PLOD o LH1) Escoliosi progressiva 1. Anàlisi d’orina: gran poder predictiu 2. Seqüenciació directa PLOD 3. Anàlisi de deleció / duplicació si no s’ha detectat cap mutació seqüenciant Tipus artrocalasia: col·lagen (COL1A1 i COL1A2) deleció de exó 6 A o B segons si està afectat A1 o A2.
1. Seqüenciació directa COL1A1 i COL1A2 Tipus dermatosparaxix: ADAMT2 - Seqüenciació directa ADAMTS2 à mutació més freqüent Q225X, detecció d’aquesta TRACTAMENT NO HI HA CURA. Només per reduir símptomes, pal·liatiu.
CONSELL GENÈTIC -   El diagnòstic genètic no és la primera opció: a no ser que sigui un cas familiar on es coneix el gen afectat Normalment primer es miren els símptomes, histologia...
S’han de seguir els altres membres de la família si no hi ha mutació familiar Diagnòstic útil per determinar de quin tipus és, així es sap més quines prevencions seguir (evitar esports, teràpia en articulacions i musculatura, protegir la pell de cops, control dels aneurismes – dilatació del vas sanguini- , ferides, cirurgia i embaràs...) 18   - Si l’herència és: o AD: § risc 50% fills afectats § DP i DGP si es coneix la mutació (menys per al d’hipermobilitat que no es coneix el gen) o AR: pocs casos § risc 25% fills afectats, perquè els pares han de ser portadors (probabilitat baixa) § DP i DGP si es coneix la mutació GALACTOSÈMIA  (12)     Herència AR Malaltia del metabolisme de la galactosa, no poden convertir-la a glucosa.
Tres tipus segons gen afectat: - tipus 1, clàssica à GALT, més comuna i greu - tipus 2 à GALK , menys greu - tipus 3 à GALE , molt rara, severitat variable Si no funciona l’enzim GALT, s’acumula galactosa, gal-1-P i galactitol bàsicament a fetge, ronyó i cervell. Provocant cataractes, pseudotumors cerebrals, efectes osmòtics anormals.. retràs en el creixement i dificultat per augmentar de pes, discapacitat intel·lectual, hemorràgies...
CAUSA GENÈTICA La via de convertir galactosa a glucosa necessita tres enzims: - GALK (galactoquinasa) - GALT (galactosa 1-P-uridiltransferasa) mutacions més freqüents: Q188R, S1135L i N314D/Q188R que formen tres subtipus: clàssica, variant clínica de la galactosèmia i variant bioquímica de la galactosèmia (mutació N314D és la variant Duarte que no implica la pèrdua total d’activitat de GALT)..
- GALE (UDP-galactosa-4-epimerasa) Hi ha vies alternatives de metabolitzar la galactosa: reduir-la a galactitol o oxidar-la a galactonat.
Ens centrarem en el diagnòstic de la GALACTOSÈMIA TIPUS 1 CLÀSSICA (GALT) DIAGNÒSTIC GENÈTIC Explicarem detecció de mutacions en GALT. Es poden seguir dos mètodes: - Anàlisi de [galactosa] o derivats - Anàlisi d’activitat GALT - (complementari!!!) anàlisi genètic Anàlisi de [galactosa] o derivats - test de Paigen: CRIBRATGE NEONATAL. Galactosa i gal-1-P. Soca d’E.coli que es fa resistent al fag C21 en presència d’elevades [gal], diàmetre creixement proporcional a [gal]. Alguns FP, detecta altres anomalies que no son galactosèmia.
- test de Hill: galactosa. Mesura els nivells de galactosa per un assaig fluorimètric.
- test de Beutler: analitza la fluorescència emesa quan NADPH passa a NADP+, reacció que es dona si hi ha GALT. Si no hi ha fluorescència, no hi ha enzim. Alguns FP.
Anàlisi d’activitat GALT   19   - espectrometria de masses (UPLC-MS/MS): CRIBRATGE NEONATAL. Analitza activitat de GALK, GALT i GALE. Fa servir isòtops estables com a substrats dels 3 enzims , es separen els isòtops, es quantifica l’absorbància i es compara amb un control Anàlisi genètic: SEQÜENCIAL - - - Detecció mutacions comunes: o PCR-RFLP + SSCP: les mutacions més comunes s’analitzen mirant els RFLPs, després s’analitzen els SSCP.
o PCR-ELISA es fan sondes específiques per a cada mutació. S’amplifica el gen GALT a analitzar i es marca amb biotina. Desnaturalitzem i hibridem el producte amplificat amb les sondes específiques. Llavors es retenen les seqüències mutades amb streptavidina i queden retingudes a la placa. La detecció de les seqüències mutades es fa afegint substrat i la peroxidasa, el que dona color.
Detecció de variants: SNPs, microdelecions, de splicing...
o Seqüenciació Sanger o NGS: una genoteca amb adaptadors + amplificació en fase sòlida. Podem seqüenciar per piroseqüenciació, lligació o terminació reversible.
Detecció de delecions o duplicacions o Seqüenciació Sanger o MLPA: o Microarray: hibridació amb una sonda específica.
§ Confirmació: Múltiplex PCR el que dona lloc a productes de diferent mida segons si tenen deleció, duplicació o son normals.
NOU!! High-throughput FTIR analysis of plasma Mesura a través de vibracions moleculars, l’estructura i la composició de les macromolècules.
S’aconsegueixen uns quants espectres d’infrarojos per cada mostra, es passa un filtre de qualitat i es comparen els espectres entre pacients i sans. Els resultats s’analitzen amb PCR i es mira si les dades segueixen alguna tendència.
TRACTAMENT És crucial, ja que sinó se’n fa la mortalitat pot ser del 75% CONSELL GENÈTIC -   Risc pels membres de la família: o Pares: portadors. Asimptomàtics o Germans: 25% afectats, 75% no afectats (50% portadors) o Descendència: portadors. Asimptomàtics. Si s’aparella amb portador, 50% afectats, 50% portadors.
o Tiets: probabilitat 50% de ser portadors.
Detecció portadors: o test genètic (quan mutació coneguda) o test bioquímic DP: si els pares són portadors. Aspectes ètics si es fa per interrompre embaràs DGP: en famílies amb mutació coneguda 20   ...