Tema 6 (I): Enginyeria genètica en llevats (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecnologia del DNA recombinant
Año del apunte 2015
Páginas 5
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 9
Subido por

Vista previa del texto

Tema 6. Enginyeria genètica en llevats i sistemes vegetals 1. Clonació en llevats Perquè? Són organismes unicel·lulars fàcil de cultivar i manipular, de creixement ràpid i manteniment barat. A més, són eucariotes, de forma que realitzen processos que els bacteris no fan, com ara glicosilació, fosforilació, secreció proteica i acoblament de macromolècules entre altres. Els seus principals usos són en l’estudi de funcions cel·lulars en eucariotes, l’estudi del seu genoma (interacció de gens, productes que codifiquen, expressió, ...) el qual està seqüenciat, la producció de proteïnes a nivell comercial (amb característiques similar a les dels animals) i l’habilitat de clonar fragments grans de DNA (YACs).
Cicle vital de Saccharomyces cerevisiae: Si una cèl·lula de tipus a es troba amb una del tipus α, es fusionaran en una sola cèl·lula, la qual també patirà una fusió de nuclis, formant-se un diploide estable que també és capaç de reproduir-se de forma asexual. Quan les condicions exteriors són desfavorables per les cèl·lules dipoloides, té lloc una meiosi, la qual donarà com a resultat la formació de quatre espores haploides, dues de les quals seran de tipus sexual a i les altres dues del tipus sexual α.
1.1. Vectors usats per transformar llevats: Característiques generals: tenen llocs únics per a les endonucleases de restricció, poden replicar-se en E. coli, aportant així un gran nombre de còpies. Presenten marcadors de selecció en llevats: His3, Trp1, Ura3 i Lys2, poden seleccionar-se de forma positiva (s’usa un hoste mutant auxòtrof per algun element, de forma que la incorporació del plasmidi aportarà la capacitat de créixer en absència de l’element) o de forma negativa (sensibilitat en algun compost).
Vectors d’integració cromosòmica: plasmidi procariota (per poder clonar en E. coli) + seqüències de llevats (permetran recombinació homòloga amb gens eucariotes). No presenten replicació autònoma, únicament es manté si s’integra en el cromosoma del llevat. Una de les principals aplicacions és el gene targeting, es tracta d’una tècnica de DNA recombinant que usa la recombinació homòloga per : Introduir gens d’interès: presenta zones amb homologia amb el llevat, però en posicions que no són vitals per al creixement, a banda del gen d’interès, trobarem un promotor i un terminador d’aquest i a més un marcador de selecció, també amb el seu promotor i terminador.
Produir delecions en gens concrets: té lloc la recombinació homòloga entre els fragments de gen inserits i el gen del llevat que queda inactiu, s’insereix un marcador de selecció (amb promotor i terminador), el que acostuma a ser un gen que permet el creixement en absència d’un determinat compost.
1.1.1.1. Plasmidis YIp (Yeast Integrating plasmid): els descrits anteriorment, este és el nom en anglès 1.1.2. Vectors de replicació autònoma: 1.1.2.1. YEps (Yeast Episomal plasmids): basats en el plasmidi cercle 2 µm. Es mantenen com molècules de DNA circular.
1.1.1.
Es tracta d’una recombinació d’un vector d’E. coli i el plasmidi cercle 2 µm de llevats, al contenir el vector de E. coli¸ l’augment del nombre de còpies es realitza en aquest bacteri. Els marcadors de selecció són bacterians.
Què és el cercle 2µm? És un plasmidi natural de 6,3 kb de llevat que es troba amb un nombre de còpies d’entre 50 i 100, els hostes d’aquests s’anomenen Cir+, tot i que no confereix cap característica especial. Els YEps poden tenir tot el DNA del plasmidi 2 µm o únicament un fragment que inclogui l’origen de replicació.
Obtenció de YEps i selecció d’aquests: 1- S’afegeix l’insert en el YEps 2- Transformació en E.
coli, es seleccionen amb la tècnica de rèplica en placa, els bacteris que tinguin el vector però sense l’insert seran resistents a l’ampicil·lina i a la tetraciclina, mentre que els vectors que tinguin l’insert únicament seran resistents a l’ampicil·lina 3- Es transformen els llevats, s’usen com a hostes llevats mutants auxòtrofs en la leucina, degut a que el vector conté el gen LEU3, en un medi en absència de leucina únicament creixeran els llevats que contenen el YEp.
1.1.2.2. YRps (Yeast Replicating plasmids): basats en components cromosòmics. Es mantenen com molècules de DNA circular. En concret, estan basats en seqüències (ars) que els permeten als vectors de E. coli replicar-se en llevats, aquestes seqüències de replicació autònomes actuen com origen de replicació.
1.1.2.3. YCps (Yeast Centromere plasmids): es mantenen com a molècules de DNA circular. Són vectors YRp als que se’ls ha afegit una seqüència centromèrica (cen) per augmentar l’estabilitat en la mitosi.
1.1.2.4. YACs (Yeast Artificial Chromosomes): deriven de YCps als que se’ls ha afegit telòmers (TEL: regions que es troben en els extrems dels cromosomes eucariòtics, que preserven la integritat dels extrems de DNA i són necessaris per a la replicació i el manteniment del cromosoma). Contenen gens per seleccionar els llevats: URA3 i TRP1, de forma que es transformen en llevats hoste que són defectius en la biosíntesi de les molècules citades, de forma que els transformants s’identifiquen per la seva habilitat de complementar aquest defecte nutricional.
En la imatge del full anterior podem veure ori, que és l’origen de replicació en E. coli, ars i cen, on ars actua com a origen de replicació i cen augmenta l’estabilitat en la mitosi, trobem Amp i Ura per a la selecció. Aquests vectors són útils per a llibreries de genomes molt grans o per clonar un gen sencer amb introns inclosos en un únic clon (fragments de fins a 2 Mb).
1.2. Introducció de DNA en llevats: els llevats no són naturalment competents, trobem 3 mètodes: Sals de liti + PEG + xoc tèrmic Us d’esferoplasts (cèl·lules sense paret) + etilè-glicol + DNA + CaCl2 Electroporació (vist en transformació de bactèries) 1.2. Expressió de proteïnes recombinants: Promotors: en llevats són més complexes que en bacteris, un vector ideal ha de tenir un promotor regulable i amb una alta inducció. Si volem produir proteïnes a nivell comercial, necessitarem un promotor molt potent, en aquest casos S.
cerevisiae és la soca més usada degut a que és innòcua i segura. També s’usa Pichia pastoris (metilotrofa) ja que el seu promotor AOX es més fort, regulable (s’inhibeix amb glucosa) i el seu inductor és el metanol (és molt barat) Secreció: la secreció de les proteïnes facilita la seva purificació, evita la degradació per proteases intracel·lulars, afavoreix el plegament correcte de la proteïna i una de les condicions per a que es secretin és que la proteïna estigui glicosilada. A més, les proteïnes de secreció tenen una extensió amino-terminal que senyalitza per a la seva translocació (ER  Golgi  vesícules secretores  membrana), uns exemples serien la feromona factor α i la killer toxin. Es poden crear vectors recombinants que continguin aquesta seqüència senyal, de forma que les proteïnes recombinants es podran secretar.
Exposició de les proteïnes clonades (yeast cell surface display): permet l’exposició de proteïnes eucariotes en la seva conformació nativa usant el receptor α-agglutinin (Aga). HA i cmyz són epítops fàcilment reconeixibles per la quantificació de proteïna de fusió, aquestestes no es troben en el llevat, i en comptes d’identificar la proteïna identifiques les dues marques mitjançant ELISA, sol necessitaràs un anticòs.
- 1.3. Aplicacions 1.3.1. Yeast-two-hybrid: tècnica in vivo per estudiar interaccions entre proteïnes o proteïna-DNA, s’usen les propietats del factor de transcripció Gal4p de S. cerevisiae, el qual està format per 2 dominis: DBD (domini d’unió al DNA, seqüències UAS en promotors de gens de metabolització de galactosa) i AD (domini d’activació de transcripció, s’uneix a RNA pol II), es tracta d’un polipèptid de 881 aminoàcids, però la proteïna es divideix en diferents regions amb el DBD en l’extrem amino-terminal i AD en el carboxil terminal.
Quan estan junts es podran unir al DNA i activar l’expressió d’un gen. Quan no, DBD queda unit al DNA mentre que AD no, i en conseqüència no s’inicia la transcripció. A nosaltres el que ens interessa és el cep i la presa. En un plasmidi tenim DBD i el cep i en un altre tenim AD i la presa, si aquests es troben separats no es produeix la transcripció, però si es troben els 2, les proteïnes interaccionen i es produeix el domini complert, permetent així la transcripció.
Abans de tot aquest procediment, cal saber que l’objectiu és buscar proteïnes “presa” que interaccionin amb una proteïna seleccionada “cep”, les proteïnes cercades (és a dir, les que interaccionen amb el cep), permeten la interacció DBD-BAIT::PREY-AD i l’expressió d’un reporter. Si la presa i el cep no interaccionen, tampoc interaccionaran DBD i AD, i en conseqüència, no es produirà la transcripció. El screening i la selecció es faran usant l’expressió del gen reporter que pot transcriure’s o no (LacZ, His3, Leu2, luc (luciferasa)), aquest pot estar en un tercer plasmidi o integrat en el genoma del llevat.
Problemes: falsos positius, podem detectar la interacció encara que in vivo aquesta no tingui lloc, això pot ser degut a que cadascuna de les proteïnes són activadores de la transcripció per si mateix, perquè es produeix una interacció inespecífica o per la presència d’altres proteïnes que afavoreixen la unió. També es poden donar falsos negatius, de forma que no detectarem la interacció encara que in vivo aquesta sí que existeixi, això pot ser degut a un mal processament de la proteïna o a la sobre-expressió d’una proteïna tòxica o letal.
1.3.2.
Yeast-three-hybrid: tècnica útil per identificar proteïnes d’unió al RNA. Un dels components és el hook¸ el qual comprèn el domini d’unió al DNA d’un factor de transcripció i una seqüència específica d’una proteïna d’unió al RNA, que s’adhereix en un extrem de la molècula sintètica de RNA. En l’altre extrem del RNA trobem la seqüència per a la que busquem els candidats que interactuïn amb ella  es construeix una llibreria de “preys/presas” on sol trobem les cèl·lules on el prey interactua amb la seqüència de RNA, això es detecta mitjançant l’expressió del gen reporter. També es pot usar per buscar proteïnes que interaccionen amb un determinat lligand (figura c) 1.3.3.
2.
Reverse-two-hybrid: la interacció entre el bait i el prey s’usa per induir l’expressió d’un gen el producte del qual és letal per la cèl·lula. És una tècnica útil per buscar substàncies que interrompen la interacció entre les proteïnes i permeten a la cèl·lula sobreviure gracies a que no s’expressa el gen reporter.
Enginyeria genètica en sistemes vegetals: 2.1.
2.1.1.
2.1.2.
2.1.3.
2.2.
2.3.
2.3.1.
2.3.2.
- Vectors per plantes i introducció de DNA Vectors basats en plasmidis naturals Vectors d’Agrobacterium (Ti) Vectors de Rhizobium (Ri) Transferència directa de gens Bombardeig de partícules Transferència per protoplasts Vectors basats en virus de plantes Expressió del transgen Aplicacions: plantes com bioreactors Plantes transgèniques per addició de nous gens Plantes que sintetitzen els seus propis insecticides Plantes transgèniques per inactivació de gens Tecnologia de l’antisentit: tomàquets amb maduració retardada NO EM DÓNA TEMPS  A MÀ ...