TEMA 3 - Cromatografies (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Tècniques instrumentals bàsiques
Año del apunte 2015
Páginas 28
Fecha de subida 14/05/2015
Descargas 45
Subido por

Vista previa del texto

TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Tema 3 – Cromatografies FONAMENTS I CARACTERÍSTIQUES 23/04/15 Qué cosa es una cromatografia – és un mètode de separació de molècules (P1 i P2) degut a la seva diferent distribució en dues fases. Una seria la fase mòbil, la que es desplaça durant la cromatografia, i una és la fase estacionària, que és la que no es desplaça.
Normalment la fase estacionària es correspon amb la substància que forma la columna, mentre que la fase mòbil es correspon a la dissolució que fem passar per la columna, sempre o quan la partícula sigui sòlida (llavors el concepte varia una mica).
En aquest esquema tenim el circuit de la cromatografia: Tenim el dissolvent, que és el que utilitzem en una cromatografia líquida (també n’hi ha de gasos però no les veurem). Aquests dissolvents els fem passar per la columna amb una bomba peristàltica d’alta pressió connectada a la columna cromatogràfica amb un tub de tefló que introdueix el dissolvent a una velocitat de flux determinada. La mostra es pot posar en un injector o, en la seva carència, es posa abans de la bomba. Tenim la columna cromatogràfica que està connectada a un detector que generalment detecten absorbància a longituds d’ona o bé de 210nm (enllaç peptídics) o bé de 280nm (AA aromàtics).
43 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Aquest detector registra qué cosa està passant per la columna. Tenim augments i disminucions d’absorbància des d’una línia base – registrem canvis en l’absorbància del què passa pel detector.
L’equipament és el següent: Tenim la bomba, on trobem una rodeta que està connectada a un motor i que fa de regulador de la velocitat de flux a la qual volem que passi la mostra (es treballa en ml/minut). Tenim la columna sense res a dins i un detector, en el qual apreciem el filtre que és el que determina quina longitud d’ona mirarà. Augmentem o disminuïm el rang d’absorbàncies en funció de la quantitat de proteïna. També tenim el tub de tefló connectat al col·lector de fraccions i tots els tubs que té dins són els que recollirem al final de la cromatografia i analitzarem que està connectat a l’equip registrador que dibuixarà els canvis d’absorbància que tindrem a la sortida de la columna i que ens donarà el cromatograma.
ETAPES – Empaquetat de la columna Per començar una cromatografia, la primera etapa (no sempre necessària) és l’empaquetat de la columna. No és sempre necessària perquè hi ha columnes que venen preempaquetades. A més, un cop tens una columna empaquetada, no s’ha de desempaquetar cada cop que la tornis a fer servir.
Empaquetar vol dir que les partícules han de quedar enganxades unes a les altres.
44 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 La majoria de resines venen en forma de pols blanc en una botella. Aquest pols s’ha d’hidratar, es posa en el tampó per tal que la resina s’infli (absorbeix aigua). Un cop la resina està en condicions, omplim la columna i deixes que sedimenti la resina. Un cop sedimenta la columna, obres la vàlvula i deixes que surti el líquid sobrant. Si ha quedat poc volum a la columna (un petit menisc és suficient), tornes a reomplir fins el volum desitjat. Moltes vegades el que es fa és eliminar el líquid sobrant a la mateixa velocitat de flux que després usaràs en la cromatografia per tal que es compacti una mica més la resina, i així la mateixa bomba t’ajuda a compactar adequadament (sinó, compacta sota força de la gravetat; la bomba dóna una força addicional).
ETAPES – Equilibrat Un cop tenim la columna compactada, la següent etapa és l’equilibrat. Equilibrar la columna és posar-la en les condicions inicials de la cromatografia (tampó, pH, quantitat de sals, agents reductors...). Que només quedi carregar la mostra.
ETAPES – Aplicació de la mostra Un cop hem equilibrat la columna, carreguem la mostra (vas de precipitats amb el líquid blau) i deixem que penetri en la columna. Quan s’acaba la mostra i ja està tota a la columna, hem acabat la fase d’aplicació de la mostra.
ETAPES – Elusió Un cop hem aplicat la mostra fem l’elusió – posem el tampó que necessitem per eluir les proteïnes de la columna. Posarem tant tampó com sigui necessari per tal que surtin les proteïnes contingudes en la mescla que hem introduït.
Important – en cap cromatografia deixem cap proteïna dins la columna, sempre ha de sortir tot de la columna, independentment del principi o metodologia de separació. Encara que la nostra proteïna estigui en la primera fracció, tota la resta ho recollim igual, perquè la columna és reutilitzable.
45 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Recollim les fraccions al final i eluïm – eluir és sortir de la columna. Aquestes fraccions que anem recollint, tenen un volum que determinem prèviament però que sempre és el mateix (depèn del protocol específic de cada cromatografia).
Si diem que la proteïna elueix a 13mL vol dir que el màxim d’absorció del pic de l’elusió d’aquella proteïna es troba en 13mL – sempre donem el número referit al màxim del pic. El volum d’elusió és el volum de fase mòbil al qual la molècula abandona la columna.
CROMATOGRAMA Aquestes fraccions de volum determinat passen al cromatograma – el registrador mesura la variació d’absorbància en el temps, que es tradueix a absorbància i volum, ja que sabem la velocitat de flux. Per tant si tenim ml/min i el paper del registrador avança a 1cm per minut, saps que 1cm en el dibuix representarà 1ml de volum.
El cromatograma és el perfil de sortida de les molècules d’una columna cromatogràfica.
Quan surt el dibuix, podem saber en quina fracció tenim els pics. El primer pic està en la fracció 3. El segon en la 4 (en funció del nombre de mil·lilitres que haguem posat nosaltres en cada tub). Llavors sabrem amb quins tubs voldrem treballar i quins els tirarem a la pica perquè és dissolvent.
Si lo asemos a siegas, nos tenemos que ir al espectrofotometro con nuestros 80 tubos i absorbansia todos los dias. Pero eso no vale.
Normalment, quan veus que el registrador comença a pujar, disminueixes el nombre de mL per tub. Però eso es un poco trampa, eso no vale.
46 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 TIPUS DE CROMATOGRAFIA Tots ells es diferencien en el principi de la cromatografia, en el perquè de la separació. Tenim els següents tipus: - Filtració en gel – separa per massa molecular Interacció hidrofòbica – separa per hidrofobicitat Intercanvi iònic – separa les molècules per càrrega Cromatografia d’afinitat – es basa en el reconeixement biològic de la molècula proteica (per alguna propietat especifica, per exemple l’afinitat per un antigen, el NAD) Cromatografia de fase reversa – es basa en la hidrofobicitat però la fase estacionària enlloc de ser polar és apolar (normalment la fase estacionària és la més polar) FILTRACIÓ EN GEL Les molècules se separen per la major o menor penetrabilitat de les molècules dins d’un gel reticulat segons la seva mida (que està associat al seu pes molecular). Però en cap cas la proteïna reacciona amb la matriu (resina) de la columna.
La fase mòbil és un dissolvent que està fora de les partícules del gel. La fase estacionària es considera el dissolvent que està dins (les partícules no són esfèriques, són poroses, per tant en aquest cas el concepte de fase mòbil i estacionària varia una mica).
Els dissolvents són medis aquosos no desnaturalitzats – no cal canviar cap de les propietats de la proteïna. Simplement, o entrarà o no entrarà, però no es donarà cap reacció química.
47 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 En la imatge, tenim les boles vermelles grans que, en no cabre pels porus, serà la primera que surti. Després tenim un grup de proteïnes que penetra en els porus del gel amb més o menys dificultat. Finalment tenim unes partícules tant petites que entren a tots i cada un dels porus del gel perquè no veuen cap límit al seu pas. Aquestes seran les últimes en sortir.
Obtenim un ordre de mida de sortida decreixent.
PARÀMETRES – Interval de fraccionament Nosaltres tenim un interval de fraccionament a-b. L’interval de fraccionament és típic de cada resina. Cada interval té dos límits, a i b.
Llavors, les partícules que tinguin mida<a correspondran a soluts que no entraran per cap porus del gel. En canvi les partícules que tinguin mida>b seran soluts que penetraran per tot el gel. Les partícules que estiguin entre a i b (a>mida>b) penetraran amb diferent probabilitat, ja que estan dins el rang però passaran per uns i per altres no en funció de la seva mida.
Es tracta d’una propietat de la columna, ja que ve determinada per la mida de porus que hi ha en la resina, no en la mida de la proteïna.
a i b són dos pesos moleculars. A vegades veurem només un número. Aquest número és el límit d’exclusió.
PARÀMETRES – Volum d’exclusió (V0) – és el volum en el qual elueix una partícula que no penetra en absolut en el gel. Seria el volum ocupat per la fase mòbil. Si tenim una partícula superior al límit establert superior de l’interval de fraccionament (‘a’) i aquesta elueix als 20 mL, el volum d’exclusió serà de 20mL.
PARÀMETRES – Volum total (Vt) – és el volum d’elució d’una partícula que penetra completament en el gel. La partícula ha de tenir una mida inferior al límit establert inferior de l’interval de fraccionament (‘b’).
correspon el volum d’exclusió més el volum de l’interior de les partícules (volum de la fase mòbil més el de la fase estacionària.
PARÀMETRES – Volum d’elució (Ve) – és el volum d’elució per totes les molècules que estan dins el rang entre a i b. En aquest rang les molècules entren en els porus del gel amb diferent probabilitat, per tant obtindrem diferents volums d’elució per cada grup de partícules d’una mida determinada (compresa dins el rang).
48 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Pot passar que el volum d’elució sigui major que el volum total (Ve>Vt). Això passa perquè pot haver adsorció inespecífica a les partícules del medi. Llavors, canviem de resina, perquè per alguna raó se’ns estan unint les proteïnes a la resina. Hem d’escollir resines de tipus inert. Això ho detectem perquè totes les molècules han d’haver eluït un cop arribats al volum total. si això no és així, hi ha hagut interacció partícules – resina.
Aquí tenim un cromatograma típic de cromatografia en gel. Per entendre’l millor, posem un exemple numèric.
Imaginem una barreja de proteïnes de X PM (jeje no veig la pissarra però s’entén). El rang de fraccionament va de 250.000 a 40.000. Quants pic obtindríem en el cromatograma? Tenim 3 PM dins el rang de fraccionament. Estan suficientment separades perquè surtin separades, per tant cada una serà un pic (intermediate molecular weight). Després tenim dos grups que són més grans que el límit superior, per tant sortiran juntes. És igual que una sigui el doble o el quàdruple que l’altre, perquè no passaran pels porus (high molecular weight). Després tenim les que són inferiors al límit inferior (low molecular weight).
En total tenim 5 pics, 3 específics dins el rang de fraccionament, un altre pic que conté totes les espècies de PM inferior al límit inferior i un altre que conté totes les espècies de PM superior al límit superior.
RESINES Hi ha un criteri per escollir una resina per cada tipus de gel filtració, ja que tenim diferents tipus de resines amb diferents característiques. Un cop saps el PM de la proteïna que vols analitzar, esculls el rang de fraccionament que més et convingui.
Hi ha una imatge de les resines, però és de pèssima qualitat, així que no la poso, està a internet  49 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS APLICACIONS - PARCIAL 2 28/04/15 Separació de molècules de diferent mida en condicions natives Càlcul de masses moleculars Dessalat de mostres o canvi de dissolvent Puresa DETERMINACIÓ DEL PES MOLECULAR INTERCANVI IÒNIC Les molècules se separen en funció de la seva càrrega iònica. Tenim dos tipus d’intercanvis: l’aniònic i el catiònic. Aquest nom defineix el tipus d’espècie que interacciona amb la resina.
50 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 PARÀMETRES – Resines La resina en aquestes cromatografies generalment s’anomena intercanviador. És la matriu que tindrà grups polars units a la seva superfície a diferència de la filtració en gel on la matriu era inerta. Aquí sí que hi haurà interacció entre les proteïnes i la matriu. Les proteïnes que no interaccionen elueixen, en canvi les proteïnes que interaccionin amb la matriu quedaran retingudes, en virtut d’interaccions de tipus electròniques.
L’intercanviador pot tenir grups negatius o grups positius en la seva superfície. Si té càrrega positiva, intercanviarà anions (intercanviador aniònic). Si té càrrega negativa, intercanviarà cations (intercanviador catiònic). El nom doncs no el rep per la seva pròpia càrrega sinó pel què intercanvia.
PARÀMETRES – pH Com sabem la càrrega neta d’una proteïna? Del seu punt isoelèctric i del pH del tampó en el qual es troba dissolta. Si tenim proteïnes el pH de les quals és menor que el seu PI, estaran carregades positivament. En el moment en què el pH sigui igual al pH, la càrrega serà neutra. Si tenim proteïnes el pH de les quals és major que el seu PI, estaran carregades negativament.
- pH<pI  q+ pH = pI  q0 pH>pI  q- Aquí tenim una taula que il·lustra com varia la polaritat de les proteïnes a diferents pHs.
Això ens ajuda a determinar quines proteïnes interaccionaran amb quin tipus de matriu i per saber a quin pH hem d’equilibrar la matriu per poder realitzar l’intercanvi iònic.
GRUPS FUNCIONALS Tenim diferents grups funcionals units a les resines. Tenim el DEAE (amb cel·lulosa) que és un intercanviador aniònic; l’amoni quaternari (intercanviador aniònic); el grup carboximetil i el grup sulfopropil (intercanviadors catiònics). Veurem que les columnes són Q-safarosa, CMcel·lulosa... Ens indiquen de qué cosa és la partícula i quin grup funcional tenen immobilitzat en la superfície de la partícula.
Tenim intercanviadors dèbils o forts. Aquests conceptes no fan referència a la força d’interacció amb les proteïnes, sinó al rang de pHs en els quals podem utilitzar aquest tipus d’intercanviadors. En els dèbils el rang de pHs és molt més reduït que en els forts.
51 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 CONDICIONS DE TREBALL Quan passem una mostra per intercanvi iònic, necessitem baixa força iònica i també un pH determinat que ens permeti que s’uneixin a la resina les proteïnes que nosaltres vulguem purificar.
Un cop arribats a tindrem proteïnes retingudes. A les interaccionen amb flowthrough.
l’equilibrat de la columna, retingudes i proteïnes no aquelles proteïnes que no la matriu se les anomena Un cop tenim això, netegem la columna amb el mateix tampó per eliminar les proteïnes que no hagin interaccionat adequadament. Tot seguit eluirem ja que en cap cas hem de deixar cap proteïna dins de la columna.
ELUCIÓ Per eluir, hem de fer canvis en la fase mòbil, com ara: - - Augment de força iònica – afegim algun compost, normalment NaCl, perquè competeixi amb la proteïna per unir-se als grups carregats de la matriu. Els ions desplacen la teva proteïna, trenquen la interacció, i aquesta elueix.
Canvis de pH – desplacem l’equilibri, trenquem les interaccions electrostàtiques. El què estava positiu passa a negatiu i viceversa i en canviar aquest fet elueixen.
L’ordre de sortida és de menys càrrega a més càrrega. Les primeres en eluir, tindran menys densitat de càrrega i hauran interaccionat de manera més dèbil amb la matriu.
Es fa servir el mètode del NaCl amb més freqüència perquè afecta molt poc a l’estructura de la proteïna. Canvis de pH molt bruscos poden desnaturalitzar la proteïna.
52 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Tenim tres tipus d’elució: - - - Elució isocràtica – usem un mateix tampó de composició constant. Per exemple, carreguem la columna amb un tampó fosfat pH=7 i eluïm amb un tampó fosfat pH=7 500mM de NaCl. Mantenim les condicions.
Elució de gradient – usem normalment un gradient ascendent de NaCl, format de la mateixa manera que vam veure en la sedimentació. Barreges el tampó sense NaCl i el tampó amb 1M de NaCl. Vas pujant la concentració de NaCl i aniran eluint les proteïnes.
Elució per passos – fem un pas a 100mM de NaCl i eluïm un grup de proteïnes.
Augmentem la concentració a 200mM i eluïm un altre grup. I així successivament. En la imatge, la línia vermella indica els canvis en la concentració de NaCl. Cada pic correspon o a una proteïna o a tot el grup de proteïnes que siguin capaces de separarse a aquesta concentració de NaCl. El límit que s’usa normalment és 1M per assegurarte que la columna queda neta.
De què depèn que triem una elució o una altra? Bàsicament, de la proximitat dels punts isoelèctrics en la nostra barreja de proteïnes.
53 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 EXEMPLE – Proteïnes - PI pròxims – en l’exemple d’una cromatografia catiònica. El pH d’elució serà menor al PI. Amb PI molt pròxims, triarem una elució per gradient de força iònica, ja que amb la de passos ens costarà molt trobar el PI en el qual podrem separar les proteïnes. Les proteïnes eluiran per ordre creixen de PI (pI(a)<pI(b)<pI(c)).
- PI diferents – en l’exemple d’una cromatografia catiònica. Tindrem que pI(a)<<<pI(b)<<<pI(c). Amb PI molt diferents, farem una elució en tampó discontinu variant el pH, ja que quasi sempre trobaràs tampons que et permetran fer una elució per passos, ja sigui per associació a pH o fins i tot amb gradients de sals.
EXEMPLE – DNA També podem separar el DNA usant intercanvi iònic de tipus mono Q (amina quaternària), ja que el DNA té càrrega negativa. Es farà servir un gradient de força iònica (buffer A de Tris, i el buffer B contindrà A i NaCl).
L’elució es farà per ordre creixent de mida – les càrregues van associades a cada parell de base, per tant les molècules més petites tindran menys càrrega.
54 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 INTERACCIONS HIDROFÒBIQUES La cromatografia d’interaccions hidrofòbiques separa les molècules d’acord amb el seu caràcter hidrofòbic.
En aquest tipus de cromatografia tenim una fase estacionària que té immobilitzats grups hidrofòbics, com poden ser grups metils, etils, fenils...
En la fase mòbil s’utilitza una elevada concentració iònica que interaccionarà bàsicament amb l’aigua, facilitant que les molècules hidrofòbiques interaccionin amb la matriu.
Es tracta d’una cromatografia que pot ser útil després d’un intercanvi iònic – s’usa l’elució amb una elevada força iònica com a condició inicial per aquesta cromatografia. La part apolar de la molècula interacciona amb la matriu.
Trobarem l’equilibri més o menys desplaçat en un sentit o en un altre en funció de: - L’apolaritat de la molècula La concentració de determinats ions (gradients decreixents) La presència de molècules que competeixen amb la fase estacionària (detergents) 55 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 CONDICIONS DE TREBALL Quan passem la mostra, a diferència de l’ intercanvi iònic, aplicarem una alta força iònica.
ELUCIÓ Per eluir, hem de fer canvis en la fase mòbil, com ara: - - Disminuint la força iònica o usant molècules que competeixin amb els grups immobilitzats de la fase estacionària (de caràcter apolar), com ara detergents.
Elució per passos o usant gradients de força iònica decreixent que debilitin les interaccions – tenim el fenomen invers a l’intercanvi iònic, ja que eluiran primer les molècules menys apolars, perquè seran els que tinguin una interacció més dèbil amb els grups de caràcter apolar immobilitzats en la matriu. Les últimes molècules en eluir seran les més polars, que es trobaran molt unides a la matriu.
Gradients creixents de detergents o dissolvents orgànics, ja que faciliten que es desprenguin les proteïnes o soluts de la fase estacionària en augmentar l’apolaritat de la fase mòbil desplaçant així l’equilibri.
56 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 RESINES Tenim tipus de matrius molt variats. Poden estar basats en suberosa, en safarosa, poden estar dissenyades per cromatografies d’alta pressió, de pressió mitjana...
Què determina el tipus? La varietat de grups immobilitzats. Tenim una gran varietat de grups, com ara grups alquils, isopropil, fenil, butil... En funció del tipus de grup, necessitarem una major o menor hidrofobicitat per interaccionar amb la matriu. Per exemple, el grup oktyl (no sé com és en català, vuitil? jajajaja) és més hidrofòbic que el butil perquè té més carbonis.
Llavors, en funció de quant hidrofòbica sigui la teva proteïna, necessitaràs fer servir un o alter grup perquè interaccionin adequadament.
AFINITAT Aquesta cromatografia és extremadament específica ja que es basa en propietats específiques de determinades molècules. Necessites lligands específics per la teva proteïna.
Hi ha diverses interaccions basades en afinitat biològica que s’usen de manera general: - - Reacció antigen – anticòs Reacció hormona – receptor Reacció enzims – substrats (amb inhibidors, cofactors...) IMAC – cromatografia d’afinitat per metalls. Podríem separar, per exemple, totes les molècules que tinguin cua d’histidina – és una propietat específica d’una proteïna respecte de la resta de proteïnes cel·lulars, però podem manipular el sistema.
Cromatografia d’afinitat oligo-dt – s’usen per la preparació de mRNA.
PREPARACIÓ DE LA COLUMNA – Protocol general Tenim un suport (pot estar feta d’algun derivat de safarosa, etc.; serà la partícula en la qual faràs l’empaquetat), i aquest suport tindrà grups reactius que tu podràs activar químicament.
Normalment a aquests grups se’ls uneix un braç espaiador, que sol ser una molècula hidrocarbonada de determinada extensió per tal de permetre una millor interacció entre la molècula del suport amb la nostra proteïna.
57 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 D’aquesta manera, evitem impediments estèrics que dificultin la interacció. El braç espaiador impedeix aquest tipus d’impediments en la interacció.
A aquest braç espaiador s’uneix el lligand – aquella molècula per la qual la nostra proteïna o grup de proteïnes tindrà afinitat biològica.
Normalment, aquestes columnes, a no ser que siguin de níquel (despès les veurem, són una mica més transversals), les has de preparar tu manualment.
PROCEDIMENT – Etapes - - Tenim un pas d’equilibrat com en totes les cromatografies.
Tenim un pas de càrrega de la mostra i d’unió del a mostra. El pic que en el gràfic sembla una patata és tot el material que no s’ha unit – tenim el registrador saturat (el tenim posat en un rang, i quan passa tot el que no s’uneix, se satura el registrador de la senyal, perquè la quantitat de proteïna contaminant és major).
Tenim una sèrie de rentats per si alguna proteïna ha quedat atrapada.
Tenim l’elució de la proteïna.
Un cop muntada la columna, la podem reutilitzar, ja que tenim enllaços covalents entre braç espaiador i la columna i entre la molècula lligand al braç espaiador.
58 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 ELUCIÓ Per eluir el solut, hem de desplaçar l’equilibri. Tenim dues maneres de fer-ho.
ELUCIÓ INESPECÍFICA - Podem alterar variables que afectin la interacció – força iònica, pH.
Agents desnaturalitzants Però són tractaments bastant agressius, podríem afectar l’estructura 3D de la nostra proteina.
Per això recorrem a: ELUCIÓ ESPECÍFICA - - Per competència amb una molècula anàloga a la què estem purificant. Per exemple, IMAC cua histidines/imidazol Per competència d’un lligand o una altra molècula que sigui anàloga al lligand que ja tenim. El que és important és que el segon lligand estigui en major quantitat, no que tingui una major afinitat (evidentment tampoc tindrà una menor afinitat).
Per exemple, enzim/substrat/inhibidors.
IMAC – Cromatografia d’afinitat per metalls Aquest tipus de cromatografia s’ha convertit en un dels tipus de columnes més utilitzats des del descobriment de les cues d’histidina. . S’usen per expressar proteïnes recombinants i poder-les purificar de manera fàcil i barata.
Normalment en la cua d’histidina tenim 6 histidines col·locades en el N-ter o C-ter.
Tenim dos tipus de protocols: - En condicions natives – s’usen quan tenim enzims és necessari preservar la seva estructura 3D) En condicions desnaturalitzants – s’usen quan, usant les natives, no aconseguim solubilitzar la proteïna. Això pot ocórrer per diversos motius: o La proteïna s’està expressant com a cossos d’inclusió (en alguns bacteris, les proteïnes en estar tan sobreexpressades que agreguen i formen cossos d’inclusió, els quals no són dissolubles a pH tampó 7. S’han de dissoldre en urea (en concentracions de fins a 8M) o en clorur de guanidina (en concentracions e fins a 6M) o Una altra raó és que sigui una proteïna que estigui unida molt fortament al DNA per tenir una càrrega positiva molt forta. En aquest cas també usem clorur de guanidina perquè trenca interaccions electrostàtiques.
59 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS o PARCIAL 2 Una altra raó és que a vegades tot i estar plegat l’enzim, no està ben plegada (els ponts disulfur no estan ben formats). En aquests casos, al final del procés es posaria l’enzim en condicions renaturalitzants perquè es plegui bé.
Comparant amb un procés de purificació normal, en IMAC tenim una purificació en 1 sol pas i ràpid. El protocol és el següent: - - El primer que fem és lisar les cèl·lules en les condicions en què farem la cromatografia.
Tot seguit centrifugues i passes el lisat per la columna (ja venen preempaquetades).
Seguidament es fan rentats per passos amb quantitats creixents d’imidazol.
L’imidazol competeix pel níquel amb les histidines i desplaça les proteïnes. La columna s’activa amb níquel (barato) i elueix amb imidazol (barato). A més és ràpid i un cop tens el sistema preparat, pots fer-los servir molts cops. Per tant és una cromatografia guay i es fa servir moltíssim.
L’elució de la nostra proteïna es fa al voltant dels 250-300mM d’imidazol.
60 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Perquè totes les proteïnes són capaces d’interaccionar amb el níquel de la columna? Perquè la majoria de proteïnes tenen histidines. La gràcia és que la nostra cromatografia uneix de manera preferencial les histidines, però en fer l’elució per passos, perdem totes aquelles que no tenen 6 histidines seguides. Si totes les proteïnes que tinguessin 1 o 2 histidines també es quedessin enganxades, tindríem moltíssimes proteïnes contaminants.
La preparació d’aquest tipus de columnes és exactament igual que la de cromatografia d’afinitat. Tenim una activació dels grups reactius de la matriu (amb bromur de cianogen (CNBr), epòxids o altres agents oxidants), tenim el braç espaiador i finalment el lligand que quasi sempre és àcid nitrilo-acètic (NTA) o també àcid imino-diacètic (IDA). Aquest lligand és el que estarà unit de forma covalent a la columna inicialment. Després, a cada cromatografia, carregarem en la nostra columna amb sulfat de níquel. El níquel formarà un enllaç de coordinació amb aquest NTA o IDA que té la columna. Quan poses el sulfat de níquel queda d’un color blau-verd que ens indica que el níquel ha quedat retingut en els llocs actius de NTA.
Un cop posat el níquel, rentes la columna amb aigua l’excés de níquel per evitar interaccions inespecífiques amb níquel soluble. Finalment carreguem la mostra on tenim la nostra proteïna amb les cues de 6 histidines.
En aquesta imatge veiem com el níquel forma enllaços de coordinació amb el NTA i amb les histidines de la proteïna, que correspon a la interacció que tenim dins la columna d’afinitat per metalls.
61 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Aquest és un perfil típic d’una cromatografia de cues d’histidines. Tenim el flowthrough corresponent a totes les proteïnes presents en la cèl·lula que no tenen afinitat per la resina.
Després tenim les proteïnes dèbilment unides que les eluïm amb concentracions dèbils i variables d’imidazol. Finalment tenim la proteïna que està unida més fortament a la resina.
Això és un perfil d’absorbància a 210 o a 280nm. Normalment, com usem quantitats creixents d’imidazol, mai tornem a la línia base encara que el pic de la proteïna baixi, sinó que no para de créixer, perquè l’imidazol absorbeix a aquesta longitud d’ona.
Al final de cada cromatografia tenim una dessalat per diàlisi, per columnes de filtració en gel G25 (mètode ràpid, en aquest tipus de columna no entra cap proteïna però si entren totes les sals) per tal d’eliminar l’imidazol, ja que no ens interessa treballar amb 250 mM d’imidazol en el tampó.
OLIGO-DT – Cromatografia d’afinitat pel mRNA La cromatografia d’afinitat també es pot fer servir per purificar altres molècules no proteïnes.
Un dels usos més importants és la purificació del mRNA. El mRNA representa menys del 5% de tot el RNA, per tant la purificació del RNA total no ens serveix, ja que tindrem molt RNA contaminant. Les aplicacions fonamentals de purificar el mRNA són quantificar l’expressió, fer cDNAs per clonar seqüencies, etc.
En ser tant minoritari el mRNA, un dels mètodes es basa en aquesta cromatografia d’afinitat, que està basada en la presència de cues de polyA en la majoria de mRNAs que varia entre els 30 i els 200 nucleòtids.
Les columnes tindran en la fase estacionària un oligo-dt immobilitzat (desoxiribonucleòtid que contindrà timines). Aquest s’unirà per afinitat a aquelles molècules de mRNA que tingui cues de polyA, mentre que els tRNA i els rRNA no tindran aquesta afinitat. Les unions tindran lloc en elevades concentracions de sal, al voltant de 500mM de NaCl. Posteriorment, eluirem el mRNA disminuint dràsticament aquesta concentració de sals posant TRIS, ja que alterem la formació de ponts d’hidrogen entre bases.
62 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 CROMATOGRAFIA LÍQUIDA D’ALTA RESSOLUCIÓ (HPLC) HPLC – High Pressure (Performance) Liquid Chromatography.
No és un tipus diferent de cromatografia – tenim HPLC en cromatografies d’afinitat, en filtracions en gel... La diferència és que aquestes cromatografies es fan a pressions elevades, no a pressió atmosfèrica. Aquí tenim unes bombes que generen una pressió elevada que fa que quan fem una cromatografia per HPLC obtinguem una resolució molt més elevada. És un sistema molt més complicat i car, de manera que generalment s’usa com a tècnica analítica o com a pas final de purificar, no per passar-li litres i litres de mostra.
La seva virtut és que es un procés d’alta resolució, molt repetitiu i consistent i que sol ser bastant ràpid.
En l’HPLC obtenim pics estrets i separats fent gradients molts suaus, ja que tenim bombes programables per indicar la pendent del gradient (en quin mL volem que arribi a X concentració).
Les columnes estan millorades – són més primes i curtes.
63 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Les partícules del suport (jaç cromatogràfic) són molt més petites, cosa que el fa més compacte, més empaquetat, de manera que permet unir millor la mostra i aplicar una pressió major (d’entre 30 i 40 atm).
Normalment el flux va més lent però en general el procés és ràpid.
Esquema general de l’equip HPLC: Tenim varis reservoris on guardem els tampons que volem barrejar per fer l’equilibrat de la columna i l’elució. Tots els tampons són desgasificats ja que les bombolles de gas distorsionen el perfil d’elució (provoquen salts d’absorbància) i fins i tot danys en la columna.
En els tubs de tefló tenim uns filtres per tal que no entrin impureses.
Els dissolvents estan connectats a bombes d’altes pressions que determinaran quina quantitat d’A i B es barrejaran per formar els diferents gradients. Això ho programes tu: per exemple, comencem amb un 100% de A; al cap de XL, comencem a posar B per tal que als X mL arribem al 100% de B. Calcula el pendent del gradient i anirà dispensant alternativament els dissolvents.
Tot seguit tenim la vàlvula d’injecció i les columnes metàl·liques. A la sortida de la columna tindrem un espectrofotòmetre que farà el cromatograma (està sempre associat a un ordinador). També està associat a un col·lector de fraccions per recollir el que surti de la columna cromatogràfica.
64 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Una fotito: Aquí tenim els selectors que determinen què injectaràs, si passaràs el dissolvent a la columna... és el sistema d’injecció.
Tenim un loop on carreguem la mostra amb una xeringa (no carreguem quasi mai més d’1mL).
Tenim diferents posicions. La mostra la pots connectar directament a la bomba o pots fer que passi primer per la bomba i després es connecti a la columna. També podem carregar algun dissolvent per netejar el sistema d’injecció. Llavors posaríem la posició de rebuig (waste).
Les columnes són metàl·liques, todo son tornillos, esto es como bricolaje eh, si si si.
65 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 FASE REVERSA (RP) En HPLC es fa molt sovint la cromatografia de fase reversa, que no és més que una cromatografia d’hidrofobicitat. La diferència és que en la normal la fase estacionària és polar i la fase mòbil és menys polar, mentre que en la reversa l’estacionària és no polar i la mòbil és més polar.
Tindrem una cromatografia que separa en funció de les interaccions hidrofòbiques de les molècules.
El tipus de lligands que tindrem seran: Tindrem grups amino, grups fenil, ciano, C4 (cadena hidrocarbonada de 4C), C8, C18.
Senzillament la hidrofobicitat va augmentant a mida que afegim carbonis.
Això determinarà el tipus de molècules que separarem. Molècules senceres les separem amb C4 i C8. C18 es fa servir per separar pèptids (per exemple, per fer una digestió tríptica per espectrometria de masses).
La fase mòbil solen ser de metanol en aigua o acetonitril. Anem augmentant la quantitat de fase mòbil per anar eluint les proteïnes.
Amb la fase reversa, l’ordre d’elució canvia – si en les normals teníem que les últimes en eluir eren les més polars, aquí seran les primeres (hem invertit la polaritat).
66 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 La presència de les bombes ens permet fer gradients molt suaus, permetent això separar dues substàncies que, en un gradient més abrupte, quedarien en pics solapats (veuríem solament un pic).
L’inconvenient dels gradients més suaus és que com les molècules surten més separades acabes tenint menys intensitat en l’absorbància en els diferents punts, ja que el que abans tenies en 1 ML es reparteix en 4 (per exemple), i l’absorbància és molt menor. Per tant baixa la sensibilitat de les deteccions. Aquest tipus de gradients poden fer que perdis la capacitat de detecció d’alguna proteïna.
67 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 EXEMPLE DE RP APLICAT A LA SEPARACIÓ D’HISTONES Tenim una elució per ordre de polaritat. La histona més polar és la H1 ja que té més AA bàsics (lisines). Després les histones del core elueixen de manera semblant.
Al voltant del 30% elueixen les H1. A partir d’aquí es fa un gradient diferent per poder separar les diferents histones del core i fins i tot diferents variants de cada una. Per tant la capacitat resolutiva de la RP és enorme.
Usem C8 per eluir-les ja que són proteïnes molt bàsiques.
INTERACCIONS HIDROFÍLIQUES (HILIC) Es tracta d’una de les cromatografies més recents. És una cromatografia que barreja aspectes de diferents sistemes cromatogràfics – té punts de contacte amb: - La cromatografia de fase reversa – la fase mòbil és apolar. Concretament s’usa l’acetonitril, tot i que a més percentatge, de fins el 80%.
La cromatografia de fase normal – la fase estacionària és polar. Concretament s’usa la sílice.
La cromatografia d’intercanvi iònic – les mostres que se separen solen ser proteïnes amb càrrega o molt polars. Normalment, separem analits carregats o molt polars.
68 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 Aquesta cromatografia s’usa sobretot quan la fase reversa no ens permet separar determinats grups de proteïnes (és una alternativa a la RP). Té una sensibilitat extrema i es pot acoblar amb molta facilitat als sistemes d’espectrometria de masses (com la RP, és un pas previ a l’espectrometria de masses.
FUNCIONAMENT El funcionament és una mica més complicat perquè hi ha 3 tipus d’interacció: - - Tenim el repartiment entre la fase mòbil poc hidrofílica (80% d’acetonitril) i la fase mòbil que està saturada amb aigua. És important que la fase mòbil contingui almenys un 3% d’aigua (no podem arribar a un 100% d’acetonitril, podem arribar com a màxim al 97%). Aquesta quantitat d’aigua és necessària per produir una capa de solvatació al voltant de les partícules de sílice, i és el que permet que hi hagi repartiment, ja que tindrem una part de dissolvent la concentració de la qual serà menor al 80%. Llavors, en ser aquesta part més polar que l’altra, hi haurà repartiment – les molècules més polars es quedaran en una banda i les menys polars s’aniran on les quantitats d’acetonitril siguin majors.
Interaccions electrostàtiques – les partícules estan carregades, i això permet la separació de compostos carregats.
Ponts d’hidrogen – que les partícules estiguin carregades també permet que es formin ponts d’hidrogen.
69 TÈCNIQUES INSTRUMENTALS PARCIAL 2 En aquestes cromatografies, eluiran primer les molècules més apolars, de manera que l’ordre torna a canviar respecte la cromatografia RP. Els factors que influeixen en la separació tenen a veure amb la càrrega, per tant sortiran primer les molècules menys carregades.
El més important de cada tècnica per predir el resultat és el principi de separació.
EXEMPLE DE HILIC APLICAT A LA SEPARACIÓ DE FÀRMACS HIDROFÍLICS Tenim l’ordre d’elució de diferents fàrmacs. El més apolar és l’acetaminofèn, ja que surt el primer, i el metformin és el que queda retinguin més temps.
Hi ha diferències entre els perfils fets en HPLC i la resta de cromatografies – en els perfils en HPLC sempre es dóna el temps de retenció, cosa que és específic de cada columna. L’eix de les HPLC es dóna en minuts, i es diu que X substància té un temps de retenció de 2,7 min.
S’identifiquen les substàncies pel temps de retenció.
També tenim indicats la fase mòbil (90% d’acetonitril), la resina, la velocitat de flux, a quina longitud d’ona s’ha fet la detecció, el volum d’injecció... Quant al volum d’injecció, veiem que posa 2 μ litres – és una tècnica analítica, per veure què hi ha o per analitzar mostres petitíssimes. Molts cops també s’usa com a control de qualitat de moltes substàncies.
70 ...

Comprar Previsualizar