Tema 9. (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Complutense de Madrid (UCM)
Grado Farmacia - 3º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 20/06/2017
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Profesor Víctor, María Molina

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    Tema  9:  Crecimiento  y  cultivo  microbianos     División  celular  en  los  microorganismos   División  o  fisión  binaria:  una  célula  duplica  su  material   genético  para  que  las  dos  células  hijas  reciban  la  misma   información.  Se  forma  un  tabique  en  medio  de  la  célula  y  se   separan  las  células.     En  el  caso  de  la  levadura,  el  proceso  es  diferente,  aunque  una   célula  se  divide  por  la  mitad  y  da  dos  células  idénticas  a  la   original.     En  las  levaduras  que  se  dividen  por  gemación,  a  la  célula   madre  le  sale  una  yema.  Se  duplican  los  núcleos  y  cuando  la   yema  crece,  se  separa  de  la  primera,  generando  la  célula  hija.   Ocurre  en  Saccharomyces  cerevisiae.       Concepto  de  crecimiento  microbiano   La  descendencia  de  un  microorganismo  unicelular  (bacteria  o  levadura)  es  genéticamente  idéntica  a  la  célula   parental:  es  un  clon  (forma  una  colonia).  La  colonia  es  macroscópica,  hay  una  duplicación  exponencial.     El  crecimiento  de  un  organismo  podemos  considerarlo:   §  A  escala  individual  (tamaño).   §  A  escala  poblacional  (multiplicación).   La  bacteria  crece  cuando  se  multiplica,  porque  es  muy  difícil  medir  un  microorganismo.  Nos  referimos  a  un   crecimiento  en  número.     N  =  2n   En  el  caso  de  las  bacterias  filamentosas,  el  crecimiento  es  apical,  crece  la  punta  del  organismo.  La  generación   de  las  colonias  es  diferente.  Hay  una  duplicación  del  DNA  previa.     En  el  caso  de  las  hifas  de  hongos  hay  también  un  crecimiento  apical.     En  el  caso  de  algunas  levaduras  como  Candida  albicans  a  veces  es  una  división  por  gemación  y  a  veces  emiten   hifas  por  crecimiento  apical  que  forman  micelios  (dimorfiso).  Gracias  a  las  hifas  son  capaces  de  evadir  la   fagocitosis.       Medios  y  condiciones  del  cultivo  de  microorganismos     Los  medios  de  cultivo  pueden  ser:   §  En  placas  de  Petri  con  agar  (medio  sólido).     §  En  tubos  con  agar  profundo,  caldo  o  agar  inclinado.   §  Matraz.   Cuando  se  depositan  microorganismos  con  un  asa  de  cultivo  en  un  tubo  con  agar,  se  hace  una  estría  para   sembrarlos.  Cuando  los  microorganismos  de  multiplican  se  ve  el  crecimiento.   En  los  medios  semisólidos  el  agar  está  a  baja  proporción.  Se  usa  para  ver  la  movilidad  de  los  microorganismos.     En  los  medios  líquidos,  el  microrganismo  se  queda  en  suspensión  en  el  medio  y  se  pone  turbio  cuando  los   microrganismos  tapan  el  paso  de  la  luz.     En  el  medio  sólido  se  puede  sembrar  el  microorganismo  en  la  superficie.  Si  se  dejan  las  células  separadas  se   pueden  observar  las  distintas  colonias  (clones  de  la  primera).  Si  se  ponen  todas  las  células  juntas,  no  se  verán   las  colonias  separadas.     Los  hongos  forman  sustratos  miceliares,  las  colonias  son  más  grandes.  Esporulan  y  dan  un  aspecto   algodonoso.     Si  tenemos  varios  tipos  de  microorganismos  podemos  ver  colonias  distintas  en  la  misma  placa  Petri.     Medios  de  cultivo  según  su  función   §  Medio  general:  crecen  muchos  microorganismos.   §  Medio  diferencial:  hay  un  componente  que  permite  diferenciar  unas  bacterias  de  otras  según  ciertas   reacciones  químicas.  El  medio  CLED  lleva  un  indicador  de  pH:  las  bacterias  que  producen  ácidos  modifican  el   pH  y  el  medio  cambia  a  amarillo.       1       §  Medio  selectivo  (enriquecimiento):  selecciona  unas  bacterias  para  que  crezcan  y  otras  que  no.  Se  pone  un   componente  que  inhibe  algunas  bacterias.  Las  placas  de  medio  EMB  seleccionan  a  las  Gram-­‐.  Si  no  es  una   selección  total,  hablamos  de  enriquecimiento.   Si  queremos  que  en  una  muestra  solo  crezcan  hongos,  pondríamos  un  antibiótico  de  amplio  espectro.       Medios  de  cultivo  según  su  composición     Fuente  de  C   Medio  complejo   Melazas,  extracto  de  carne,  extracto  de   levadura,  infusión  cerebro-­‐corazón     Fuente  de  N   Peptonas,  macerado  de  maíz   Fuente  de  P     Otros  elementos,  iones   Sales:  NaCl,  CaCl2   Factores  de  crecimiento     Medio  definido   Glucosa,  sacarosa,  almidón,  celulosa,   metanol   Sulfato  amónico   Fosfatos  (buffer)   Sales:  NaCl,  CaCl2   Aminoácidos,  vitaminas     En  los  medios  definidos  se  sabe  exactamente  los  componentes  que  hay  y  en  qué  concentración  están.  Están   ya  purificados.   Los  medios  complejos  son  más  baratos  y  aseguran  que  haya  muchos  compuestos.  No  están  purificados.     Influencia  de  factores  físico-­‐químicos  en  el  crecimiento   Oxígeno  (aire  21%):  es  el  aceptor  externo  de  electrones  para  la  respiración.  Si  queremos  que  el  oxígeno  llegue   bien  a  todas  las  células  en  un  medio  líquido,  hay  que  agitar  bien.   Si  tenemos  un  medio  semisólido  (con  un  poco  de  agar  para  que  no  se  mezclen  las  partes)  y  añadimos  un   agente  reductor  que  elimine  el  oxígeno,  en  las  zonas  más  bajas  habrá  mucho  menos  oxígeno.     También  se  puede  añadir  un  indicador  redox  para  ver  dónde  está  realmente  el  oxígeno.     §  Si  el  microorganismo  solo  crece  en  la  parte  superior  del  tubo   (donde  hay  oxígeno),  los  MO  son  aerobios  obligados.  Hacen  la   respiración  aeróbica.  Como  Micrococcus  y  Neisseria.     §  Los  anaerobios  obligados  solo  crecerán  en  la  parte  baja.   Tienen  un  metabolismo  fermentativo  y  no  utilizan  oxígeno.   Como  Bacteroides  y  Clostridium.     §  El  anaerobio  facultativo  puede  crecer  en  ambos  lugares,  pero   crecen  más  en  la  superficie.  Son  capaces  de  hacer  la   fermentación,  respiración  anaeróbica  y  respiración  aeróbica.   Crecen  más  en  la  superficie  porque  tienen  un  metabolismo   más  rentable  en  la  respiración  aeróbica.  Como  E.  coli   (enterobacteria),  Staphylococcus,  Saccharomyces.  La  glucosa   inhibe  la  cadena  respiratoria  de  Saccharomyces,  aun  habiendo   oxígeno,  si  hay  mucha  lactosa,  la  fermenta.     §  Los  microaerófilos  crecen  a  concentraciones  menores  de  oxígeno  de  lo  normal  (2-­‐10%),  una  situación  de   hipoxia.  Hacen  la  respiración  aeróbica,  pero  el  oxígeno  les  es  un  poco  tóxico  en  altas  concentraciones.  Como   Campylobacter,  Helicobacter.     §  Los  anaerobios  aerotolerantes  crecen  también  en  los  dos  sitios,  toleran  el  oxígeno,  pero  no  lo  necesitan.  Son   solo  fermentadores.  Los  microorganismos  con  cadena  respiratoria,  pueden  hacer  normalmente  las   respiraciones  aerobias  y  anaerobias  cambiando  algunas  enzimas,  pero  no  los  fermentadores.  Toleran  el   oxígeno,  por  eso  crecen  por  arriba.  Como  Lactobacillus  y  Streptococcus.                   2       Formas  tóxicas  del  oxígeno   Puede  hacer  reacciones  de  oxidación  en  la  célula  que  produzcan   formas  tóxicas  del  oxígeno.  Pueden  generar  anión  superóxido,  agua   oxigenada,  radical  hidroxilo,  etc.     Enzimas  que  protegen  de  las  formas  tóxicas  del  oxígeno:   Los  MO  que  no  tienen  estas  enzimas  no  pueden  vivir  en  presencia  de   oxígeno.     Los  microaerófilos  tienen  algunas  enzimas,  por  eso  no  tienen  gran   tolerancia  al  oxígeno.     La  presencia  de  catalasa  es  una  forma  de  diferenciar  los  diferentes   microorganismos.  Si  se  pone  agua  oxigenada  en  bacterias  con  catalasa   se  genera  oxígeno.         Si  sabemos  que  un  microorganismo  es  anaerobio  estricto,  lo  ponemos  en  una  jarra  de  anaerobiosis.  Se  cierra   herméticamente  cuando  se  añade  un  sistema  comercial  que  libera  CO2  e  hidrógeno.     Para  crear  condiciones  de  microaerofilia,  se  disminuye  la  concentración  de  O2.  Se  puede  hacer  encendiendo   una  vela  dentro  de  una  jarra.     Los  capnófilos  requieren  CO2.   Hay  cámaras  anóxicas,  en  las  que  todo  el  ambiente  está  libre  de  oxígeno.  Se  maneja  con  guantes.  Se  hace  si  la   anaerobiosis  debe  estar  en  el  proceso  de  cultivo  también.     Temperatura     La  temperatura  es  importante  para  la  velocidad  de  crecimiento  de  los  microorganismos.     Hay  temperaturas  mínimas  y  máximas  por  encima  y  por  debajo  de  las  cuales  no  son  capaces  de  crecer.   También  hay  una  temperatura  de  crecimiento  máximo,  en  la  que  el  MO  no  puede  crecer  más  rápido.  Indica   qué  tipo  de  MO  tenemos.   Los  que  están  en  la  primera  curva  son  los  psicrófilos,  viven  en  medios  fríos.  Su  máxima  de  crecimiento  es  4-­‐ 5ºC,  como  Flavobacterium.  Es  un  problema  para  la  conservación  de  alimentos  en  frío.   Los  psicrótrofos  viven  bien  a  20ºC,  como  Listeria,  Pseudomonas,  Yersinia.     En  los  mesófilos  se  encuentran  la  mayoría  de  los  patógenos,  viven  a  35ºC,  la  temperatura  del  cuerpo  humano.   Los  termófilos  tienen  temperaturas  óptimas  de  60ºC.  Como  Thermus.   Los  hipertermófilos  tienen  como  temperatura  óptima  100ºC  o  más,  como  Pyrococcus  (arquea).  Las  arqueas   crecen  en  condiciones  extremas.       3         Bajas  temperaturas:     Estas  bacterias  se  han  adaptado  a  este   ambiente.  La  membrana  de  una  bacteria   normal  a  baja  temperatura  se  solidifica.   La  membrana  de  estas  bacterias  se   gelifica,  tiene  proteínas  con  pocas   láminas  b  y  muchas  hélices  a  (más   flexibles).  Los  ácidos  grasos  son   insaturados  y  de  cadena  más  corta  (más   fluida).  Las  grasas  más  saturadas  se   solidifican  muy  rápidamente.     Altas  temperaturas:   Se  desnaturalizarían  las  proteínas  y  la  membrana  se  fluidificaría  demasiado.   Las  proteínas  están  muy  empaquetadas,  con  interior  muy  hidrofóbico  (resistencia  a  desnaturalización  en   ambiente  acuoso).  Los  ácidos  grasos  son  saturados  y  tienen  una  monocapa  lipídica.       Presión  osmótica   Está  en  función  de  la  concentración  de  solutos  (osmófilos),   como  sal  (halofilia),  azúcar  (sacarofilia).   La  pared  celular  sirve  para  soportar  la  presión  osmótica.  Hay   microorganismos  cuya  concentración  osmótica  interior  es   mayor  que  en  el  exterior.  Tiende  a  salir  el  agua  de  la  célula,   tienen  que  estar  en  ambientes  de  alta  concentración.     Mecanismos  de  aumento  de  concentración  interna  de  solutos:   §  Bombeo  de  iones  al  interior.   §  Síntesis  de  solutos  compatibles,  como  azúcares,  alcoholes   (glicerol).  No  les  son  tóxicos,  ni  los  metabolizan.     Hay  no  halófilos  (E.  coli),  halotolerantes  (Staphylococcus),   halófilos  (Vibrio)  y  halófilos  extremos  (Halobacterium   (arquea)).       Actividad  del  agua   Hace  referencia  a  la  disponibilidad  del  agua  del  ambiente  y  cómo  afecta  a  los  microorganismos.   Aplicaciones:  alimentos  deshidratados,  alimentos  azucarados  y  salazones.     Bacterias:  aw  >  0,9   Hongos:  aw  >  0,7   Hay  algunas  especies  de  bacterias  que  pueden  sobrevivir  a  aw  <  0,9,  pero  no  es  lo  normal.  Lo  mismo  ocurre  en   el  caso  de  los  hongos.       pH   Hay  microorganismos  acidófilos  (hongos,   bacterias  lácticas),  neutrófilos  (E.  coli)  y  basófilos   (Vibrio  cholerae,  Bacillus).   El  pH  óptimo  de  Picrophilus  es  0,7  de  los  suelos   volcánicos.  Los  que  viven  en  pH  muy  básicos   están  en  lagos  alcalinos.     Dependiendo  del  pH  de  un  alimento  o  solución,   habrá  más  o  menos  posibilidad  de  crecimiento  de   determinadas  bacterias.         4       Ciclo  biológico  y  cultivo  de  bacterias  intracelulares  obligadas:  Chlamydia,  Coxiella,  Rickettsia   El  género  Chlamydia  tiene  un  ciclo  de  vida  bifásico:  tiene  un  cuerpo   elemental  (inactivo,  resistente  e  infectivo)  y  un  cuerpo  reticulado   (activo,  lábil  e  intracelular).  El  cuerpo  elemental  infecta  una  célula  y   pasa  a  ser  un  cuerpo  reticulado.  Cambia  su  estructura  y  sintetiza   factores  de  virulencia.  Cuando  se  multiplica  libera  los  cuerpos   elementales.     En  el  laboratorio  hay  que  cultivarlos  en  tejidos  vivos,  como  el  embrión   de  pollo  o  cultivos  celulares.     El  género  Treponema  hay  que  mantenerlo  en  el  interior  de  un  animal,   no  se  puede  hacer  un  cultivo.     Crecimiento  microbiano  en  biopelículas  (biofilms)   Liberan  exopolímeros  con  capacidad  de  adhesión.  Forman   microcolonias  que  liberan  la  matriz  extracelular  (exopolisacáridos).   Forman  las  películas  que  se  adhieren  a  la  superficie  y  a  partir  de  aquí  se  dispersan.   Si  queremos  cultivarlas  debemos  poner  un  medio   de  adhesión.  Hay  sistemas  específicos  de  cultivo   que  implican  una  superficie  en  la  que  se  puede   adherir  la  bacteria.     Enfermedades  infecciosas  por  la  formación  de   biofilms:  placa  dental,  endocarditis,  fibrosis  quística,   otitis  media,  catéteres  urinarios,  implantes.       Comunicación  celular  en  los  biofilms:  ``Quorum  sensing´´   Las  células  ``detectan´´  la  densidad  de  la  población  bacteriana:   §  Las  células  secretan  moléculas  específicas  que  pueden  detectar  otras  células.   §  Regulan  la  arquitectura  del  biofilm.   §  Regulan  la  virulencia.   Las  moléculas  se  utilizan  para  hacer  los  biofilms,  secretar  toxinas,  etc.  Cuando  hay  un  reconocimiento  de  alta   densidad  celular,  se  pone  en  marcha  un  programa  de  virulencia  o  de  formación  de  biofilms.     Se  están  buscando  moléculas  que  inactiven  las  moléculas  del  quorum.  Si  se  eliminan,  las  células  no  se  dan   cuenta  de  que  hay  muchas  y  no  activan  la  virulencia.     Cinética  del  crecimiento  microbiano   N  =  2n   Es  para  ver  cuántas  células  hay  en  un  cultivo  y  predecir  cuantas  habrá  al  cabo  de  un  tiempo.   El  número  de  células  crece  exponencialmente,  por  lo  que  encontramos  una  curva  exponencial.     Parámetros:   §  Velocidad  de  crecimiento  (v)   §  Tasa  específica  de  crecimiento  (µ)   §  Tiempo  de  generación  (g,  tg)   El  tiempo  de  generación  (tiempo  de  duplicación)  es  el   periodo  que  requieren  las  células  de  una  población   microbiana  para  crecer,  dividirse  y  dar  lugar  a  dos  nuevas   células  por  cada  una  de  las  que  existían  anteriormente.     N  =  t/tg   El  tiempo  de  generación  es  constante  para  un   determinado  microorganismo.       N  =  N0  ·∙  2n  =  N0  ·∙  2t/g   ! ln  N  =  ln  N0  +    ·∙  ln2   "   5       Es  complicado  trabajar  con  curvas  exponenciales,  por  lo  que  lo  convertimos  en  recta  si  tomamos  logaritmos.       Si  partimos  del  razonamiento  de  que  es  una  velocidad  de  crecimiento,  llegamos  a:     #$ #!  =  µ  ·∙  N   $ #$ !    =  µ   ' dt   %&' $ ln  N  =  lnN0  +  µ  ·∙  t   La  tasa  específica  del  microorganismo  es  una  medida  del  número  de  divisiones  por  célula  y  por  unidad  de   tiempo  (t-­‐1)  µ  =  dN/N/dt   µ  =     *%+ "  à  µ  =   ',-./ "   µ  y  g  son  constantes  y  específicos  según:   §  Microorganismo.   §  Condiciones  de  cultivo:  medio,  temperatura,  pH,   aireación,  etc.     Cálculo  de  µ  en  un  experimento:   No  todos  los  puntos  salen  en  la  recta  porque  son   experimentos.     Se  hace  la  regresión  lineal:  y  =  A  +  Bx  à  ln  N  =  lnN0  +  µ  t   El  coeficiente  de  correlación  lineal  R  debe  ser  cercano  a  1.       También  se  puede  hacer  un  cálculo  gráfico  de  g:   Se  usa  un  papel  semilogarítmico  (papel  decimal).  En  la  recta   semilogarítmica  se  hace  la  representación  gráfica.     Al  representar  lnN  frente  al  tiempo,  podemos  comprar  microorganismos   entre  sí  o  cómo  se  comporta  un  mismo  microorganismo  en  diferentes   condiciones.  La  de  pendiente  mayor  tiene  µ  mayor  y  menor  g.     A  veces,  medimos  el  peso,  no  el  número  de  microorganismos.  El  peso  es   una  medida  del  número  equivalente  de  células.  La  X  es  la  biomasa,   equivalente  al  número  de  células  (N).     E.  coli  tiene  un  tiempo  de  generación  muy  corto,  minutos.  Mycobacterium   tiene  un  tiempo  de  generación  muy  largo,  12  horas.  Sacharomyces  cereviasiae  es  de  2  horas.  Si  cambiamos  las   condiciones,  varía  el  tiempo  de  generación.     Cultivo  en  medio  no  renovado   Si  hacemos  un  cultivo  en  medio  no  renovado,  tenemos  un  matraz  y  se  inoculan  microorganismos,  hay  un   tiempo  en  el  que  no  hay  multiplicación  microbiana,  y  luego  hay  un  crecimiento  exponencial;  es  una  recta.   Llega  un  momento  en  el  que  el  crecimiento  se  detiene  y  las  células  empiezan  a  morirse,  disminuyendo  su   número.  Se  pone  un  número  de  nutrientes  y  no  se  vuelven  a  añadir  más.   En  la  primera  fase  (fase  de  latencia),  la  pendiente  es  prácticamente  0,  no  hay  crecimiento.  Estas  células   pueden  haber  estado  conservadas  en  frío  para  que  no  se  multipliquen.  Necesitan  un  tiempo  para  adaptarse  a   las  nuevas  condiciones  y  volver  a  poner  sus  estructuras  y  metabolismo  en  marcha.  En  el  medio  de  cultivo,  la   glucosa  y  nutrientes  están  fuera  de  las  células,  debe   entrar  en  la  célula.     Cuando  las  células  empiezan  a  dividirse,  hay  un   crecimiento  exponencial.  Encontramos  una  tasa   específica  de  crecimiento  constante,  que  es  la   máxima  que  pueden  alcanzar.  La  pendiente  de  la   recta  (µ)  es  la  tasa  máxima  de  crecimiento  en  esas   condiciones.     En  la  fase  estacionaria  hay  una  meseta,  la  velocidad   de  crecimiento  es  0.  Se  han  agotado  los  nutrientes.   Están  metabólicamente  activas,  pero  no  consiguen     6       dividirse.  Tras  un  tiempo,  entran  en  una  fase  de  muerte.  La  velocidad  de  crecimiento  tiene  una  pendiente   negativa  (-­‐k).     Que  la  célula  pueda  o  no  desarrollar  su  tasa  de  crecimiento  depende  de  la  concentración  de  nutrientes  que   ponemos.   En  el  momento  de  aceleración  y  desaceleración  del  cultivo,  la  tasa  específica  de  crecimiento  es  mayor  que  0  y   menor  que  la  máxima.  Es  un  tiempo  muy  limitado,  en  el  que  tenemos  todas  las  posibilidades  de  tasas   específicas.     Ocurre  porque  la  concentración  de  nutrientes  determinan  la  tasa  específica  de  crecimiento.  Si  hacemos  una   determinación  de  la  tasa  específica  de  crecimiento  frente  a  las  concentraciones  de  nutrientes,  vemos  que  la   representación  es  similar  a  la  de  Michaelis-­‐Menten.  La  célula  es  un  conjunto  de  enzimas,  que  se  saturan  de   sustrato.  La  tasa  máxima  es  cuando  tienen  un   exceso  de  sustrato.  Cuando  el  sustrato  está  por   debajo  de  la  tasa  máxima,  tenemos  menos   crecimiento.   La  Ks  es  la  concentración  de  sustrato  en  la  que   hay  la  mitad  de  la  tasa  máxima.  Cuanto  más   pequeña  es  Ks,  antes  llegamos  a  la  tasa   máxima.     Cuando  se  está  acabando  la  glucosa,  tenemos   una  tasa  que  va  bajando  de  la  máxima.       Cultivo  continuo  en  quimiostato   Es  para  que  las  células  crezcan  de  manera  constante.  Tiene  que  solventar  el  problema  de  que  el  sustrato  se   acabe.     Se  hace  en  un  quimiostato,  mantenemos  constante  la  concentración  de  sustrato  en  el  recipiente,  lo  que   mantiene  constante  el  crecimiento  del  microrganismo.  Mantenemos  un  volumen  fijo  de  cultivo.  Si  este  es   superior,  el  cultivo  cae  por  un  rebosadero.  Tiene  que  haber  un  medio  de  cultivo  fresco  que  va  entrando   continuamente.  Hay  una  misma  velocidad  de  entrada  del  medio  que  de  salida.     En  la  entrada  solo  entra  medio  de  cultivo  y  en  la   salida  salen  medio  de  cultivo  y  células.     Además,  hay  que  airearlo  para  que  tenga  oxígeno.   Las  células  crecen  en  el  medio  de  cultivo  a  una   velocidad  determinada:   dN/dt  =  µ  ·∙  N   La  velocidad  de  salida  de  las  células  es:   dN/dt  =  F/V  ·∙  N  =  D  ·∙  N   µ  =  D  (factor  de  dilución)   F  à  flujo   El  factor  de  dilución  es  lo  que  tarda  en  renovarse  el   medio  de  cultivo.   Queremos  que  las  células  crezcan  a  la  misma   velocidad  a  la  que  salen  las  células  por  el  rebosadero.  Cuando  la  tasa  de  crecimiento  es  mayor  que  el  factor  de   dilución,  se  acumulan  las  células  y  el  sistema  se  colapsa.  Si  el  crecimiento  es  menor  nos  quedamos  sin  células.     Las  células  que  tenemos  se  van  cambiando,  no  son  siempre  las  mismas.     El  MO  recibe  el  sustrato,  lo  usa  y  luego  se  va  por  el  rebosadero.     Si  ponemos  un  flujo  que  hace  que  la  concentración  dentro  del  quimiostato  sea  suficiente  para  que  el  MO   crezca  con  su  tasa  máxima,  con  cualquier  fluctuación  de  sustrato  las  células  no  tienen  capacidad  de  remontar   (están  en  su  tasa  máxima).   La  concentración  de  sustrato  tiene  que  estar  por  debajo  de  la  tasa  máxima,  por  si  aumenta  la  concentración   de  sustrato  por  una  fluctuación.     Dentro  del  quimiostato  tenemos  una  biomasa  constante,  µ  constante  <  µmax  y  un  tiempo  prolongado.       Medida  del  crecimiento  microbiano   Métodos  directos:   §  Medida  del  número  de  células:       7       -­‐  Recuento  total  de  células  directo  al  microscopio  (cámara  Neubauer,  Thoma).  Se  cuentan  las  células  que   caben  en  un  volumen  determinado  gracias  a  una  retícula  que  nos  ayuda  a  contar.  Se  miden  las   células/volumen.  Si  hay  muchas  células  en  el  cultivo  y  no  se  pueden  contar,  hay  que  diluirlo.  Se  puede  usar   un  contraste  de  fases  para  ver  mejor  las  células.  Un  problema  es  que  es  un  recuento  de  células  viables  y  no   viables  (vivas  y  muertas).  Se  puede  hacer  una  tinción  vital  que  tiña  solo  las  vivas  o  una  tinción  que  tiña  solo   las  muertas.  Limitación:  microorganismos  filamentosos  porque  no  sabemos  cuántas  células  componen  el   microorganismo.     -­‐  Contador  electrónico  de  partículas  (Coulter,  etc).  Hay  una  célula  fotoeléctrica  que  pasa  por  el  detector,  se   corta  la  señal  y  se  van  contando  las  células  según  pasan.  Se  cuentan  las  células  viables  y  no  viables.  Hay   contadores  que  sí  distinguen  vivas  y  muertas  haciendo  tinciones  vitales,  pero  se  suelen  utilizar  para   experimentos  más  complejos.     -­‐  Recuento  del  número  de  células  viables  (UFC):  se  siembra  una  cantidad  determinada  de  la  muestra  en  una   placa  de  Petri  con  un  medio  nutritivo  y  se  ven  las  que  son  capaces  de  producir  colonias.  Se  extiende  por   toda  la  placa  y  se  lleva  a  incubar.  Aparecen  las  colonias  en  la  superficie,  se  cuentan  y  se  ve  cuántas  células   había  inicialmente.  No  podemos  tener  la  absoluta  seguridad  de  que  cada  colonia  provenga  de  una  sola   célula,  por  eso  se  habla  de  unidades  formadoras  de  colonias.  Si  había  una  alta  concentración  de  células  no   se  verá  nada.  Se  puede  mirar  al  microscopio,  contar  las  células  y  luego  cultivarlas;  o  hacer  sucesivas   diluciones  e  ir  sembrándolas  en  las  placas.  Se  asume  que  se  pueden  contar  bien  un  número  de  colonias   entre  30  y  300.  Luego  se  multiplica  por  el  factor  de  dilución.  La  limitación  es  que  requiere  un  tiempo  de   crecimiento.     §  Medida  de  la  masa  celular  o  biomasa  (X):     -­‐  Determinación  de  peso  seco  (en  estufa  hasta  peso  constante)  o  peso  húmedo.  Se  hace  filtración  a  vacío   sobre  un  filtro  bacteriológico.  Las  bacterias  que  se  han  quedado  se  pesan.  Si  es  peso  seco,  hay  que  dejarlo   en  la  estufa.  Si  es  peso  húmedo  es  más  impreciso,  pero  más  rápido.       Métodos  indirectos:   §  Medida  de  la  densidad  óptica  o  la  turbidez  de  una  suspensión  celular  (absorbancia  en  espectrofotómetro).   Cuando  crecen,  enturbian  el  medio  de  cultivo,  porque  es  una  suspensión  celular.  A  mayor  absorbancia,   mayor  turbidez  y  más  células.  Es  diferente  según  el  microorganismo.  El  problema  son  los  microorganismos   filamentosos,  que  forman  grumos  por  los  micelios.  No  hay  equivalencia  con  el  número  de  células.       8   ...

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