Tema 2. Expressió gènica en procariotes (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular de Procariotes
Profesor S.C.
Año del apunte 2014
Páginas 12
Fecha de subida 07/11/2015
Descargas 3
Subido por

Vista previa del texto

Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo EXPRESSIÓ GÈNICA EN PROCARIOTES 1. EXPRESSIÓ GÈNICA En procariotes la transcripció i la traducció estan acoblades, és a dir, que es donen en el mateix lloc. Tenim el que s’anomena polisoma, que no es res més el punt on té lloc la transcripció i la traducció, i per tant tot allò que agrupa aquests dos conceptes (ribosomes, polipèptids, RNA, RNA-polimerasa). El lapsus de temps entre els dos processos es tant a prop que es pot dir que es L’inici de replicació s’anomena +1 donen alhora.
2. ESTRUCTURA DELS GENS BACTERIANS DNA  mRNA (si és el cas)  polipèptid.
2.1. DNA En el DNA trobem les cadenes:  Cadena codificant: igual en forma que el mRNA;  Cadena motlle: utilitzada per la RNA-polimerasa.
A la cadena codificant es troba la regió ORF (Open Reading Frame), que és una seqüència de triplets que codifica per un polipèptid (és un gen). En un fragment de DNA, marquen 6 pautes de lectura, i en el RNA transcrit estaran aquestes diferents pautes de lectura que determinaran el gen codificat.
1 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo Si la lectura fos al atzar, es trobarien regions STOP, ja que no es llegiria una regió que codifica per un gen (si es posessin nucleòtids al atzar no es codificarien tots en gens). De manera que els nucleòtids estan disposat d’una determinada manera per que al ser llegida la pauta, pugui codificar per un determinant gen.
Els virus poden utilitzar el mateix transcrit per codificar tres o quatre proteïnes diferents segons la pauta de lectura que agafi en el moment.
2.1.1. Regions pròpies de les cadenes de DNA Regió promotora: reconeguda per la RNA-polimerasa i permetrà la síntesi del mRNA. Es trobarà davant de la regió que serà transcrita i no esta inclosa (no en la seva totalitat) en el nou RNA.
Esta composada per dues regions: - Regió –35: regió de reconeixement de la RNA-polimerasa.
- Regió –10 (TATA box): regió d’unió de la RNA-polimerasa.
Regió terminadora: regió del DNA, i que també es trobarà en el RNA, que permetrà aturar a la RNA-polimerasa. S’ha d’alentir l’enzim per aconseguir que es pugui desenganxar.
2.2. RNA El mRNA contindrà zona anteriors i posteriors del que esta codificat en el gen, de tal manera que el primer codó de la traducció, el codó d’inici (AUG), és a partir del qual es traduirà el polipèptid. També, es troben els codons STOP (àmbar (UAG), ocre (UAA) i sèpia (UGA)).
* Són color molt semblants, és a dir, es diuen de tres noms diferents però son igual.
Davant de la regió codificant del mRNA s’anomena regió líder, on es troba el RBS – SD (regió d’unió dels ribosoma o Shine-Dalgarno). El primer ribonucleòtid que generarà el mRNA al inici de la transcripció serà A o G. Darrera de la regió codificant es troba al regió tràiler.
3. UNITATS TRANSCRIPCIONALS Les unitats transcripcionals que podem torbar en bacteris poden ser: - Monocistròniques: només codifica la informació per un únic gen (únic mRNA). El transcrit conté un únic ORF.
- Policistròniques: composat per la presencia de més d’un gen. Contenen més d’un ORF que es transcriuran amb un únic promotor. Normalment els gens codificats en una mateixa unitat estan relacionat a nivell funcional i formen un operó.
En eucariotes també existeixen unitat policistròniques.
Ex: unitats transcripcionals de alguns mitocondris.
2 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo D’un policistrònic, amb 3 gens, trobarem: tres RBS (regions d’unió del ribosoma), 3 ORF i 3 regions d’STOP. Només hi ha una regió promotora, mitjançant la qual quan comenci la traducció es farà de tot l’operó alhora, però cada gen tindrà el seu inici i la seva senyal d’STOP.
El frame que té que llegir el ribosoma es decidit per el RBS.
3.1. EFECTE POLAR En procariotes la traducció i la transcripció estan acoblades. Això vol dir que a mesura que la RNA-polimerasa va avançant i produint mRNA, en el moment que aquest surt, queda un RBS accessible que es reconegut per un ribosoma. De manera que el ribosoma (polisoma) traduirà el producte gènic, tot i que encara no hagi acabat la transcripció.
A nivell d’expressió gènica, la posició dels gens variarà la quantitat relativa de productes gènics que obtenim. En tant que el primer gen que es transcrit, a la que es transcriu el RBS, es traduirà més aviat que els gens que venen a continuació. Això implica que al final, tot i que tots el gens es traduiran, el primer gen s’haurà traduït molts més cops que no l’últim. Ja que en el moment en el que el ribosoma avança pel transcrit i es desensambla del RBS, van entrant més ribosomes nous.
A més, el ribosomes oculten amb el seu gran tamany els pròxims RBS que es podrien transcriure; i serà aquest mateix ribosoma el que el reconeixerà quan acabi de traduir.
També, s’afegeix el fet que el mRNA es comença a degradar per l’extrem 3’ (el de l’últim cistró).
L’efecte polar, per tant, és el fet que la quantitat relativa de productes gènics es relatiu segons la posició del gen a partir del qual seran traduïts.
3 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo El RNA no és res més que una cadena única, però aquests poden formar bucles entre regions palindròmiques (complementaries entre elles) mitjançant ponts d’H – el RNA es pot plegar i forma estructures secundaries.
Aquestes estructures de doble cadena resultants són desfetes per el ribosomes. Si el ribosoma té estirat el RNA permet que altres ribosomes s’ajuntin al RBS, ja que amb la estructura secundaria això seria impossible (quedarien tapats el RBS).
Per tant en una unitat transcripcional es trobaria la regió d’STOP d’un gen, la regió RBS (normalment AGGA) i tot seguit la pauta de lectura pròpia del gen. Es poden donar, però, altres situacions: Cas 1. La regió d’STOP i RBS estiguin unides, de manera que el ribosoma es desassemblaria i es tornaria unir molt seguidament.
Cas 2. RBS es situa davant de l’STOP del gen anterior. Si s’acaba d’ancorar a RBS, el que busca el ribosoma són específicament els triplets d’inici de traducció (metionina).
De la mateixa manera, si ja hi ha un ribosoma funcionant, no farà cas als triplets d’inici ni RBS, sinó que buscarà serà les regions STOP.
Cas 3. El marc de lectura es marcat per el RBS, de manera que si estan enganxats el STOP i la regió d’inici de la traducció d’un gen, la regió STOP no serà important (no entrarà dins del marc de lectura). La hipòtesis no es correcta.
Inclòs ens podem trobar gens que la codificació esta solapada amb un altre, en aquests casos el marc de lectura es essencial. Si em entès que el RBS marca el marc de lectura amb el que es llegeix el RNA, els gens que estan codificats per la mateixa unitat policistrònica poden tornarse marcs de lectura diferents.
4 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo El RBS no es més que una seqüència d’ancoratge del ribosoma, en tant que es reconeguda per aquest amb afinitat. Com més optima sigui la regió, més potent serà el RBS (més afinitat tindrà el ribosoma).
Aquest fa que l’efecte polar d’una unitat transcripcional es pugui modular jugant amb l’afinitat relatives del RBS. Ja que si aquestes no són iguals, els ribosomes anirà a per el RBS amb més afinitat. De forma que si el tercer gen té un RBS amb molta més afinitat, serà aquest el gen que més es tradueixi. És a dir que modulant les afinitats, la cèl·lula podrà modular l’efecte polar.
3.1.1. Mutacions polars Mutacions es produeix en un lloc determinat, però que tenen efectes a gens colindants.
Ex: Tenim un mRNA amb tres cistrons diferents, i es produeix una mutació sense sentit (introdueix regió STOP) en mig d’una seqüència codificant. Això provocarà que el ribosomes quan arribin aquest punt es desensamblaran. Això pot tenir un efecte polar en els altres gens, és a dir, que pot acabar produint una disminució dels gens que van més endavant.
4. PROMOTORS BACTERIANS L’inic de la transcripció és diferents en eucariotes i procariotes. En el cas de procariotes, la RNA-pol reconeix directament un promotor i inicia la transcripció.
- Regió TATA (-10): és on s’enganxarà la RNA-pol per iniciar la transcripció.
- Regió -35: és de reconeixement.
Regions consens: si es comparen moltes regions d’aquest tipus, trobarem quins son els nucleòtids que es trobin més probablement. Aquesta, però, no té perquè ser la regió òptima de reconeixement. És a dir, hi ha promotors forts i febles segons varin les regions d’ancoratge 5 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo i reconeixement, i les fortes no han de ser obligatòriament les de consens. Els promotors forts es transcriuran molt, ja que la constant d’afinitat de la RNA-pol d’aquest és molt alta i actuarà segur. Això, per tant, es una de les manera per regular l’expressió gènica a nivell evolutiu.
No tots bacteris tenen les mateixes regions -35 i -10, cada microorganismes adapta les seves seqüències a la seva situació. Un dels factor que afecta és el contingut en G-C (si té poc contingut T-A la regió TATA serà molt diferent i tindrà més G-C).
La RNA-pol esta prou conservada entre els diferents microorganismes. Segurament els promotors forts d’un microorganismes, si es canvien de microorganismes, ja no tenen perquè ser tant forts. Però seguirà sent promotor igualment.
També són importants les posicions relatives. I el canvis poden afectar al força que tingui el promotor.
No només la distancia del promotor i l’afinitat d’aquest controlen l’expressió, sinó que també hi ha altres mecanismes. Poden existir més d’un promotor en la mateixa regió i aleshores s’han d’incrementar els mecanismes de regulació i modulació d’expressió gènica:  Continus: hi ha gens que es transcriuen a partir de dos promotor diferents. En determinades condicions pot funcionar un promotor i en altres funcionar l’altre.
 Solapats: són excloent, quan funciona un no funciona l’altre. Estan juntes la regió -35 i -10 i no poden funcionar el dos alhora.
 Enfrentats: quan s’expressa un, l’altre es impossible que s’expressi. Un del promotors es trobarà a la unitat codificant de l’altre gen.
 Oposats: quan es reconeix un, l’altre no es podrà reconèixer, ja que la RNA-pol ocupa el lloc de reconeixement de l’altre promotor.
 Generar productes diferents: en gens policistrònics (més d’un producte codificant) poden estar en regions codificants, de manera que la unitat transcripcional que surti sigui només monocistrònica (només transcriurà el gen que ve després del promotor).
Poden funcionar “alhora” el promotor que es trobi a la posició relativa normal i el que es troba en mig de la regió codificant. Aquesta regulació pot estabilitza l’efecte polar.
6 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo A part de la regió d’ancoratge (-10) i de reconeixement (-35) hi ha una regió UPS (upstream) i DSR (down-stream).
La UPS està més enllà de la regió -35 (a 5’) i el DPS esta més endavant del -10 (a 3’).
La majoria de vegades, els activador trobaran la regió d’ancoratge a la regió UPS (faciliten que la RNA-pol entri), i els repressor trobaran les regions d’ancoratge a la regió DPS (bloquegen la transcripció – la RNA-pol no pot reconèixer o avançar).
5. INICI DE LA TRANSCRIPCIÓ La RNA-pol reconeix la regió -35 i acte seguit trobarà al DNA la regió -10 i s’ancorarà de manera molt forta aquesta regió. Un cop estigui estabilitzada serà molt difícil fer-la saltar, però si no troba al regió -10 es desenganxarà del DNA.
 Si disposem de regió UPS activa, quan aquesta capta la RNA-pol (per afinitat) trobarà ràpidament la regió de reconeixement perquè l’UPS doblegarà el DNA per posicionar RNA-pol.
Per iniciar la transcripció, per tant, fa falta que la RNA-pol vegi la regió -35. Per això fa falta que la torsió del DNA mostri la regió, ja que sinó el promotor passa desapercebut. Por passar que als promotor s’enganxin diferents proteïnes (Ex: proteïnes FIS) i que provoquin que la torsió del DNA variï per permetre el reconeixement de la regió encara que aquesta pugui ser feble (pot fer-se molt forta si les proteïnes s’acoblin de manera condicionant).
Si les regions no es troben a la distància normal, l’afinitat per la RNA-pol no és molt alta. En aquests casos poden actuar proteïnes a la regió UPS i DPS les quals ajuntaran les regions -35 i -10 i que així la RNA-pol pugui actuar com forta afinitat (això pot ser també un control de l’expressió gènica). Aquesta distància es podria corregir també amb enginyeria genètica.
7 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo 5.1. RNA-POLIMERASA Holoenzims amb diferents subunitats amb una funció determinada cada una d’elles. Tots els gens vinculats amb la RNA-pol s’anomenen rpo.
- rpoA subunitat α: permet la interacció entre el RNA i el DNA (permet la unió amb el promotor a la regió -10).
- rpoB subunitat β: unió nucleòtids.
- rpoC subunitat β’: unió DNA motlle.
- rpoD subunitat σ: permet el reconeixement del promotor (es reconeix la regió -35).
El nucli de la polimerasa son totes les subunitat menys la subunitat σ. Això pot ser un altre manera de control: existeixen diferents subunitats σ, on cada una té regions optimes i consens diferents a la resta. En funció de la subunitat σ que s’uneix l’òptim del promotor que busqui serà diferents.
En la RNA-pol hi ha canal d’entrada del DNA i de sortida del RNA. La subunitat σ es troba intercalada a la RNA-pol i fa que el mRNA no pugui sortir, ja que bloqueja el canal de sortida.
És per això que quan la RNA-pol polimeritza la subunitat s’ha s’escindir.
Podem tenir en diferents fases de creixement que la concentració de les diferents subunitats σ va variant i això controla tot el programa de transcripció de la cèl·lula (gens que s’expressen en cada moment). De manera que el patró d’expressió es modula a partir de la degradació i producció d’aquesta subunitat.
La RNA-pol i la DNA-pol són molt diferents alhora d’actuar. A la DNA-pol algú obre les cadenes per ella i aquesta anirà polimeritzant aleshores. En el cas de la RNA-pol, davant i darrera de l’enzim no es veuran cadenes obertes (tot i que estan obertes), ja que l’obertura es produeix dintre de la RNA-pol. La pròpia RNA-pol serà la que girarà el DNA amb a torsió necessària per evitar d’entortolligament.
8 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo 5.2. PROCÉS DE LA TRANSCRIPCIÓ PER LA RNA-POL A la part externa del nucli, allà on ho permetia el molecular crowding, es trobarà DNA i RNApol. Aquest enzim veurà les regions -10 i -35 (promotors) per poder iniciar la transcripció.
El nucli de la RNA-pol no es pot unir per si sol al DNA, sinó que s’unirà σ. Quan l’holoenzim esta complet, la RNA-pol reconeix les unitats -35 (encarregada subunitat σ), de manera que la subunitat α s’ancorarà a la regió -10.
RNA-pol obert: quan es trenquen els ponts d’H de la regió -10 (és ric en A-T). Estant obert, s’incorporen els primers nucleòtids per la polimerització del DNA (s’incorporen fins a 3: el primer A o G).
Escissió subunitat σ: la σ tapa el canal de sortida del mRNA, de manera que si no surt només tindrem 3 nucleòtids, ja que no podria avançar la RNA-pol. Per tant s’escindirà per poder elongar la cadena de RNA (responsabilitat del core – nucli sense σ).
Aquests tres nucleòtids s’han de posar avanç de que marxi la sigma perquè aquesta subunitat mantindrà fixada en el DNA la RNA-pol. Quan els primers nucleòtids ja s’han ancorat, la pol ja es més estable i pot estar sense la sigma.
Estudis invitro diu que la RNA-pol pot estar dies unit al DNA (produint RNA). La estabilitat de la RNA-pol, sinó hi ha res que ho impedeixen, és molt alta. Si la RNA-pol s’escindeix del DNA, no pot tornar-se a unir per si sola, necessitarà la sigma. Si no pares, acabaria sent perjudicial per la cèl·lula.
5.3. MECANISMES DE FINALITZACIÓ La finalització de la aturada de la RNA-pol es produeix a partir del terminadors.
S’aminorarà la velocitat del RNA polimerasa (bucle), de manera que les cadenes obertes que encara no s’han polimeritzat ja es comencen a tancar (no es pot tornar a obrir). I el moment en el que es tanca el DNA, la RNA-pol salta.
 Bucle: estructures secundaries (loop a regions terminadores) responsables de que es produeixi l’aturada del RNA-pol.
9 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo Proteïna Rho: Pertany a la família d’helicases (desfà interacció RNA–DNA). És hexamèrica amb un domini d’unió al RNA i un altre d’hidròlisis d’ATP. Aquesta avança pel RNA i arriba a seu lloc d’interacció, on reconeix una seqüència específica que esta a tocar de la RNA-pol.
5.3.1. Mecanismes Rho-dependent La proteïna Rho quan arriba al seu lloc d’interacció (toca a la RNA-pol), frenarà la velocitat de la RNA-pol (provocant que salti). Apart de la interacció amb Rho, tenim un harpin (loop) que es genera en el RNA –es forma a l’interior gairebé de RNApol: no és molt estable– i la sortida d’aquest desestabilitza la velocitat de la RNA-pol (seqüència determinada per el terminador transcripcional, codificat en el DNA però que no sorgeix fins que es forma el RNA).
 La seqüència RUT incrementa la unió de Rho al RNA.
Aquesta, encara que amb menys eficiència, també es pot donar sense la presència de RUT Efecte polar sobre la transcripció: si tenim un RNA recobert de ribosomes, si Rho s’ancora en aquest, haurà d’esperar i anar al pas i velocitat que vaguin els ribosomes. Però si hi ha un tros de RNA sense ribosomes, l’avanç de Rho és molt més ràpid. Si hi ha algun error, on el ribosomes es desenganxaran (per seqüència STOP), Rho arribarà prematurament on la RNApol i per si sola (sense necessitat de loop) acabarà amb el transcripció, resultant un transcrit molt petit i inacabat.
No tota mutació sense sentit tindrà efecte polar sobre la transcripció, ja que depèn del lloc on es produeixi l’STOP (es recobrirà més RNA o menys).
*Genotípicament són salvatge alguns gens, però fenotípicament no (es transcriurà el gen).
5.3.2. Mecanismes Rho-independent En el transcrit es formarà un bucle que alenteix la RNA-pol i s’aturà la transcripció. Aquests loops són molt estables (regions riques en G-C) i són seguits de regions molt riques en U – fan menys estable aquesta regió que segueix el loop.
Només generaran ponts d’H en l’heterodimer RNA i DNA: afavoreix que es separin el RNA i DNA perquè hi ha molts pocs ponts d’H (té més afinitat DNA-DNA que no la interacció que hi havia entre RNA-DNA).
10 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo 6. PROCESSAMENT DEL RNA 6.1. SINTÈSI rRNA i tRNA En procariotes el RNA també es processa i es poden trobar introns funcional. Els dos RNA processen el seus transcrits perquè siguin funcionals.
El gens que codifiquen per rRNA (rrn) esta agrupats en unitats policistròniques i estan sempre repetides. En aquesta imatge es localitzen on podem trobar les unitats transcripcional del rRNA.
Hi ha tres unitats transcripcional (16, 23, 5-S) i aquests “estan codificats per diferents gen”. En aquestes unitats transcripcional també hi ha inclosos tRNA. Podran haver-hi un o dos depèn de les copies del rRNA que estiguem mirant.
De un promotor únic es transcriurà un transcrit primari (surt directament del promotor un cop transcrita la unitat transcripcional). Les endonucleases que tallen la unitat transcripcional per separar cada una de les regions de la unitat. La separació no es neta. Hi hauran exonucleases que trauran els extrems d’aquests fragments.
11 Grau de Genètica – BMP T-2 Gloria Hidalgo El tRNA que es troben en el rRNA no són tots el que conformen la cèl·lula, ja que podem trobar unitats transcripcional que només codifiquen per diferent tRNA (i no rRNA).
 Passarà de la mateixa manera, existeixen varien copies i el processat es igual: el transcrit primari es separat per endoribonucleases i exoribonucleasa ajusta el tRNA. El canvi es que tots el tRNA el seu final són sempre iguals (mateixa seqüència: regió que reconeix l’enzim que enganxarà el ribonucleotid i enganxarà l’aa).
En els gens que codifiquen per el tRNA, en el DNA no sempre esta aquesta seqüència comuna.
Això passa perquè existeix un enzim (tRNA nucleotidil transerases) que aquells tRNA que no porten la seqüència de sèrie, els hi penja.
6.2. CONTROL OPERÓ rrnB Una de les coses que controla l’expressió gènica és la quantitat de ribosomes propis de la cèl·lula. El control d’aquests promotors es dóna, entre altres, per la presència dels NAPs (proteïnes que s’ancoren al DNA i canvien la torsió). Aquestes proteïnes tenen lloc d’ancoratge en el promotors per aquests tRNA o rRNA, i provoques un torsió al DNA que exposa més o menys els promotors.
agafa un torsió molt bona per poden reconèixer el promotor. L’ancoratge de l’H-NS amaga el promotor i la polimerasa no s’ancora tant bé (disminució de la transcripció).
Per tant, controlant l’expressió de les proteïnes FIS i H-NS es controla l’expressió indirectament dels gen DNA ribosomals.
En un medi ric, la cèl·lula produeix molt FIS, i en un medi pobre gairebé res  en medi ric quan es necessiten molts cromosomes, la FIS permetrà l’increment de rRNA.
 Hi haurà altres factor que també regulen això, el ppGpp 12 UAS: regió d’unió de les proteïnes FIS i H-NS Ex: la FIS quan esta ancorada el DNA ...