Cáncer y ciclo celular (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 3º curso
Asignatura Cáncer
Año del apunte 2016
Páginas 32
Fecha de subida 03/05/2016
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3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV CÁNCER TEMA Ciclo celular Introducción al ciclo celular El ciclo celular está compuesto por diferentes fases: - Fase G1 (growth or gap phase), es la fase inicial del ciclo.
- Fase S de síntesis de DNA. En esta fase se hace una copia de todos los cromosomas. Podemos ver orígenes de replicación en cada cromosoma.
- Fase G2. Es una segunda fase de crecimiento en la que parece que, a priori, no ocurre nada.
- Fase M o mitosis. Es la fase en la que se produce la división mitótica, tras la cual los cromosomas (previamente duplicados) se segregan a las células hijas. Posteriormente viene el proceso de citoquinesis, que es la separación física de las células hijas. A menudo se considera la citoquinesis como última fase del ciclo.
Como a partir de una única célula se generan dos células hijas, durante el ciclo celular debe haber síntesis (duplicación) de todos los componentes celulares, no solo del DNA. Es decir, durante el ciclo debe haber mucho crecimiento. A lo largo de todo el ciclo se van sintetizando nuevos componentes y compuestos (el RNA y los orgánulos se sintetizan a lo largo de todo el ciclo).
Mientras que el RNA y la mayoría de los orgánulos se van sintetizando durante todo el ciclo celular, podemos encontrar componentes que se duplican en una fase específica: los cromosomas y el centrosoma. El centrosoma es el aparato organizador de microtúbulos que ayuda a repartir los cromosomas de forma equitativa entre las células hijas. Estos componentes se duplican en una fase concreta ya que, para que se produzca un reparto correcto del material genético, ambos deben duplicarse una sola vez.
Variaciones en el ciclo celular El ciclo celular no está siempre organizado de esta manera.
La investigación alrededor del ciclo celular se realiza con organismos modelo que no suelen ser células humanas y ni siquiera células de mamífero. Por ejemplo, se usa mucho el anfibio Xenopus laevis¸ células de insecto y células de levaduras. Por tanto, en la literatura científica no siempre se encuentra el ciclo celular típico ya que no todas las células de estos organismos se dividen de la misma forma. En el siguiente esquema podemos ver algunos ejemplos de divisiones y ciclos alternativos para ver cómo los ciclos no siempre son iguales aunque no hace falta saberlos (la duración de las fases está representada más o menos a escala).
1 CÁNCER Curso 2015/2016 Por ejemplo, podemos ver que el embrión de Xenopus, como se trata de un oocito, tiene un proceso de división celular más rápido que el de las células humanas, pero la complejidad de ambos ciclos es similar.
En estos embriones no existen las fases de crecimiento, por lo que la célula inicial (ovocito fecundado) va dando células cada vez más pequeñas. A partir de una sola célula grande, se generan muchas células pequeñas que darán lugar rápidamente a un embrión.
En el embrión del erizo de mar (sea urchin embryo) se descubrieron las ciclinas. Vemos que no tiene fase G1 pero sí fase G2. Además, la fase de síntesis de DNA coincide en el tiempo con la citoquinesis: tras la mitosis la célula entra en fase S y se divide en dos (las células hijas se separan).
Después entra en fase G2 tras la cual vendrá la mitosis de nuevo.
La levadura de fisión (fission yeast), es como un cilindro que se va alargando y, cuando es lo suficientemente largo (crece en longitud), se divide por la mitad. La fase G1 es prácticamente inexistente y la fase S coincide con la citoquinesis. La fase G2 es muy larga ya que la célula no entra en mitosis hasta alcanzar una longitud apropiada.
La levadura de gemación (budding yeast), tampoco tiene el mismo ciclo que las células humanas ya que no tiene fase G2.
El más extremo es el caso del embrión de lo mosca Drosophila melanogaster, que solamente hace fase S y mitosis. Al final de la mitosis no se produce la citoquinesis por lo que las células no se separan y se genera una célula polinucleada. Como todos los núcleos están en una misma célula, sufren la misma regulación del ciclo y las mitosis ocurren todas a la vez. Al final del proceso de mitosis, los núcleos migran hacia la membrana externa y cada núcleo generará una membrana citoplasmática propia, dando lugar a células independientes.
2 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Organismos modelo para el análisis del ciclo celular Todos estos organismos han sido muy estudiados en investigación como organismos modelo. Las levaduras, por ejemplo, son un bien organismo modelo porque es muy fácil hacer ingeniería genética con ellas y generar mutantes. Son muy potentes como ayuda genética porque pueden tener ciclos haploides (con una sola dotación cromosómica), lo que permite crear mutantes más fácilmente (basta con inducir la mutación en un solo cromosoma). Además, con las levaduras es más sencillo hacer mutagenizar al azar: se genera una colección de mutantes al azar y se hace un screening para ver qué se ha obtenido.
Las levaduras también pueden formar organismos diploides aunque la salida de estas es la formación de gametos, que no hacen ciclo celular.
En las levaduras se ha identificado el gen más importante en la regulación, la CDK (kinasa dependiente de ciclina). Además, este modelo también ha servido para identificar muchos genes CDC que se encargan del control del ciclo celular como CDC24, necesario en la levadura de gemación para formar la gema. Estos conocimientos obtenidos gracias a las levaduras han servido para las células eucariotas ya que se trata de genes altamente conservados. Por ejemplo, CDC24 tiene, en nuestras células, funciones esenciales como la polimerización del esqueleto de actina y migración celular, además de funciones en el ciclo celular.
CDC7 es necesario para que comience la replicación del DNA y está conservado en humanos, donde tiene la misma función.
También se han encontrado CDC implicados en la segregación de cromosomas, en la citoquinesis,… Para identificar estos genes se cogían las levaduras y se generaban mutantes al azar. Los investigadores buscaban colonias termosensibles, es decir, mutantes que crecían a una temperatura (25o) y a otra (37o), no. Esto quería decir que la mutación había caído en un gen esencial que, si quedaba inactivado por la temperatura, paraba la división celular (no se sabe bien por qué el gen mutado pierde la función a una determinada temperatura). Observaban todos los mutantes termosensibles al microscopio para ver en qué fase concreta del ciclo celular paraban. Si por ejemplo tenemos células redondas, el ciclo se habrá parado en G1; si tenemos células que son como una gema, el ciclo celular ha parado al principio; si tienen 3 CÁNCER Curso 2015/2016 una gema muy grande pero un solo núcleo, no se habrá producido una correcta mitosis; habrá otras células que se quedan paradas en citoquinesis, … En todos estos mutantes, los genes afectaos son genes encargados de la progresión del ciclo celular.
Estos genes recibieron el nombre de CDC (Cell Cycle Control).
Xenopus laevis también es un organismo modelo muy utilizado. Se cogen los ovocitos recién fecundados, muy útiles para estudios del ciclo celular ya que pueden machacarse para preparar un extracto celular que continúa manteniendo, a nivel bioquímico, el patrón de ciclo celular como si de una célula viva se tratara. Por tanto, este modelo resulta muy útil para estudios bioquímicos, de depleción de proteínas (puede estudiarse cómo funciona el ciclo celular en ausencia de una proteína concreta generando un anticuerpo específico contra esta),… Además, estos embriones tienen un gran tamaño, que permite manipularlos mejor.
En estudios con estos ovocitos se identificó el factor promotor de mitosis o Mitosis Promoting Factor, el complejo formado por CDK y la ciclina mitótica.
Análisis del ciclo celular en mamíferos El interés del estudio del ciclo celular es entender cómo se dividen nuestras células, ya que sabemos que hay patologías como el cáncer, en las que la proliferación celular y, por tanto, el ciclo celular, se encuentran desregulados. Muchas veces se comprueba si lo que se ha demostrado que ocurre en los modelos, ocurre en humanos. Para ello pueden usarse cultivos primarios a partir de células extraídas del animal o líneas celulares.
Los cultivos primarios no pueden mantenerse de forma indefinida ya que, a partir de una cierta generación las células entran en senescencia (se han hecho “viejas”). Si se mantienen en la placa encontraremos células que vuelven a empezar a dividirse. Estas células se han transformado y podrán dividirse de forma indefinida – se han convertido en líneas celulares.
4 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Control del ciclo celular Complejos CDK/ciclina en la regulación del ciclo celular Para que se produzca la transición de una fase a otra del ciclo, la célula necesita una maquinaria que regula este proceso. El control del ciclo celular recae en las CDKs o kinasas dependientes de ciclina, que son activadas por unas subunidades reguladoras llamadas ciclinas.
Las oscilaciones de la actividad de las de las CDKs llevan a cambios cíclicos en la fosforilación de diferentes componentes de la maquinaria del ciclo celular, que llevan al inicio de las distintas fases del ciclo.
Las levaduras tienen una sola CDK mientras que en los humanos podemos encontrar cuatro diferentes: CDK1, CDK2, CDK4 y CDK6. Cada kinasa actúa en un momento del ciclo y se asocia a una o varias ciclinas determinadas: - La CDK1 se asocia con la ciclina B - La CDK2 se asocia con la ciclina A y con la ciclina E - La CDK4 y la CDK6 se asocian con la ciclina D Las CDKs son kinasas formadas por dos glóbulos muy marcados, unidos por una parte central donde se localiza el centro activo o catalítico de la enzima. Este centro catalítico suele estar tapado e inactivo y, para activarse, necesita asociarse a una ciclina. La ciclina provoca un cambio conformacional que desbloquea la entrada al centro activo, permitiendo que entren los sustratos para fosforilar.
Actividad CDK asociada a ciclinas Las ciclinas pasan por un ciclo de formación y destrucción que depende de la fase del ciclo celular en la que está la célula. Es decir, sus niveles son oscilatorios. Las oscilaciones de expresión y destrucción regulan las transiciones entre las fases del ciclo. Según el paso de fase que promueven encontramos diferentes ciclinas, como las ciclinas que promueven el paso de inicio (punto de no retorno).
5 CÁNCER Curso 2015/2016 El punto de inicio es a partir del cual la célula entra en el ciclo celular de forma irreversible. Una vez ha pasado este punto, el ciclo debe terminar. Este paso depende de la ciclina E (ciclina G1/S). Otras ciclinas son: - Ciclinas G1: regulan la actividad de las CDK 4 y 6. Ciclina D - Ciclinas G1/S: regulan la actividad de la CDK 2. Ciclina E - Ciclinas S: regulan la actividad de la CDK2. Ciclina A - Ciclinas G2/M: regulan la actividad de la CDK1. Ciclina B La única ciclina que no presenta un comportamiento oscilatorio es la ciclina D, cuyos niveles se mantienen constantes durante el ciclo y que se asocia a la actividad de las CDKs 4 y 6. En las células quiescentes (en fase G0) no se expresa la ciclina D1 y este es el estado de la mayor parte de las células de nuestro organismo.
Cuando la célula pasa de estado quiescente a la fase G1, aumenta la expresión de la ciclina D1, que promueve la transcripción de las ciclinas que participan en la siguiente fase . Como la ciclina D1 promueve la entrada a la fase G1 del ciclo, también recibe el nombre de ciclina G1. Cuando acaba el ciclo, los niveles de ciclina D1 vuelven a disminuir.
Tras la ciclina D, se promoverá la expresión de la ciclina E, que activará a la CDK2, promoviendo la entrada a fase S.
La ciclina E promueve la expresión de la siguiente ciclina, la ciclina A, que también activa a la CDK2 y promueve la fase S en la que se duplica el material genético. Finalmente, la última ciclina en expresarse es la ciclina B que, junto con la CDK1 promueve la transición de G2 a M. Por tanto, promoverán todo lo necesario para que se produzca la mitosis.
Además de los cambios en la expresión de las ciclinas, podemos encontrar otro mecanismo que controla que el ciclo celular se produzca de manera correcta. Este mecanismo son los puntos de control o checkpoints, que paran el ciclo hasta que la célula está preparada para entrar a la fase siguiente. Es decir, el ciclo celular depende de: - CDKs asociadas a ciclinas que promueven el paso de una fase del ciclo a otra.
- Checkpoints: comprueban que toda la maquinaria es correcta. Podemos encontrarlos antes de varias fases: 6 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV START: se trata del punto de no retorno, es decir, una célula ha pasado este checkpoint debe terminar el ciclo celular hasta el final. La célula que presenta las condiciones adecuadas para entrar al ciclo (nutrientes, temperatura, …) pasará este punto de control y comenzará la fase S. Si las condiciones de la célula no son las adecuadas, no comenzará el ciclo celular.
Mitosis. Se produce otro checkpoint previo a la mitosis. Si el DNA se encuentra dañado, la célula no podrá entrar en mitosis aunque se haya expresado la ciclina B.
Anafase. El último checkpoint se produce antes de entrar en anafase. Si los cromosomas no están bien alineados y correctamente enganchados al huso mitótico, la mitosis se parará y la célula no entrará en anafase, que es la fase de separación o reparto de los cromosomas.
Los puntos de control son sistemas de transducción de señal encargados de vigilar que las condiciones en las que se encuentra la célula son las adecuadas para pasar a la siguiente fase del ciclo celular. El punto de control se encontrará activo cuando haya algún problema y las condiciones no sean las indicadas para que la célula avanece mientras que, para que la célula pueda progresar en el ciclo los puntos de control deben estar inactivos.
- El checkpoint START inhibe a las ciclinas G1 y S.
- El checkpoint G2/M inhibe a las ciclinas mitóticas - El checkpoint de la anafase inhibe el complejo proteico de degradación de proteínas que mantiene las cromátidas hermanas enganchadas (que se va a explicar más adelante).
Bases estructurales de la activación de las CDKs Monómero de CDK Para entender las activación de las CDKs vamos a ver los mecanismos de la CDK2, (y la ciclina A) que pueden extrapolarse al resto de CDKs y ciclinas.
El centro activo de la CDK2 se localiza, como ya hemos visto anteriormente, en la hendidura entre los dos lóbulos de la kinasa. Es en la parte más profunda de este surco en el lugar al que se une el ATP, quedando sus fosfatos orientados hacia el exterior. En ausencia de ciclina (kinasa inactiva) los fosfatos del ATP están mal localizados, por lo que no se pueden fosforilar los sustratos.
Además, la entrada al centro activo se encuentra bloqueada por un T-loop (de color verde en el esquema de la imagen anterior) formado por una treonina que está muy conservada. Otro dominio altamente conservado es una hélice α llamada PSTAIRE que tiene una función importante en la interacción con la ciclina.
7 CÁNCER Curso 2015/2016 Interacción con la ciclina La ciclina A se une a la CDK2 provocando un cambio conformacional del centro activo: - La hélice PSTAIRE se mueve hacia el interior y uno de sus residuos, el E51, reestructura los fosfatos del ATP, que quedan bien orientados para poder fosforilar a los sustratos.
- La hélice del T-loop cambia su estructura pasando a ser una lámina β y dejando libre el centro activo.
La fosforilación de la treonina 160 del T-loop hace que la estructura del loop se aplane y aumenten las interacciones con la ciclina A. Esta treonina resulta clave para la activación de la kinasa.
Esta última fosforilación permite que el T-loop interacciones con la proteína sustrato, que contiene una secuencia diana S-P-X-K, que es una secuencia consenso en la que la X puede ser un residuo cualquiera.
La serina (S) del sustrato se posiciona para ser atacada nucleofílicamente por el fosfato del ATP.
Además, la lisina (K) de esta secuencia, con carga positiva, interacciona con la treonina 160 fosforilada, que tiene carga negativa. Si la treonina no estuviera fosforilada no tendría carga negativa y no interaccionaría con la lisina. Esto es lo que hace a la treonina 160 necesaria para la activación de la lisina.
Regulación de la actividad CDK-ciclina Como las kinasas dependientes de ciclina regulan un proceso tan importante como es la transición entre las fases del ciclo celular, su actividad debe estar muy bien regulada pare asegurar que el ciclo celular se produzca correctamente. Por tanto, se producen varios mecanismos de forma simultánea: - Inactivación por fosforilación: el complejo CDK-ciclina activo puede inactivarse si se fosforilan uno o dos residuos del centro activo de la kinasa. Estos residuos son la tirosina 15 y la treonina 14 y la kinasa que los fosforila es Wee1 o Myt1. Podemos ver este proceso en el esquema, en el que en amarillo se representa la fosforilacion de la treonina 160 y en negro la inactivadora. La fosfatasa que desfosforila estos residuos es la Cdc25, que activa el complejo CDK-ciclina.
8 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV - Regulación por subunidades inhibitorias. Se expresan elevados niveles de estas subunidades inhibitorias durante la fase G1 para asegurar la inhibición de la actividad CDK-ciclina de la fase M (CDKciclina B) y de la fase S (CDK2-ciclinaA). Encontramos dos familias de subunidades inhibitorias: Familia Cip/Kip (p27). Interaccionan con la CDK y con la ciclina impidiendo la entrada de los sustratos e inhibiéndolas. Estos inhibidores resultan muy importantes para evitar la entrada en fase S y, en relación con los tumores, son vitales para evitar el cáncer, por lo que podrán considerarse supresores tumorales.
Familia INK4. Estos inhibidores únicamente tienen especificidad por CDK 4 y CDK 6 por lo que inactivan la función de las ciclinas de G1 (ciclina D). La unión con la CDK se produce cuando está en forma de monómero (en ausencia de ciclina).
De esta manera, impiden que la ciclinas se unan a la CDK.
Para el ciclo celular de la célula progrese es necesario inhibir estos inhibidores. Cuando estos inhibidores son fosforilados por parte de las CDKs, son destruidos y dejan de inhibir la actividad ciclina-CDK.
Por ejemplo, los inhibidores Cip/Kit se eliminan como resultado de la fosforilación por múltiples kinasas, incluyendo las CDK de la fase G1/S. De esta manera, la acumulación de las CDK de fase G1/S en fases tardías conduce a la destrucción de los inhibidores.
Activación de las CDKs de tipo interruptor La activación de las CDKs es de tipo interruptor –switch– ya que pasan de no tener ninguna actividad a ser muy activas. Es decir, no existe una situación intermedia ni la actividad va aumentando de manera gradual. Por tanto, tenemos una situación de apagado (OFF) y una situación de encendido o actividad (ON).
A medida que las células van progresando en el ciclo celular, la ciclina se va acumulando y, por tanto, aumenta la activación de la CDK correspondiente. Esto es un mecanismo de activación gradual como el que se muestra en el primer esquema de la imagen superior, y no se produce en las células.
Lo que ocurre en realidad es el mecanismo de activación de tipo interruptor que acabamos de explicar.
La ciclina se acumula pero no activa a la CDK hasta que no supera una determinada concentración o cantidad. Esto lo podemos comprobar en el segundo esquema de la imagen, en el que viene representada la situación que ocurre con la ciclina B y la CDK1 (mitótica) previa a la entrada en fase M.
La ciclina B se va sintetizando y formando complejos con la CDK1 que no son activos ya que la kinasa Wee1 ha fosforilado los residuos Tyr15/Thr14 del centro activo de la CDK (lo que la inhibe). Para que los 9 CÁNCER Curso 2015/2016 complejos se activen debe haber un factor externo – trigger- que active a la fosfatasa Cdc25 que desfosforila los residuos y activa al complejo ciclina-CDK.
Este comportamiento en interruptor es posible gracias a un mecanismo de retroalimentación positiva en el que, una vez haya un complejo ciclina-CDK activo comienza la activación de todos los demás.
Esto se debe a que los complejos activos pueden activar a su propio activador, la fosfatasa Cdc25, e inhibir a su propio inhibidor, Wee1, para que se dé un efecto exponencial y sinérgico.
Este feedback positivo es el responsable de que los niveles de actividad ciclina-CDK aumenten de forma súbita, lo que es muy importante para que las transiciones entre fases sean rápidas.
Degradación de proteínas en el control del ciclo celular A lo largo del ciclo celular encontramos procesos reversibles y procesos irreversibles. Por ejemplo, la condensación de los cromosomas y la disolución de la envuelta nuclear son reversibles y están regulados por un mecanismo de fosforilación, que es totalmente reversible.
Por otro lado, tenemos la segregación de cromosomas, que es un complejo irreversible ya que, una vez se han repartido los cromosomas no nos interesa que se vuelvan a juntar.
Este proceso está controlado por un mecanismo irreversible como es la degradación de proteínas que depende del estado de ubiquitinización de la proteína.
De esta manera, tenemos por un lado procesos reversibles que dependen de la fosforilación de proteínas y, por otro, encontramos procesos irreversibles que dependen de la destrucción o degradación de proteínas (que también depende de una modificación post-traduccional, la ubiquitinización).
Para regular los procesos irreversibles tenemos dos complejos de poliubiquitinización (E3-ubiquitin ligasas) muy importantes en el ciclo celular: - SCF, que media la degradación de los inhibidores de las ciclinas G1/S y por tanto, se necesita para entrar en fase S (para entrar en el ciclo). El complejo siempre está activo pero solo reconocerá sus dianas (a los inhibidores de las ciclinas) cuando estas se encuentran fosforiladas. La caja F, una subunidad de SCF, se encarga de reconocer a las dianas fosforiladas.
- APC (Anaphase Promoting Complex). Este complejo promueve la anafase y por tanto, la salida del ciclo. A diferencia del SCF, APC solo está activo en determinadas fases del ciclo.
Para activarse requiere de la presencia de una subunidad activadora, que puede ser Cdc20 o Cdh1 y la interacción de modula por fosforilación. Cuando unos residuos de APC concretos se encuentran fosforilados, será Cdc20 la que se una y no Cdh1.
Por el contrario, si estos residuos están desfosforilados, Cdc20 no puede unirse pero sí Cdh1.
Cdc20 activa APC permitiendo la entrada en anafase. Para que pueda unirse a APC es necesaria la actividad de las CDK mitóticas.
Cdh1 es responsable de estabilizar a la célula en fase G1 impidiendo que entre en un nuevo ciclo. Para que se pueda unir a APC, deben destruirse las CDK mitóticas por parte de Cdc20.
10 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Por tanto, primero habrá APC-Cdc20 que promoverá la transición de metafase a anafase. Después, actuará Cdh1 como subunidad activadora de APC para que la célula se mantenga en G1 y pueda crecer. De esta manera, los ciclos serán más largos.
En un full KO para Cdh1 (-/-), las células tendrán ciclos celulares muy cortos, por lo que estarán continuamente en fase de replicación y tendrán una mayor predisposición a padecer alteraciones y generar tumores.
Durante la mitosis se producen los siguientes acontecimientos en los que intervienen estas subunidades: Primero se activan las ciclinas mitóticas asociadas a las CDK. Las CDK comienzan a fosforilar sustratos que promueven la entrada en mitosis y preparan los cromosomas para que se puedan segregar : - Histonas cuya fosforilación promueve la compactación de los cromosomas - Proteínas que interaccionan con los microtúbulos para que se forme el huso mitótico.
- Proteínas de la envuelta nuclear como la lamina B cuya fosforilación provoca que se desacoplen y que se disuelva la envuelta, permitiendo que los cromosomas queden libres en el citoplasma.
Las CKDs comienzan a fosforilar el APC, determinando su unión a Cdc20. El complejo APC/Cdc20 tiene dos funciones: - Destruye la securina - Destruye las ciclinas mitóticas. Es decir, lleva a cabo un feedback negativo. La destrucción de las ciclinas mitóticas hace que se pierdan las fosforilaciones de APC, por lo que, en lugar de unirse Cdc20, se unirá Cdh1. El complejo APC/Cdh1 será el responsable de la salida de la mitosis y de la estabilización de la célula en fase G1 para que no entre en un nuevo ciclo.
Montaje y regulación de los ciclos oscilatorios del ciclo celular La retroalimentación negativa permite que los sistemas generan oscilaciones, pero para ello estos sistemas deben presentar las siguientes características: - Un retraso en la activación de la kinasa y la activación de su inhibidor - Un mecanismo en el sistema que genera bioestabilidad en la actividad de la kinasa En el esquema podemos ver el mecanismo de acción de una kinasa, que podría ser la CDK, por el cual éste se une a su ligando y se activa. La kinasa activada podrá provocar una rápida activación del resto de kinasas de la célula. Una vez activas, tras un pequeño periodo de tiempo o retraso, puede fosforilar y activar a un inhibidor que la inactive. Por tanto, la activación de la kinasa conduce a su inhibición después de este pequeño retraso.
También podemos encontrar una pequeña cantidad de fosfatasa (Ph) permitiendo la desfosforilación de la kinasa y de su inhibidor después del loop de reatroalimentación negativa.
Esto ocurre a nivel teórico.
11 CÁNCER Curso 2015/2016 Podemos estudiar qué ocurre en la práctica con estos ciclos oscilatorios.
Por ejemplo, tenemos una célula de embrión de rata. Vemos que se va acumulando la ciclina B hasta que llega un punto en el que una CDK1 (mitótica) se activa y, a través de un proceso de retroalimentación negativa, se van activando todas las demás. La actividad de la CDK1-ciclina B aumenta de golpe y como consecuencia y con un efecto retardado, se fosforila APC y se activa. Se forma el complejo APC/Cdc20 que destruye a las ciclinas mitóticas y, en consecuencia cae la actividad de las CDKs.
El de acumulación de las ciclinas mitóticas comienza de nuevo y se producen oscilaciones cíclicas sin fase G1. Esto implica que hay ciclos muy rápidos que consisten solamente de las fases S y M (hay que recordar que se trata de una cinética estudiada en un embrión).
En una célula normal, la principal diferencia es que, además de contar con Cdc20 también contamos con Cdh1. La ciclina mitótica se va acumulando hasta que, gracias al feedback positivo se acaba activando la CDK. Con cierto retardo se activa el complejo APC/Cdc20 encargado de destruir las ciclinas mitóticas y, por tanto de inactivar a las CDKs. Al caer la actividad CDK, APC se desfosforila y forma el complejo con Cdh1. Este complejo estabiliza a la célula en fase G1, permitiendo que, en ausencia de actividad CDK, la célula crezca durante esta fase.
Se han realizado modelos KO para Cdh1 en los que se ha visto que su ausencia hace que las células entren al ciclo celular antes de tiempo. Esta situación se produce cuando se da un proceso tumoral, por lo que la pérdida de Cdh1 tiene una incidencia muy elevada en tumores. Por tanto, Cdh1 se considera un supresor tumoral.
Mecanismos básicos de síntesis de DNA El DNA se sintetiza en una reacción catalizada por DNA polimerasas que comienza en los orígenes de replicación. En estas regiones, primero se produce la síntesis de un cebador o primer gracias a la enzima primasa y después se establecen dos horquillas de replicación, que avanzarán en direcciones opuestas.
Por tanto, tenemos una replicación bidireccional que además es semiconservativa.
La mayoría de las DNA polimerasas no son capaces de iniciar la doble cadena de DNA, por lo que es necesaria la síntesis del cebador, catalizada por la primasa, que es una DNA polimerasa especial. También interviene una helicasa que se encarga de abrir la doble hélice a medida que avanza la horquilla de replicación. Otras enzimas implicadas son las RPA (Proteína de unión de DNA sencillo) y la PCNA que da mucha procesividad a la DNA polimerasa.
Las DNA polimerasas solo pueden añadir nucleótidos en una dirección: 5’  3’, por lo que una cadena (leading strand) se sintetizará de manera continua, mientras que la otra (lagging strand) se va polimerizando en pequeños fragmentos, llamados fragmentos de Okazaki. Cuando la polimerasa llega al final del fragmento previo, helicasas y nucleasas especializadas degradan el cebador previo. La polimerasa continúa polimerizando hasta el fragmento de DNA previamente sintetizado. Finalmente, una ligasa unirá todos los fragmentos.
Podemos ver una representación del proceso en el siguiente esquema.
12 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En las células eucariotas, los cromosomas tienen más de un origen de replicación que no se activan todos a la vez. Algunos orígenes de replicación se activan al comienzo de la fase S, otros a mitad e incluso los hay que se disparan cuando la replicación está a punto de terminar.
Es necesario que haya más de un origen de replicación porque los cromosomas son lineales. Si hubiera un solo origen de replicación no habría replicación en caso de que algo saliera mal. En cambio, al haber varios, un error en uno de ellos puede ser compensado por los otros, ya que las diferentes horquillas de replicación se acaban encontrando.
Análisis por microarray para examinar la dinámica de los orígenes de replicación En la imagen vemos más de un experimento que permiten determinar cuál es la dinámica de los orígenes de replicación.
En el primero de ellos, se ponen las células en un medio con N15 de manera que las células incorporen este isótopo a su DNA en la replicación. Una vez se han obtenido las primeras generaciones, las células se sincronizan en fase G1. Se cogen estas células y se les cambia el medio por un medio con N14. Se deja que las células salgan de la fase G1 y continúen con la replicación. Las células van incorporando a su material genético el isótopo ligero por lo que van apareciendo una banda de N14 aparte de la de N15. Al cabo de un 13 CÁNCER Curso 2015/2016 rato, encontramos una sola banda intermedia que se debe a la replicación semiconservativa que ha desencadenado que todo el DNA sea N14-N15. De esta manera se ha demostrado que la replicación es semiconservativa.
Podemos llevar a cabo un microarray que nos permita determinar la dinámica del origen de replicación.
En el microarray (en el soporte) se enganchan todas las secuencias del genoma (en fragmentos) y, a medida que el DNA se va sintetizando, hibridará con la secuencia correspondiente y dará señal. De esta manera, las regiones que se repliquen primero son las que antes darán señal. Los orígenes de replicación son aquellos puntos en los que comienza a replicarse una secuencia, que en la imagen están rodeados en rojo.
La posición de estos orígenes en el genoma ya se conoce por lo que este array permite conocer cuáles se activan antes y cuáles después ya que, como se ha comentado anteriormente, no todos comienzan al mismo tiempo.
En los gráficos podemos ver que los picos, que se corresponden a diferentes orígenes de replicación, se van disparando a diferentes tiempos. Por ejemplo, el primer origen de replicación se dispara a los 15 minutos de experimento. Los "valles” de la gráfica son aquellos puntos en los que se encuentran dos horquillas de replicación.
En la siguiente gráfica vemos un experimento llevado a cabo en el organismo Drosophila melanogaster para la cual se ha estudiado el tiempo de replicación de su genoma. En la gráfica está representado el tiempo en función de la localización de la secuencia y los picos que podemos observar se corresponden a zonas que, dentro de la fase S, se replican muy pronto. Por tanto los picos representan los orígenes de replicación (un pico siempre será un origen del que parten dos horquillas, que se corresponden a las dos pendientes). Como ocurría en el caso anterior, vemos que no todos los orígenes se disparan a la vez. Los lugares en los que convergen dos horquillas se ven como “valles” en la gráfica.
En este experimento se ha querido estudiar de qué depende de los orígenes se activen antes o después, por lo que se han correlacionado los datos de tiempo de replicación con los de condensación de la cromatina y con la inmunoprecipitación de la RNA polimerasa II. En aquellas zonas en las que se encuentra la RNA polimerasa son regiones con genes muy activos (zonas de alta transcripción). Muchos orígenes de replicación coinciden con las zonas ricas en RNA polimerasa mientras que las regiones que más tarde se replican en la fase S tienen menor densidad de polimerasa.
La cantidad de polimerasa permite clasificar la cromatina en dos regiones: eucromatina, que está descondensada y es la que se replica muy pronto, y heterocromatina, que se encuentra muy empaquetada y es la que se replica más tarde.
14 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Orígenes de replicación Estas regiones vienen determinadas por el complejo Orc, que se encarga de su reconocimiento para lo que utiliza la energía del ATP. Las proteínas del complejo cargan otros componentes a través de reacciones de hidrólisis del ATP. Estas proteínas son Cdc6 y Cdt1 que a su vez cargan la helicasa replicativa: el complejo MCM.
El complejo MCM es un hexámero que se engancha a una de las dos cadenas de DNA y va abriendo la doble hélice. Aunque estos complejos MCM se encuentran cargados sobre la cromatina desde la fase G1, no son funcionales.
Cuando las células deben entrar en fase S, es necesario que los complejos MCM se activen. Tenemos el complejo pre-replicativo cargado sobre el DNA y, tras la activación de las ciclinas de fase S y de la consiguiente activación de las CDKs, terminan de cargarse el resto de proteínas necesarias para activar este origen de replicación. Para activar el complejo pre-replicativo, también hace falta reclutar la kinasa Cdc7, necesaria para que las células puedan ciclar.
Las kinasas que se encuentran en el complejo están activas y fosforilan a los sustratos convirtiendo el origen de replicación en activo y eliminan Cdt1 y Cdc6, los componentes necesarios para montar un origen de replicación con todos sus componentes, para evitar que se formen nuevos orígenes de replicación.
Lo único que falta para que el origen de replicación esté completamente activo es que la helicasa (MCM) se cierre alrededor de la cadena de DNA (hay que recordar que se coloca solamente sobre una cadena, que es por la que se deslizará) y que se active.
15 CÁNCER Curso 2015/2016 Por tanto, para que se active el complejo pre-replicativo es necesaria la actividad de dos kinasas: la CDK de fase S y a la kinasa Cdc7, que además de activar el origen de replicación, impiden que se forme uno nuevo eliminando Cdt1 y Cdc6. Para activar el origen de replicación, fosforilan al complejo MCM y promueve el resto de actividades enzimáticas necesarias para la replicación se recluten en el origen.
Hoy en día se conocen cuáles son exactamente las proteínas que debe fosforilar cada kinasa: Cdc7 fosforila MCM (la helicasa de replicación), activándola, y la CDK fosforila a otras dos proteínas. Las proteínas fosforiladas por CDK son Sld2 y Sld3 (cuyos nombres no hay que saber) que, una vez fosforiladas pueden ser reconocidas por una proteína con dos dominios de reconocimiento de proteínas fosforiladas.
Esta proteína (cuyo nombre tampoco hay que saber) hace de puente entre las otras dos (Sid2 y Sid3), que se dirigen al origen de replicación. De esta manera, se forma un complejo con estas dos proteínas y la proteína puente que lleva a la DNA polimerasa al origen de replicación.
Este mecanismo de activación es un descubrimiento relativamente reciente que se hizo trabajando con células paradas en fase G1 y una proteína quimera que fusionaba las Sld y la proteína puente. En este caso, con las Slds ya estaban formando un complejo, no era necesaria la actividad de la CDK para la iniciar la replicación.
16 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Como ya se ha comentado, Cdk tiene otra función, que es inhibir o destruir los componentes que permiten la formación de nuevos orígenes de replicación. En cada organismo este proceso se hace de una manera diferente, pero siempre se produce una regulación a distintos niveles para asegurarse que no se duplique el origen.
En la imagen podemos ver que hay muchos mecanismos redundantes que tienen el mismo objetivo. La presencia de mecanismos redundantes a distintos niveles hace pensar que se trata de un proceso muy regulado.
El único momento en el que es posible montar los orígenes de replicación es durante la fase G1, ya que los mecanismos de montaje se inactivan una vez se ha entrado en fase S.
Por tanto, la duración de la fase G1 es muy importante ya que es en la que se replica el material genético. Si la fase se acorta la célula no habrá tenido tiempo para montar orígenes de replicación suficientes como para que se replique todo el DNA.
En ratones KO para Cdh1, la fase G1 es demasiado corta por lo que no se establecen suficientes orígenes de replicación. Esto implica que pueden quedar regiones sin replicar, lo que aumenta la probabilidad de que el DNA se rompa durante la mitosis, de que se produzcan eventos de recombinación, … que acaban generando inestabilidad genómica. La inestabilidad genómica es la causa más probable de que estos ratones desarrollen tantos tumores.
MITOSIS Eventos de la mitosis 1. Profase Se trata de la primera fase en la que se comienzan a observar los cambios: - Condensación de los cromosomas duplicados - Separación de los dos centrosomas (que también se han duplicado durante la fase S) que se localizan en los polos.
- Comienza a establecerse el huso mitótico. Los microtúbulos buscarán entrar en contacto con los centrómeros.
2. Prometafase Durante esta fase el cambio más evidente es la rotura y disolución de la envuelta nuclear, que permite a los microtúbulos interaccionar con los centrómeros de los cromosomas (que ya no están aislados por la envuelta). Los cromosomas quedan biorientados. La mayor parte de los cromosomas queda unido solamente a un centrosoma o a ninguno.
17 CÁNCER Curso 2015/2016 3. Metafase Esta fase dura realmente muy poco tiempo y se considera más bien una fase teórica. Los cromosomas están ya conectados a los microtúbulos, alineados por los centrómeros y biorientados. Este estado es como una competición de dos fuerzas: la que ejercen los microtúbulos hacia los polos de la célula intentando separar las cromátidas hermanas y la fuerza de cohesión entre las cromátidas que impide esta separación.
En este momento es preciso aclarar dos conceptos: Cromátidas hermanas: son cada una de las dos copias de un cromosoma resultado de la replicación que se produce durante la fase S. Como cada cromátida es una copia del mismo cromosoma, son idénticas entre ellas. Se mantienen enganchadas entre sí por la cohesión, un complejo proteico con proteínas como la cohesina, que resulta esencial para que las cromátidas no se separen de forma prematura (y para que se produzca un reparto correcto de la información entre las células hijas).
Cromátidas homólogas: son las cromátidas de los cromosomas homólogos. No son idénticas ya que una es de origen materno y la otra es de origen paterno.
4. Anafase Se pierde la cohesión entre las cromátidas hermanas, que muy rápidamente sucumben a la fuerza ejercida por los microtúbulos y se separan (una hacia cada polo).
5. Telofase Todos los procesos que han ocurrido durante las fases anteriores se revierten: se comienza a desacoplar el huso mitótico, los cromosomas se descondensan y a su alrededor se reforma una nueva envuelta nuclear.
6. Citoquinesis Se forma un anillo contráctil de actomiosina que hace fuerza para estrangular la zona intermedia entre lo que serán las futuras células hijas. Es necesario formar mucha membrana citoplasmática nueva por lo que se necesita un elevado transporte de vesículas que lleven la membrana a los puntos donde sea necesaria.
Mecanismos de control de la mitosis Control por fosforilaciones La entrada en mitosis depende de las ciclinas mitóticas asociadas a CDKs (M-CDK). La activación de las ciclinas depende de un feedback positivo en el que las propias ciclinas se activan a sí mismas dando lugar a un mecanismo de tipo interruptor como el que hemos visto anteriormente. Es decir, se produce una activación en la cual pasamos de un estado inactivo a una actividad máxima de las ciclinas.
Las ciclinas mitóticas se unen y activan a las CDKs correspondientes.
Las M-CDK fosforilan muchos sustratos implicados en la condensación de los cromosomas, la disolución de la envuelta nuclear y en la formación del huso mitótico, determinando la entrada en profase (primera fase de la mitosis).
Otra función de las CDKs mitóticas es la fosforilación de APC, que desencadena su activación. Como ya se ha explicado, la fosforilación de APC implica una activación asociada a Cdc20 y, por tanto, la promoción de la transición metafase-anafase.
18 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El complejo APC/Cdc20 tiene muchas dianas, entre las cuales se encuentra la securina que es un seguro que impide a las células entrar en anafase. La securina es ubiquitinizada por el complejo y degradada por el proteasoma, produciéndose la transición.
Además, la activación de Cdc20 conduce a la destrucción de las ciclinas mitóticas, lo que conlleva que la célula salga de un ciclo y entre en el siguiente.
Control por degradación/destrucción de proteínas Como hemos visto antes, dentro de los mecanismos de control podemos encontrar procesos reversibles e irreversibles. Los mecanismos de destrucción de proteínas entran dentro de los mecanismos irreversibles.
La degradación de la securina (promovida por el complejo APC/Cdc20) forma parte de estos mecanismos.
Checkpoints Los checkpoints consituyen un mecanismo de control que impiden a la célula pasar de una fase a la siguiente hasta que presente las condiciones adecuadas para esta transición.
En mitosis podemos encontrar dos checkpoints importantes. En primer lugar, tenemos el checkpoint que regula la transición de G2 a fase S y, más adelante, se da otro checkpoint que controla la entrada en anafase.
- Checkpoint G2/M: en este punto de control se detecta si el DNA se encuentra en buen estado o no. Si el material genético está dañado, el checkpoint permanecerá activo y no se producirá la entrada a mitosis. Este punto de control bloquea la actividad de los complejos ciclina-CDK mitóticos, por lo que las células permanecerán paradas en G2 para dar tiempo a los mecanismos de reparación del DNA para reparar el daño. Una forma de inactivar la actividad ciclina-CDK es mediante fosforilación a través de las kinasa Wee1.
- Checkpoint de transición metafase-anafase: este punto de control responde a defectos del huso mitótico. Es decir, revisa si el huso mitótico se ha formado correctamente y si todos los cromosomas están conectados de forma biorientada a los microtúbulos. Mientras este punto de control se encuentre activo, las células no podrán entrar en anafase ya que su función es inhibir al complejo APCCdc20. Mientras el complejo se encuentre inhibido, no se podrá degradar la securina y las cromátidas hermanas no se separarán.
Preparación de las células para la mitosis En la preparación de las células para la mitosis es esencial que se produzca la cohesión y que las cromátidas hermanas se encuentren bien enganchadas para que los cromosomas se puedan biorientar.
Es decir, la cohesión es necesaria para que los cromosomas puedan engancharse a los microtúbulos.
Podemos encontrar varios sistemas para mantener unidos los cromosomas: 19 CÁNCER Curso 2015/2016 Catenaciones Hace años (1998) se pensaba que la mayor parte de esta cohesión dependía de las catenaciones. Las catenaciones son estructuras en las que un DNA queda enrollado sobre otro. En los cromosomas circulares, las moléculas de DNA siempre quedan enganchadas tras la replicación. Los cromosomas lineales también quedan ligados mediante estas uniones topológicas que deben ser rotas por la topoisomerasa II para que los cromosomas unidos se puedan separar.
El superenrollamiento se produce cuando dos horquillas de replicación van avanzando la una contra la otra y es relajado por las topoisomerasas. Lo que ocurre es que cuando la horquilla llega al final de la cadena, no hay suficiente espacio para que las topoisomerasas actúen y la solución para que el DNA adopte una conformación más relajada y estable es que una de las horquillas rote sobre la otra. De esta manera se forman las catenaciones entre los productos de la replicación (cromátidas hermanas) que opondrán resistencia a la fuerza que ejerce el huso mitótico para separar las cromátidas.
Cohesinas (uniones proteicas) A finales de los años 90 se describió el complejo proteico que realmente mediaba la mayor parte de cohesión entre las cromátidas hermanas, que recibió el nombre de cohesina. El complejo está formado por cuatro subunidades: Smc 1, Scm 3, Scc 1 y Scc 3. Las proteínas de tipo Smc son como dos brazos muy largos cuyas cabezas o extremos tienen actividad ATPasa y que dimerizan por el dominio hinge. Lasunión de las cuatro proteínas da lugar a una estructura en anillo. Las subunidades Scc1 y Scc 3 son en realidad subunidades accesorias necesarias para terminar de cerrar el anillo.
El anillo de la cohesina es capaz de atrapar en su interior a las dos cromátidas hermanas ya replicadas. El mecanismo de cohesión es topológico: las dos cromátidas hermanas quedan atrapadas dentro de los anillos que son capaces de resistir a la fuerza ejercida por los microtúbulos.
El DNA entra en el anillo de cohesina a través del dominio de dimerización entre Smc1 y Smc3.
Además, existe otra “puerta” de salida que puede abrirse de repente permitiendo la salida del DNA de la cohesina, que favorece que se produzcan ciclos de carga y descarga del DNA. Una vez se han cargado las cromátidas hermanas en los anillos debe haber algo que los estabilice durante la fase S y que haga que queden bien cerrados. El mecanismo que permite que los anillos se cierren correctamente es la acetilación de la subunidad Smc 3 del complejo, que cierra la “puerta” de salida y, por tanto, los anillos de cohesina.
Este proceso en el cual, durante la fase S, se carga el DNA en los anillos y se cierran se llama Establishment of Sister-Chromatid Cohesion y podemos verlo representado en el siguiente esquema.
20 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En un experimento que fue realizado en el Irb, observaron que la cohesina también era modificada por SUMO durante la fase S. En caso de que no se produzca la acetilación de Smc3 no habrá cohesión porque los anillos no se cierran pero, en este caso, continúan estando SUMOilados. Cuando la modificación que no se puede dar es la SUMOilación, la cohesina se encuentra acetilada y, por tanto, los anillos están bien cerrados pero no hay cohesión entre las cromátidas hermanas ya que solo una de ellas queda atrapada en el interior del anillo. Por tanto, se cree que la SUMOilación es necesaria para que los anillos puedan atrapar ambas cromátidas hermanas y crear la cohesión .
Cada vez se conocen más las cohesinas por lo que se pueden identificar cada vez más mutaciones en ellas que se encuentran implicadas en cáncer. Los genes que codifican para las proteínas del complejo son importantes desde el punto de vista de la progresión tumoral ya que, si la cohesina no funciona bien, los cromosomas no segregan bien entre las células hijas y se promoverá la inestabilidad genética.
También se han descrito una serie de cohesinopatías, que son patologías que a veces se asocian al cáncer.
Por ejemplo, el síndrome de Roberts (RS), que es causado por mutaciones en la acetilasa y cuyos pacientes tienen mayor tendencia de lo normal a presentar tumores.
Otra cohesinopatía es el síndrome de Lange (CdLS), cuyos afectados tienen defectos del desarrollo: retraso mental, deformidades en las extremidades, .., debidas a problemas en el desarrollo embrionario.
La cohesina tiene también funciones muy importantes en la regulación transcripcional, ya que los anillos mantienen a los cromosomas en su conformación y mantienen a los enhancers y a los inhibidores transcripcionales cerca del promotor que corresponde. Esta estructura se sustenta gracias a la presencia de anillos de cohesina que, atrapan estas regiones en cada cromosoma y las mantienen próximas. Si hay mutaciones en el complejo, no será correcta la regulación génica y, por tanto, tampoco lo será la expresión, lo que se traduce en errores en el desarrollo.
21 CÁNCER Curso 2015/2016 En las bacterias también podemos encontrar complejos de tipo Smc (bacterial Smc), que es un homodímero, por lo que el complejo es simétrico. En las células eucariotas podemos encontrar tres complejos diferentes: cohesina, condensina (implicada en la condensación de los cromosomas) y el complejo Smc 5-6.
Se cree que la condensina actúa de manera similar a como lo hace la cohesina.
Mientras que la condensina actúa como un crosslinker intramolecular (que une dos moléculas de DNA), la condensina engancha dos regiones dentro de la misma molécula. A base de enganchar regiones próximas dentro del cromosoma, lo va compactando y acortando.
Durante la mitosis también es necesario que los microtúbulos se enganchen a los cinetocoros, que son las estructuras que se montan alrededor del centrómero.
Los cinetocoros más sencillos que podemos encontrar son los de las levaduras, cuyas secuencias son relativamente cortas y contienen unas secuencias específicas que determinan la región centromérica a la que se unen. El nucleosoma que forman las levaduras es algo diferente ya que las histonas no son las mismas que encontramos en nuestras células. Esto se debe a que incluyen una proteína histona-like, la Cse4, que sustituye a una de las histonas que aparecen en el nucleosoma humano. Alrededor de este nucleosoma es donde se reclutan todas las proteínas necesarias para que los microtúbulos se enganchen.
En las células eucariotas este mecanismo es algo diferente aunque también hay un centrómero capaz de reclutar la maquinaria necesaria para enganchar los microtúbulos. En el caso de los cinetocoros humanos no existe ninguna secuencia que determine la región centromérica pero, la principal diferencia es que los cinetocoros de los humanos se unen a todo un haz de microtúbulos.
22 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV El proceso de unión a los microtúbulos es completamente aleatorio ya que algunos cromosomas quedarán enganchados muy rápidamente a los microtúbulos mientras que otros tardarán más tiempo. Es decir, se produce un proceso aleatorio de búsqueda y captura de los cinetocoros.
La situación ideal es que cada cinetocoro se una a un polo de la célula para que los cromosomas queden biorientados. Puede ocurrir que los cinetocoros de las dos cromátidas hermanas queden conectados al mismo polo de la célula, es decir, los cromosomas pueden quedar mono-orientados. En caso de que los cinetocoros se unan correctamente y de que los cromosomas queden biorientados, tendremos dos fuerzas opuestas: la que ejercen los microtúbulos hacia los polos de la célula y la resistencia a esta fuerza que opone la cohesión. En esta situación se generará tensión que provoca que la cromatina se deforme a nivel de los cinetocoros. En cambio, si la unión que se ha producido no es correcta y los dos cinetocoros quedan enganchados a microtúbulos del mismo polo, no se producirá esta tensión.
La célula es capaz de detectar esta tensión gracias a la proteína Aurora kinasa, un sensor de tensión que se localiza justo en el punto en el que debe detectarla. Si no hay tensión, la Aurora kinasa se encuentra activa y se desactiva cuando capta esta tensión.
Cuando la Aurora kinasa está activa (cuando no hay tensión), fosforila proteínas del cinetocoro destruyendo la interacción con el microtúbulo para promover la reorientación de las conexiones.
Esto lo hace porque en ausencia de tensión nos encontramos ante una situación no deseable que debe revertirse para que los cromosomas se separen correctamente. Si la Aurora kinasa está inhibida los cromosomas no quedan bien biorientados y no segregan bien, lo que degenerará en una situación de inestabilidad cromosómica.
La Aurora kinasa actúa como sensor de la tensión para todos los cromosomas por lo que irá cortando las interacciones necesarias hasta conseguir que todos los cromosomas queden biorientados.
Checkpoint del huso mitótico Mientras la Aurora kinasa se encuentre activa es necesario que las células paren el ciclo celular y no entren en anafase, para lo que es necesario un Checkpoint o punto de control.
Este checkpoint tiene muchos componentes, siendo Mad2 uno de los que mejor están caracterizados.
Podemos encontrar Mad2 en conformación abierta (Opened) o en conformación cerrada (Closed) y lo que determina esta conformación es un cambio conformacional de la posición de unas hojas β que se incluyen en su estructura. Estas láminas β pueden quedar parcialmente abiertas o cerradas, actuando como un cinturón de seguridad que secuestra proteínas en su interior. Mad2 se abre y atrapa unas proteínas concretas, tras lo que se cierra atrapándolas dentro. Hoy en día se conocen dos de estas proteínas secuestradas por Mad2, que son Mad1 y Cdc20 (que es un activador de APC). Si Mad2 secuestra al activador de APC, este no podrá activarse y la célula no puede entrar en anafase.
23 CÁNCER Curso 2015/2016 El checkpoint funciona de la siguiente manera: Mientras haya al menos un cinetocoro que no está enganchado a los microtúbulos, la proteína Mad1 es reclutada rápidamente. Mad1 se engancha a una molécula de Mad2, formándose una estructura cerrada dentro de la cual Mad1 queda secuestrada. Mad2 puede interaccionar con sí misma: la conformación cerrada (con Mad1 dentro) interacciona con la conformación abierta creándose un intermediario parcialmente abierto que es capaz de atrapar a Cdc20 y secuestrarla en su interior.
Se produce una reacción en cadena en la que cada vez aparece más proteína Mad2 parcialmente abierta que secuestrará más Cdc20. Finalmente, se acaba secuestrando todo el Cdc20 que se encuentra en el interior de la célula (esto a partir de un solo un cinetocoro libre).
No se sabe muy bien cómo se revierte toda esta reacción para promover la entrada en anafase.
La separasa es una proteína que acaba cortando los anillos de cohesina (es una proteasa) que unen las cromátidas hermanas, permitiendo que se produzca su separación. Es decir, la separasa es la enzima encargada de disparar la anafase. Esta reacción no ocurre de forma inmediata ya que la separasa recién sintetizada está inactivada por la securina. Por tanto, si la separasa se encuentra inactiva los anillos de cohesina se mantendrán intactos impidiendo que la tensión ejercida por los microtúbulos separen las cromátidas hermanas.
Para activar la separasa y entrar en anafase debe degradarse la securina (que la mantiene inactiva). De esto se encarga el complejo formado por APC asociado a Cdc20, que destruye a la securina liberando a la separasa. La separasa libre queda activa y reconoce una secuencia muy concreta de la cohesina por donde la corta. Una vez se ha roto la cohesina, los cromosomas ceden a la tensión ejercida por los microtúbulos y se pueden separar.
24 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV A continuación vamos a hacer una síntesis de todo lo explicado haciendo uso del esquema de la imagen: En el esquema podemos ver los cromosomas, algunos de los cuales se encuentran mono-orientados, por lo que carecen de tensión. La ausencia de tensión mantiene activa a la Aurora kinasa que rompe las uniones entre los cinetocoros y los microtúbulos de los cromosomas mal orientados hasta que los cromosomas se orienten bien. En esta situación, las proteínas del checkpoint están activas y Cdc20 está secuestrado por Mad2. Como Cdc20 no está activo, APC no puede activarse ni degradar la securina.
No se sabe muy bien de qué manera pero, una vez están todos los microtúbulos bien enganchados a los cinetocoros, la Aurora kinasa se inactiva y Cdc20 queda libre. Cdc20 activa a APC que destruye a la securina, liberando a la separasa que romperá la cohesina.
Citocinesis La citocinesis se trata de la última parte del ciclo celular en la que se produce la separación física entre las células resultantes de la división. El momento y la manera en la que la separación depende del tipo celular. Se forma un anillo contráctil de actina y miosina en el punto a partir del cual se acabarán separando las células hijas. Además, también debe haber una gran síntesis de membrana citoplasmática para generar toda la membrana que necesitarán las células hijas.
En las levaduras por ejemplo, el punto en el que se separarán las células hijas está muy bien determinado desde la fase G1.
En las células animales, es la posición del huso mitótico en anafase la que determina dónde se formará el anillo de acto-miosina.
Desde la región central del huso mitótico se generan señales durante la anafase mediana que van hacia la envuelta celular y es en los puntos donde llegan estas señales donde comienza a formarse el anillo. Es decir, en las células animales estas señales determinan en qué punto se realiza la citocinesis.
En la levadura S. pombe, la posición donde se formarán el anillo también se determina gracias a la posición del huso mitótico.
25 CÁNCER Curso 2015/2016 En un momento dado, uno de los centrosomas se desplaza más hacia uno de los polos, es decir, el huso mitótico queda desplazado. Esto implica que la citocinesis no se producirá justo en el centro de la célula y una de las células hijas que se generarán será algo más pequeña que la otra. Esto ocurre durante el desarrollo embrionario, durante el cual es preciso generar dos células hijas que distintas no solo en el tamaño, que acabarán generando líneas celulares diferentes.
Deben existir mecanismos durante la citocinesis que impidan que los cromosomas queden por el medio ya que, las proteínas del citoesqueleto tienen mucha fuerza y si queda algo de DNA en el medio tendrán capacidad de romperlo. En este caso, una de las células hijas tendría ganancia de material genético y la otra, perdería material genético.
Por tanto, en esta situación debe hacer algún mecanismo que pare el ciclo celular y la citocinesis.
Regulación de la proliferación y del crecimiento celular En la imagen podemos ver un experimento en time lapse en el que se graban las células en video. Se va midiendo el momento en el que nacen (al final de la mitosis anterior) y cuánto tardan en completar una nueva mitosis. Es decir, se mide la duración del ciclo celular de estas células.
Cada célula está representada como un punto en azul. El ciclo de algunas células dura entre 15 y 16 horas mientras que hay otro grupo de células en las que dura alrededor de 20-25 horas. Esta diferencia entre ambos grupos se debe a que en el experimento se incluye otro factor: se elimina el sérum a las células durante una hora, por lo que durante este periodo de tiempo no tienen factores de crecimiento. Al cabo de este tiempo el sérum se vuelve a añadir.
El ciclo celular no incrementa solamente una hora, que es el tiempo en el que se les retira el medio a las células. Las células detectan que en el medio no hay factores mitóticos que las estimulen para dividirse, por lo que paran el ciclo celular durante más tiempo.
El sérum se ha retirado a todas las células pero no todas han parado el ciclo celular durante el mismo periodo de tiempo.
26 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La gráfica representa la duración del ciclo celular en función de la edad de las células y el sérum no se ha retirado a células de la misma edad. Las que más tiempo paran tras la retirada del medio son las células más jóvenes, mientras que las células con 3-4 horas de vida mantienen la duración del ciclo celular a pesar de este parón.
Este experimento está poniendo de manifiesto un punto de control: el punto de start. Una vez las células han pasado este punto de start, no pararán el ciclo celular aunque se les retire el sérum. Es decir, una vez han pasado este punto las células están obligadas a terminar el ciclo. El punto de start está dentro de la fase de G1 del ciclo, en concreto dentro de las 3-4 horas, por lo que las células que ya tienen este tiempo de “edad” cuando se retira el medio, no paran el ciclo celular.
De qué depende el paso a través de Start El paso a través del punto de Start depende sobre todo de la activación irreversible de las ciclinas de la fase G1/S. Este proceso lo desencadenan factores mitogénicos y factores de crecimiento que se encuentran en el sérum. Por tanto, si el medio se retira antes del paso por el start, no se desencadena la señalización que acaba conduciendo a la expresión de las ciclinas de fase G1 (ciclina D). La función principal de la ciclina D, como ya hemos visto a lo largo del tema, es promover la expresión de una segunda ola de ciclinas: las ciclinas de fase G1/S y las ciclinas de fase S.
Una vez se han activado las ciclinas de fase G1/S se considera que se ha pasado el punto de start.
Activación de G1-CDKs por parte de los mitógenos Los mitógenos y los factores de crecimiento hacen que aumenten los niveles de ciclina G1 en la célula, mediante la activación de vías de señalización. Hay dos vías de señalización importantes para que la célula pueda entrar en ciclo celular: la vía Ras-MAPK y la vía PI3K/AKT. Estas dos vías se activan por la presencia de factores extracelular que interaccionan con receptores de membrana con actividad tirosina kinasa (TRKs).
Por un lado tenemos Ras, una proteína G pequeña que se regula en función de si se encuentra unida a GTP o a GDP. Existen una serie de factores que bien ayudan a que se produzca el intercambio de GDP por GTP o bien estimulan la actividad hidrolítica de Ras, que transforma el GTP en GDP. Ras activa a la MAP kinasa, lo que desencadena en la activación de factores de transcripción: Myc y Fos (por ejemplo).
27 CÁNCER Curso 2015/2016 Se producen un par de ondas transcripcionales: En la primera onda transcripcional se activan genes entre los que hay muchos factores transcripcionales que promueven la respuesta de transcripción retardada o la segunda ola transcripcional.
Segunda ola transcripcional: lleva a la expresión de G1 y de las ciclinas de fase G1/S.
Es decir, la vía Ras/MAPK es necesaria para obtener las ciclinas.
Por otro lado, tenemos la vía PI3K/AKT cuyo mecanismo ya conocemos: la PI3K fosforila lípidos de membrana para atraer a la kinasa AKT, que se acaba activando tras sufrir dos fosforilaciones.
Las dos vías son necesarias para la entrada en el ciclo celular ya que, como acabamos de explicar, la vía Ras-MAPK conlleva la expresión de los genes que codifican para las ciclinas de fase G1. Estas ciclinas se acomplejan con las CDKs correspondientes y las activan.
Para que puedan formarse los complejos entre las ciclinas y las CDKs son necesarios los inhibidores de la familia CID-KIT (activadores de ciclinas G1 e inhibidores de ciclinas G1/S), como p27. Los inhibidores son necesarios para reforzar la interacción entre la ciclina D y la CDK (4/6) que se ha formado, que es débil. p27 hace de puente entre las ciclinas y las CDKs y favorece la interacción y el ensamblaje, promoviendo la formación de complejos activos.
El problema de estos complejos es que son rápidamente fosforilados por la kinasa GSK3β y esta fosforilación induce su destrucción. En este punto se hace necesaria la vía PI3K, ya que es la kinasa AKT la encargada de inhibir a la kinasa GSK3β.
Ahora que estos complejos ciclina-CDK no se destruyen son nucleares y activos, y permiten a la célula entrar en el ciclo.
En el siguiente esquema podemos ver cómo ambas vías de señalización (inducidas por mitógenos) llevan a la activación de los complejos ciclina – CDK: 28 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Activación de la expresión de genes en el Start A continuación vamos a descubrir cuál es la función del complejo ciclina G1-CDK (ciclina DCDK). Este complejo fosforila a las proteínas de la familia pRB (proteína del Retinoblastoma), que se asocian a los factores de transcripción de la familia E2F.
Podemos encontrar más de una pRB y también muchas E2F distintas, por lo que se puede dar una gran cantidad de combinaciones (muchas de las cuales ya están descritas).
Es importante que pueden darse tantas combinaciones ya que el resultado de algunas de ellas funciona como factor transcripcional activador (activa la transcripción) mientras otras combinaciones funcionan como inhibidores de la transcripción.
La mosca del vinagre (Drosophila melanogaster) solo tiene dos proteínas de cada: una combinación funcionará como activador transcripcional y la otra como inhibidor. Al haber menos combinaciones es más sencillo llevar a cabo experimentos. Vemos en la imagen un estudio con larvas de Drosophila, en el que se ha trabajado con las larvas Wild Type y con otras en las que se he eliminado la expresión de los dos tipos de E2F: E2F1 (activador) y E2F2 (represor). Al quitar el E2F represor (E2F), las larvas son algo más pequeñas aunque son bastante similares a las WT. El doble mutante, sin activador ni represor, tiene la misma medida que las larvas sin represor. En cambio, las larvas que no tienen el activador son mucho más pequeñas ya que hay algo que está reprimiendo la división de las células. Este experimento demuestra que no solo hace falta tener un activador para iniciar la división celular sino que también es necesaria la inhibición del represor.
En las células quiescentes (fuera del ciclo celular), los factores activadores están interaccionando con la proteína pRB, que los inhibe, por lo que no pueden engancharse a los promotores. Los factores represores también se encuentran unidos a pRB, pero están unidos a la cromatina, impidiendo la transcripción.
Cuando se activa la división, las CDKs acomplejadas con las ciclinas de fase G1 fosforilan a pRB haciendo que se rompan los complejos entre las pRB y las E2F. De esta manera, la E2F represora se liberará de la cromatina y no podrá inhibir la transcripción mientras que la E2F activadora podrá interaccionar con la cromatina y unirse a los promotores, promoviendo la transcripción de genes entre los que encontramos el de las ciclinas de G1/S.
29 CÁNCER Curso 2015/2016 El módulo pRB lo encontramos mutado muy frecuentemente en muchos tipos de tumor ya que se trata de un módulo central en la regulación de la entrada del ciclo celular.
La célula debe coordinar su tasa de división con su tasa de crecimiento, es decir, estos procesos deben encontrarse en equilibrio. Las células pueden presentar diversas formar para mantener estos procesos equilibrados: pueden coordinar el crecimiento con las divisiones siendo la tasa de división la que determinará la tasa de crecimiento o bien coordinar los procesos de la forma opuesta, siendo la tasa de crecimiento la que determina la tasa de división.
Este último mecanismos de regulación es muy utilizado por organizamos unicelulares. La célula crecerá más rápido cuantos más nutrientes tenga a su disposición en el medio, por lo que se dividirá más rápidamente.
También es frecuente que ambos procesos de regulen de forma independiente, pudiendo encontrar una vía (crecimiento o división) más activa que la otra, lo que ocasionará células más pequeñas o más grandes.
A veces (sobre todo en organismos pluricelulares más evolucionados) interesa que las células hijas tengan distinto tamaño por ejemplo en el desarrollo embrionario, en el que las células procedentes de la misma división pueden dar linajes celulares diferentes).
La tercera situación que podemos encontrar es que un mismo factor estimule una vía de señalización que promueva, al mismo tiempo, el crecimiento celular y la división.
Por ejemplo, el IGF, estimula a un receptor con actividad tirosina kinasa (RTK) que activa la vía PI3K/AKT.
Una de las funciones de AKT es inhibir a dos factores que funcionan como GAPs, es decir, que estimula la actividad GTPasa de dos proteínas G, estimulando la hidrólisis del GTP y con ello la inactivación de la proteína G. De esta manera, gracias a AKT se inactivan las proteínas GAP y la proteína G se mantiene activa.
Ésta actúa en la señalización de crecimiento celular mediante la activación de la vía TOR, ya que la kinasa TOR es el principal componte de la señalización del crecimiento. TOR tiene muchas funciones para estimular el crecimiento: - Estimula el importe de aminoácidos - Aumenta la expresión de enzimas metabólicas - Inhibe la degradación de proteínas - Estimula y activa una kinasa del ribosoma (proteína S6), haciendo que aumente la traducción - Fosforila proteínas implicadas en la síntesis de ribosomas promoviendo la expresión del rRNA - Promueve la activación del ribosoma mediante la inhibición de un inhibidor (4E-BP) que inhibe un factor de inicio de la traducción.
Es decir, TOR hace que incremente la tasa de producción de proteínas.
30 3º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La mayor parte de la masa de la célula, después del agua, son proteínas por lo que las células deben incrementar su producción si quieren crecer. De esta manera, habrá más masa dentro de la célula.
La maquinaria de síntesis proteica es una diana para la regulación del crecimiento celular.
En los siguientes experimentos se han hacho mosaicos en los que se ha eliminado, a una pequeña población de las células, la expresión de algún gen implicados en esta vía de señalización, como TOR. Las células KO para TOR son más pequeñas ya que no tiene la misma capacidad para crecer.
Si eliminamos la expresión de las proteínas GAP (que estimula la actividad GTPasa de la proteína G provocando su activación) permitimos que TOR se encuentra más activo. Por tanto, las células son más grandes ya que habrá mucha síntesis proteica y una mayor tasa de crecimiento.
Si creamos un doble mutante KO para TOR y GAP obtenemos células más pequeñas que las Wild Type ya que no tienen expresión de TOR (y TOR está downstream a GAP en esta vía).
Mutación en los genes de reparación y mantenimiento del DNA aumentan la tasa de mutación La tasa de mutación del DNA viene determinada por la tasa de error de la polimerasa y por la exposición a factores mutagénicos (que causan mutaciones).
La probabilidad de desarrollar un cáncer (Likelihood of cancer) depende de la tasa de mutación y del número de genes que tienen que estar mutados para desarrollar la patología.
La tasa de mutación de los genes es muy baja, ya que aproximadamente se producen 10-6 mutaciones por generación de células. Por otro lado, encontramos que, para que se desarrolle un cáncer es necesario que se muten muchos genes. Por tanto, teóricamente, es muy complicado que se llegue a desarrollar una neoplasia.
Lo que ocurre en realidad es que la tasa de mutación comienza a dispararse en algún momento de la vida del enfermo en el fenómeno que se conoce como inestabilidad genómica. En los cariotipos de un tumor podemos ver una gran cantidad de aberraciones cromosómicas que son un signo de la inestabilidad.
31 CÁNCER Curso 2015/2016 Por tanto, es necesario llegar a entender cómo se genera esta situación de inestabilidad y es aquí donde se centran desde hace años los esfuerzos de muchos investigadores.
Se conocen muchos factores que pueden contribuir a la inestabilidad genética, muchos de los cuales ya hemos visto a lo largo del tema. Por ejemplo, la securina PTTG puede provocar una entrada en anafase precoz si está mutada y con ello, una incorrecta segregación de los cromosomas que da lugar a fenómenos de aneuploidías (aberración cromosómica).
Por tanto, a pesar de que sean necesarias muchísimas mutaciones para que se desarrolle un cáncer, solo una o unas pocas pueden dar lugar a la situación de inestabilidad genómica que desencadenará en un aumento de la tasa de mutaciones.
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