DGM- Tema 9. Sistemes de genotipat (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 4
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 8
Subido por

Vista previa del texto

DGM- Tema 9 mfiguls 9/4/15 TEMA 9: Sistemes de genotipat Tenim més de 100 mètodes diferents, no n’hi ha una de millor que estigui per sobre els altres.
Característiques generals: - Alta capacitat genotipat (nº genotips/dia) Capacitat de multiplexing (genotipat múltiple) Baixa taxa d’error Sistema automàtic d’assignació dels al·lels Preus assequibles Protocols generals 1. Amplificació del fragment diana: per aconseguir un gran nombre de còpies.
a. Tenim molts mètodes i tècniques que ens ho permeten fer. No hi ha un mètode ideal, en tots s’obté el producte a analitzar per amplificació amb PCR.
2.
Discriminació dels dos al·lels: necessitem una tècnica que ens permeti discriminar els dos al·lels.
a. Normalment s’han dissenyat per SNPs, que són bial·lèlics b. Les tècniques que s’han desenvolupat són 4: i. ÚS DE TÈCNIQUES ENZIMÀTIQUES - Extensió especifica d’al·lels de l’encebador - Lligació d’oligonucleòtids (un d’ells específic d’al·lel) - Talls enzimàtics específics d’al·lel ii. US D’OLIGOS COM A SONDES - Hibridacions especifiques d’al·lel (ASOH) (Ex/ Taqman assay, microarray) 3. Els mètodes més usuals de detecció són a. Espectrometria de masses b. Fluorescència c. FRET d. Luminiscència Format de l’assaig • • • Sòlid: us d’un suport sòlid Homogeni: tots els reactius junts Semi-homogeni: els reactius s’afegeixen seqüencialment (diferents estratègies que es poden combinar, veure diapos tema 9a 8, 9) Estratègia de discriminació 1.1. EXTENSIÓ ESPECÍFICA D’AL·LEL DE L’ENCEBADOR (ASA): És la primera tècnica que es va utilitzar.
à! En funció de si l’extrem 3’ de l’encebador és complementari a la seqüencia que estudiem, hi haurà amplificació o no.
MINISEQUENCIACIÓ: La mes típica és la MINISEQUENCIACIÓ (seqüenciació de 1-3 nt) - Base: incorporació de desoxiribonucleòtids específics de l’extrem 3’ de l’encebador, per tant, quan s’uneixen es para la síntesi 1 DGM- Tema 9 mfiguls La base és dissenyar un encebador on per l’extrem 3’ queda adjacent a la mutació que volem detectar. La polimerasa hi incorporarà un nucleòtid en funció del DNA motlle, quan s’incorpori el desoxinucleòtid es pararà la síntesi.
El nucleòtid que s’incorpori dependrà del DNA motlle.
- La detecció del nucleòtid dependrà del mètode de discriminació o SnaPshot (Applied Biosystems?): utilitza la detecció fluorimètrica + electroforesi capil·lar . S’incorporen 4 desoxinucleòtids marcats amb diferents fluorocroms. Depenent del nucleòtid que s’afegeixi, es llegirà en una longitud d’ona o altra en l’electroforesi capil·lar.
§ Jugant amb la grandària i composició de bases, podem estudiar i detectar múltiples polimorfismes (cadascun estarà en una posició diferent).
§ En funció de la posició del pic sabrem en quina posició està el polimorfisme, i en funció de la longitud d’ona, quin nucleòtid hi ha.
o Mass EXTEND: utilitza només un desoxinucleòtid marcat, i els altres no. Es diferencien les masses dels productes obtinguts. En l’exemple, en l’al·lel 1, s’incorporarà desoxiadenina i es pararà la síntesi. Però en l’al·lel 2, s’incorporarà la guanina, i no es pararà la síntesi perquè el nucleòtid és normal. Llavors, s’introduirà un segon nucleòtid.
§ Per tant en cadascun dels al·lels amplificats, hi haurà un nombre diferent de nucleòtids (23 o 24), per tant, en l’espectrofotòmetre com que els fragments no tenen igual longitud, en l’espectrofotòmetre el pic estarà en posicions diferents (l’espectrofotòmetre pot discriminar diferències en un nucleòtid) La miniseqüenciació ens permet també analitzar METILACIONS EN LLOCS ESPECÍFCIS. Si tractem el DNA amb bisulfit, tindrem C o T segons si la citosina estava metilada o no. Amb la minisequenciació, podrem detectar també aquests canvis.
PIROSEQUENCIACIÓ: Basada també en l’extensió d’una polimerasa.
Aquesta tècnica ens permet seqüenciar fragments curts.
2 DGM- Tema 9 mfiguls En aquesta, partim de la seqüencia a analitzar amplificada per PCR. Utilitzarem encebadors de seqüenciació, dNTPs i alguns enzims i substrats: Enzims: - polimerasa de DNA - sulfurilasa d’ATP - luciferasa - APirasa Substrats: - APS (adenisoni 5’ fi...) - Luciferina L’encebador s’unirà a la seqüencia , la polimerasa unirà nucleòtids, per cada nucleòtid que afegeixi, es forma un pirofosfat. Amb aquesta molècula generada, gràcies a la adenosina pirofosfat passa a ATP i per tant, per cada nucleòtid que introdueix la polimerasa generem un pirofosfat que donarà un ATP. Les molècules d’ATP, a través de la luciferasa, serveixen per poder oxidar la luciferina a oxiluciferina, generant un fotó de llum. Per tant, es detecta l’emissió de llum.
Al final obtenim un pirograma, amb pics, l’alçada del pic ens indica quantitat de fotons (que correspon al nºATP=nºpirofosfats=nº nt que ha introduït).
La pirasa ens serveix per degradar tots els dNTPs que sobren.
En aquesta tècnica afegim els dNTPs seqüencialment: només posem un tipus de dNTP en cada reacció. Per tant, en cada cicle podem saber quants dNTPs d’aquell tipus s’han afegit.
1.2. LLIGACIÓ D’OLIGONUCLEÒTIDS: - Base: Dissenyar dos oligos adjacents, que es lligaran o no segons si hi ha aparellament perfecte o no.
Imaginem un polimorfismes C/T: dissenyem dos encebadors específics d’al·lel (un amb G i l’altre amb A), on l’extrem 3’ coincidirà amb el punt de la mutació, també un tercer oligo, que és comú i s’uneix en les seqüències dels dos al·lels. Si hi ha lligació, l’oligo quedarà més gran.
Per discriminar les dues formes al·lèliques, o be els encebadors per un i l’altre han de tenir diferent longitud o be un ha d’estar marcat.
Els oligos, en l’extrem tenen unes seqüències complementàries a uns encebadors que utilitzem posteriorment per amplificar. Utilitzem els encebadors específics i un tercer encebador.
Els oligos específics lligaran o no amb el tercer en funció de si l’individu és homozigot o no: 3 DGM- Tema 9 • • mfiguls Si els oligos han lligat, amplificaran i es generaran moltes copies.
Si no han lligat, no s’amplifica.
Per discriminar quin dels dos oligos és el que ha lligat i posteriorment amplificat, introduïm abans de l’encebador unes seqüències específiques pròpies de la casa comercial, les quals estan codificades.
Cadascun dels productes d’amplificació tindrà aquesta seqüencia interna.
Pot ser que a l’amplificació, a més, un dels dos encebadors estigui conjugat amb biotina. Per tant, el producte amplificat es pot fixar en uns micropouets que contenen estreptoavidina, podem seleccionar dels productes amplificats, la cadena que tenim a l’extrem la biotina.
Els micropouets s’utilitzen per l’amplificació d’uns altres oligos, els quals tenen als extrems de seqüències modificades i ens permeten diferenciar un al·lel o altre perquè tenen recorregut electroforètic diferent.
Al final fem una electroforesi capil·lar, si ens surt un pic es homozigot i si ens en surten dos, heterozigot. El recorregut dels oligos ens discriminarà si hi ha un al·lel o altre.
Podem fer un anàlisi múltiple, llavors, per cada parell d’oligos obtindrem un pic diferent en l’electroforesi capil·lar.
Tenim dues tècniques diferents, una que detecta el fluorocrom i una altra que detecta la grandària del producte.
4 ...