Tema 4. Tècniques bàsiques de laboratori (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 1º curso
Asignatura Estructura i funció de biomolècules
Año del apunte 2016
Páginas 7
Fecha de subida 17/03/2016
Descargas 2
Subido por

Vista previa del texto

Anna Jiménez Pouget Tema 4: Estructura i funció de biomolècules TEMA 4: TÈCNIQUES BÀSIQUES DE LABORATORI Determinació de la concentració de molècules Hi han aminoàcids com els aromàtics que concedeixen la propietat d’absorbir llum a les proteïnes. La manera més habitual de quantificar a les proteïnes és per la seva capacitat d’absorbir. Agafem una solució on tenim la proteïna i la dipositem dins d’una cubeta, aquesta la col·loco en un aparell que es diu espectrofotòmetre, aquest el que fa és incidir llum (d’uns nanòmetres determinats en funció de l’espectre que volem), en aquest cas la fixarà en 280 nm (correspon a l’ultravioleta). Incideixes aquesta llum sobre la nostre barreja de proteïnes.
Aquesta llum es divideix en diversos tipus de llum, una part pel plàstic de la cubeta queda reflectida (s’envà), una part que és la llum absorbida per la mostra, i la llum que travessa la mostra. La llum absorbida es gràcies als aminoàcids aromàtics. La llun incident = llum reflectida + llum absorbida + llum que travessa. L’espectrofotòmetre mesura la quantitat de llum que passa a través i mitjançant la llei de Lambert – Beer, que ens diu que l’absorbància (quantitat de llum absorbida d’una molècula que analitzo) és igual a la concentració (com de concentrada esta la molècula que estic analitzant) x longitud de la cubeta (més ample + més material hi cap + absorbància) x paràmetre específic de la proteïna que mesuro, perquè el que variarà d’una proteïna a una altre serà la quantitat d’aminoàcids aromàtics que té.
La llei de Lambert – Beer, el que diu és: quanta més absorbància més concentració. La relació de la concentració i l’absorbància és directament proporcional, fins a un cert límit.
Un mètode bàsic en el laboratori és fer servir la llum com a mètode per quantificar.
𝐴𝑏𝑠 = 𝐶 𝑥 𝑙 𝑥 𝜀 La llei de Lambert-Beer diu que com més absorbància tenim, més concentració tindrem, és a dir, que la relació de l’absorbància amb la concentració és directament proporcional.
Anna Jiménez Pouget Tema 4: Estructura i funció de biomolècules SEPARACIÓ I PURIFICACIÓ – CROMATOGRAFIA S’utilitza generalment per separar proteïnes. Els mètodes de separació són el que es diuen cromatografies. És un mètode de separació de proteïnes en funció dels principis fisicoquímics pels quals volem separar les proteïnes, farem un tipus de separació o un altre.
Tècniques de purificació i caracterització: Cromatografies - Cromatografies de bescanvi Iònic Tenim un tub amb un farciment, i aquest farciment quan la proteïna és de bescanvi iònic, el principi fisicoquímic que utilitzaré seran les interaccions electrostàtiques, tinc una matriu que té una càrrega, i si jo vull que un element interaccioni amb aquesta matriu positiva, necessitaré una càrrega negativa. Per tant de la barreja de les meves proteïnes m’interessaria saber la càrrega global, i per saber-la necessitem saber el pH que triem per fer la cromatografia, i quin punt isoelèctric (pH en què la càrrega neta de la proteïna és 0) té la proteïna que he de purificar. Si jo estic treballant a un pH superior al punt isoelèctric estic forcant l’equilibri a desprotonar coses, els carboxils es tornen amb càrrega negativa, i els amí perdien el protó, es quedaven sense la càrrega positiva. Per tant, quan treballo a un pH superior al punt isoelèctric, les proteïnes tindran càrrega negativa. Si treballo a un pH inferior al punt isoelèctric predominaran les càrregues positives. Si el pH és igual al punt isoelèctric no tindrà càrrega la proteïna.
Anna Jiménez Pouget Tema 4: Estructura i funció de biomolècules Dos tipus de bescanvis: qui dóna nom al bescanviador és lo que és capaç d’unir, no la càrrega de la proteïna.
 Aniònic: aquell que és capaç d’unir anions, per tant, la meva molècula (o la matriu) estarà carregada positivament. Per aconseguir que l’element que s’uneixi a la matriu positiva, treballarem a un pH superior al punt isoelèctric de tal manera que la càrrega de la proteïna serà negativa i es podrà unir a la matriu positiva.
 Catiònic: aquell que és capaç d’unir cations, per tant, la meva molècula (o matriu) tindrà càrrega negativa. Per aconseguir que l’element que s’uneixi a la matriu negativa, treballarem a un pH inferior al punt isoelèctric, així aconseguim que l’element o proteïna que volem separar assoleixi càrrega positiva i s’uneixi a la matriu.
Per tant, pel que fa als bescanvis cal saber el pH de treball, el punt isoelèctric de les molècules que participen i saber si el bescanvi és iònic o catiònic.
Per després recuperar la meva molècula (excepte si és una proteïna) per recuperar-la si esta unida, hauré de canviar el pH. Les proteïnes no pot ser perquè la proteïna podria sortir afectada, si és un enzim li destrossaríem l’estructura i ja no ens serviria. Llavors el que s’acostuma a fer, si la nostra proteïna esta reaccionant amb el bescanviador, el que fem és afegir molta sal, que són cations i anions, de manera que en el cas d’aquest bescanviador, els clorurs compatiran pel lloc d’unió, que desestabilitzaran la càrrega i la proteïna s’alliberarà. Si la proteïna tingués càrrega negativa llavors els que compatirien serien els ions sodi. (del clorur sòdic = sal) pH > punt isoelèctric  q – pH < punt isoelèctric  q + - pH = punt isoelèctric  q neutra 0 Aquesta tècnica serveix si les proteïnes que volem separar (o elements) tenen punts isoelèctric diferents.
Podem fer dues estratègies, que les proteïnes s’uneixin a la matriu o bé que s’uneixen les proteïnes contaminants i per repulsió obtenim la molècula que no s’uneixen.
Si agafem una molècula que s’uneix al bescanviador, després cal un procés per separar anomenat Elució, es pot fer canviant el pH o si tenim una proteïna és arriscat perquè desestructures la proteïna, i l’alternativa a jugar amb el pH per eluir és canviar la força iònica de sal (μ) de la solució: [sal] per exemple: [NaCl]. Els clorurs o els sodis entraran en competició pels llocs d’unió de la matriu, desestabilitzant la unió entre la proteïna i la matriu. Si la unió és molt forta caldrà més sal que si la unió és feble.
Anna Jiménez Pouget - Tema 4: Estructura i funció de biomolècules Cromatografies d’exclusió molecular (Cromatografia de Gel filtració) El principi fisicoquímic és la separació per mida molecular. Un paràmetre molt important de la gel filtració és el rang de fraccionament, que ens diu quines mides de molècules és capaç de separar, segons el seu pes. És el disseny de les mides que hi ha entre els canals de les esferes del gel, esta pensat perquè mides entre un cert límit siguin separats entre ells.
Com més petita és, per més quantitat de porus pot passar i el seu camí és més llarg fins a poder sortir. Les molècules més grans elueixen, surten primer. Les més petites són les que estan més enredereixen el camí i surten més tard.
Si una molècula esta per damunt del límit d’exclusió, si tenen un pes molecular superior al límit, no poden passar per cap dels porus, per tant només poden viatjar pels espais exterior de la resina. Però entre elles no se’m separaran. Les molècules sortiran juntes independentment que estiguin molt a prop del límit o molt lluny, no és capaç de discriminar i em sortiran les dues juntes alhora al principi de tot, abans que arribin les que si que estan dins del límit. Si dues molècules estan per sota del límit, seran les últimes en arribar perquè com són tant petites podran anar per tots els camins i tardaran molt en arribar a baix de tot, i sortiran juntes, però al final de tot.
Aquí no fa falta que jugui canviant el pH ni la concentració de sal, ja que el tampó només em manté en suspensió la proteïna, no té un rol d’establir o generar càrregues o interaccions, quan es dóna el cas, es diu que això és un gradient isocràtic, el pH del tampó és constant. Aquí només juga un paper les mides i pesos diferents de les molècules.
Si tenim proteïnes amb punts isoelèctrics semblants però pesos moleculars diferents, serà més adequat fer una cromatografia de gel filtració que no pas un bescanvi iònic.
A part de separar, la gel filtració serveix per fer una estimació de pesos moleculars, tenim una proteïna amb la que treballo però desconec el seu pes molecular. Utilitzarem la gel filtració afegint una barreja de proteïnes amb pesos moleculars coneguts, s’anomenen patrons de pes molecular. Els patrons de pes molecular han d’estar inclosos en el rang de fraccionament que jo he triat. Llavors aquests patrons els busco perquè al saber quant pesen i en quin moment surten jo puc fer una recta patró, mirant quan surten els estàndards, quants mil·lilitres han trigat a sortir i quan pesen, i faig el log 10(PM) (eix Y) i el número de ml en l’eix X. Vaig posant totes les molècules. Miro quants mil·lilitres han tardat en sortir la meva proteïna i desfaig el logaritme del pes molecular o bé substitueixo amb la calculadora en la formula y = a·x + b.
Si la meva proteïna és un monòmer obtindré el pes del monòmer, però si la meva molècula està composada per diverses molècules obtindré una estimació del pes molecular del conjunt.
com per exemple la hemoglobina, que està formada 1 tetràmer de 4 monòmers.
Anna Jiménez Pouget - Tema 4: Estructura i funció de biomolècules Cromatografies d’Afinitat La resina porta unit un grup pel qual la meva proteïna que vull aïllar té especificitat. Per exemple: tinc un enzim i compro una cromatografia que porti enganxat a la resina el substrat, l’enzim s’hi unirà i la resta no.
Després haurem de recuperar el nostre enzims, necessitem alguna cosa que desplaci els llocs d’unió de la meva molècula per tal de separar-la, i ho faré afegint un competidor, afegint compost. Si afegeixo molt substrat concentrat, el meu enzim tendirà a enganxar-se al nou substrat i alliberar-se de la matriu. O trobant un enzim anàleg que competeixi per la unió amb el que vols separar i el desplaci.
La interacció NO ÉS PER CÀRREGA, per molt que canviï el pH aquí no s’alliberaria l’enzim. Necessitaríem un competidor.
- Caracterització del pes molecular: electroforesi SDS Ens hem d’imaginar una matriu, una xarxa semblant a la gelatina, és com un polímer, on apliquem les mostres i després un potencial, una càrrega. De manera que depenent del potencial (càrregues) que tinguin aquestes molècules, aniran cap al pol positiu o negatiu. Si estan carregades positivament, aniran cap al pol negatiu, i viceversa. Les fem servir per separar tant DNA i proteïnes. Per separar proteïnes utilitzem poliacrilamida, com més poliacrilamida poso, més petits són els forats d’aquesta xarxa. Hi ha gels de dos tipus:  Natius: la molècula es mourà en funció de la seva càrrega en aquell punt isoelèctric. Si unes proteïnes tenen diferents punts isoelèctrics, es mouran cap a llocs oposats, i en funció de com sigui d’intensa la seva càrrega es mouran més o menys. Les proteïnes es mouran en un sentit o un altre depenent de la càrrega que tinguin en aquell pH de treball, dependran de la relació punt isoelèctric – pH de treball, però “el quant” es moguin dependrà de com d’intensa és aquesta càrrega, com més intensa sigui més migrarà. Per exemple si tinc una molècula amb un punt Isoelèctric > pH de treball, tindrà càrrega positiva, per tant es desplaçarà cap al pol negatiu.
Anna Jiménez Pouget  Tema 4: Estructura i funció de biomolècules Desnaturalitzants (amb SDS): electroforesi amb SDS. Es posa un detergent que és SDS en el gel de poliacrilamida. La funció del SDS és doble: per una banda despleguen les proteïnes (perd l’estructura terciària, es desnaturalitzen) i a més em genera com una bombolla de càrregues negatives al voltant de la proteïna, en un gel de SDS la càrrega que té la proteïna queda neutralitzada, totes les proteïnes tenen càrrega negativa. El que condicionarà que es moguin més o menys serà la mida, a les petites els resulta més fàcil moure’s que a les grans, per tant en un gel de SDS, les proteïnes més petites seran les que avançaran més. Si tinc 3 proteïnes molt grosses posarem un entramat amb porus grans, i si tinc unes proteïnes molt petites, posarem un entramat amb més poliacrilamida, per fer la xarxa amb porus més petits. (polyacril amide gel electroforesi – SDS = PAGE – SDS).
Tant les electroforesi com les cromatografies són mètodes per separar.
- Cromatografia: molta quantitat de mostra Electroforesi: poca quantitat de mostra (difícilment podràs treballar amb allò que has separat).
Aplicació d’una Electroforesi: Estimació de pesos moleculars. Si poso uns patrons de pes molecular, sabent que la banda més petita ha de correspondre a la proteïna que pesa menys, i poso en l’eix Y el logaritme del pes molecular i l’X la distància (cm), i fent y= ax+b puc saber substituint la x, que és la distància recorreguda, i sabré el pes molecular d’una proteïna desconeguda.
Què passa si al fer una estimació amb gel filtració i una altre amb l’electroforesi amb SDS em dóna la gel filtració més gran que l’altre? Doncs no és que ho haguem fet malament, sinó que vol dir que la meva proteïna es un tetràmer (en l’exemple, pot estar composta de més subunitats) i com que les condicions són les natural amb la gel filtració, obtinc el pes molecular de la proteïna de manera sencera, en canvi, l’electroforesi es fa canviant les condicions naturals, és un mètode agressiu, no manté l’estructura, es trenquen les proteïnes, i obtenim el pes molecular dels monòmers. Per exemple: GF = 40.000 i EF = 10.000. Veiem que amb la gel filtració el pes molecular és 4 vegades més gran que amb l’electroforesi, per això diem que és un tetràmer.
També en l’electroforesi ens podria sortir més d’una ratlla, i podria ser que la nostra proteïna estigués formada per diferents monòmers amb diferents pesos moleculars, o bé que tenim la proteïna contaminada.
(La gel filtració també serveix per estimar els pesos moleculars.) Anna Jiménez Pouget - Tema 4: Estructura i funció de biomolècules Caracterització de pes molecular i punt isoelèctric: ELECTROFORESI 2D Són dues electroforesis en un mateix suport, ho utilitzem quan volem separar una barreja proteica amb moltes proteïnes diferents per tal de poder comparar-les. Si tenim 1.000 proteïnes, d’una que pesa 12.000 a una que pesa 12010 no veurem diferències. Primer apliquem la mostra i la sotmetem a un gel on la separació és en un punt isoelèctric, en condicions natives, les proteïnes migraran cap a un pol o cap a un altre en funció de la seva càrrega i el punt isoelèctric. I en segon lloc, les aplicarem a un gel per SDS, i així les separarem també per mida, i és més difícil que dues proteïnes comparteixin punt isoelèctric i mida. Quan fem un gel 2D, ja no obtenim bandes, sinó punts, i mirem si hi ha una variació important per exemple del proteoma d’aquell individu en dues situacions que podem estar comparant, per exemple quan està tranquil i quan esta excitat.
...