Tema 8 - Ús d'oligosondes en la PCR (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 11
Fecha de subida 15/04/2016
Descargas 20
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tema 8 – Ús d’oligosondes en la PCR Tant en la rtPCR com en la dPCR podem emprar oligosondes conjugades amb fluorocroms per tal d’eliminar les inespecificitats que redueixen la precisió de l’anàlisi. Serveixen per analitzar un producte específic i no tenir problemes d’inespecificitat. Usarem uns oligos d’encebadors i uns de sondes.
Aquestes sondes són específiques de l’amplicó; hi ha una alta especificitat de detecció del producte amplificat. Si hi ha amplificació de seqüències estranyes, en no tenir complementarietat amb l’oligosonda, no observarem fluorescència.
Es redueix el grau d’inespecificitats però alhora l’eficàcia a l’hora d’amplificar el producte específic serà menor. Usarem sondes basades en l’efecte FRET per diferenciar si la sonda ha hibridat específicament amb l’amplicó o si la sonda està lliure.
Aquest mètode encareix la reacció de PCR però fa que sigui més fiable.
EFECTE FRET FRET – Fürster or Fluorescence Resonance Energy Transfer (transferència d’energia de ressonància fluorescent). Aquest efecte es basa en l’ús d’oligosondes amb fluorocroms que emeten fluorescència en determinades situacions; detecció per fluorescència depenent de l’efecte FRET. Es combinen en les reaccions de rtPCR i tècniques d’espectrometria.
Aquest efecte és la interacció entre estats electrònics excitats de dues molècules depenent de la distància. L’estat d’excitació es transfereix d’un donant a un acceptor sense emissió de fotó.
Si tu tens un fluorocrom amb un espectre d’emissió determinat i un fotó assoleix aquest llindar, l’excitarà electrònicament i el fluorocrom alliberarà energia en forma de fotó fluorescent. Aquest alliberament es dóna en un espectre d’emissió diferent del d’absorció.
FRET es basa en utilitzar dos fluorocroms els espectre d’emissió i absorció dels quals se solapin. D’aquesta manera, quan els dos fluorocroms es trobin junts, el primer absorbirà l’energia de ressonància, la transmetrà al segon, el qual s’excitarà i emetrà la fluorescència. El primer NO emet fotó; transmet l’energia.
191 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Els dos fluorocroms són de colors diferents. D’aquesta manera, en funció del color que observem, sabrem si està emetent fluorescència el primer (no l’ha transmès, per tant no es troben a prop) o el segon (estan a prop i per tant hi ha hagut transmissió d’energia).
Enlloc de fluorocroms també podem fer servir Quenchers, que són inhibidors de la fluorescència (“apagador”). És una molècula que s’excita però que no emet fluorescència, l’allibera en forma de calor o de llum visible. El que fan és, si es troben junts fluorocrom i Quencher, evitar que s’emeti fluorescència. Si estan lluny, si que s’emetrà fluorescència, per tant podrem saber si dos grups químics estan propers o distants en funció de si el resultat de la reacció és fluorescència o calor. Així doncs, podem analitzar fluorescència, llum visible, calor...
Perquè hi hagi transferència d’energia, els fluorocroms han d’estar relativament a prop (10 – 100 A), i com hem dit els espectres d’emissió i absorció de donador i receptor han d’estar solapats. A banda, la transferència també dependrà de les característiques de les dues molècules.
192 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 OLIGOSONDES EMPRADES EN LA PCR Sondes fluorogèniques De sondes de fluorescència n’hi ha moltes. Les primeres que van sortir són les sondes Taq Man®, que estan registrades i ja no es poden copiar. En el fons hi ha dos tipus: d’hidròlisi i d’hibridació. En el primer cas es basen en la digestió de la sonda, i en el segon cas es basen en la hibridació de la sonda.
Sondes d’hidròlisi Les més utilitzades són les sondes Taq Man®. La fluorescència detecta la hidròlisi/digestió de la sonda.
Quan fem l’anàlisi amb aquest tipus de sondes, a part dels dos encebadors que usem per amplificar la seqüència específica, també usem una sonda oligo amb un fluorocrom que hibridarà en una regió de la part interior de la seqüència que vols generar (en una de les dues cadenes).
Hem de tenir en compte dos aspectes importants: la Tm i el bloqueig de l’extrem 3’.
- - L’oligosonda ha de tenir una Tm més alta que la dels dos encebadors, de manera que després de desnaturalitzar, el primer que hibridi sigui la sonda. Així, quan hibridin els primers, la sonda ja estarà unida.
L’extrem 3’ de l’oligosonda ha d’estar bloquejat amb un quencher, de manera que es bloquegi l’extrem 3’ perquè la Taq no pugui usar-lo d’encebador, ja que sinó la Taq sintetitzaria a partir de la sonda.
Aquesta sonda té dues molècules: un fluorocrom i un quencher (R i Q ). Un cop hibriden els encebadors, la Taq va sintetitzant. Com té activitat polimerasa i exonucleasa 5’  3’, va sintetitzant, i quan es troba la sonda, si esta aparellada de manera estable, la digereix i envia el R a un lloc i el Q a un altre. Per tant, quan excitem el fluorocrom emetrà fluorescència perquè s’haurà separat del Q.
El quencher l’utilitzem perquè quan l’oligosonda s’hagi desprès del DNA, el quencher ja no li farà efecte i alliberarà fluorescència (la seva). La quantitat de fluorescència que s’alliberi serà proporcional a la quantitat d’encebadors units al motlle de DNA. Com més fluorescència, més DNA s’haurà sintetitzat. La fluorescència emesa és de la sonda; qualsevol hibridació inespecífica no interferirà perquè no hibridarà amb res més que amb la seqüència concreta. No hi ha interferència a nivell de fluorescència, tot és específic i concret del nostre amplicó.
193 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Ah per cert, la sonda es diu TaqMan pel PackMan.
Sondes d’hibridació Parlarem de les sondes balises. N’hi ha de molts altres tipus també.
Aquestes sondes presenten una estructura en pinça degut a la complementarietat dels extrems; tenen una seqüència en bucle la part central de la qual conté la seqüència que hibridarà específicament amb el DNA motlle que ens interessi (una seqüència interna de l’amplicó). La sonda Taqman hibrida a la part interior de l’amplicó; aquí el que hibrida és la part central de la rodona. Als extrems de la molècula hi ha el F (fluorocrom) i el bloquejador (Q). Al principi no hi ha emissió perquè Q l’està inhibint. Quan desnaturalitzes, aquesta sonda també es desnaturalitza, de manera que si troba la seqüència complementària hibridarà a la part central i els extrems on hi ha F i Q quedaran separats i s’emetrà fluorescència. No se separen quan la polimerasa els digereix, sinó quan hibriden. Per això les altres sondes són d’hidròlisi i aquestes són d’hibridació.
194 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Si utilitzem la sonda Taqman, ens assegurem que la polimerasa hagi passat i digerit les sondes. En canvi amb les sondes Beacon la mesura la fas al principi, abans que la polimerasa desplaci la sonda. Per tant, el punt de la mesura de la fluorescència depèn del tipus de sonda que s’utilitzi.
Recordem que el SYBR Green I NO és específic per complementarietat. També es fa servir al final de la fase d’extensió com la Taqman.
Hi ha sondes dobles que només funcionen amb termocicladors de la casa Roche, però els reactius són molt cars (ok). Són dues sondes i cada una té un fluorocrom, un a l’extrem 3’ i una a l’extrem 5’.
Multiplex En el mercat tenim diferents tipus de fluorocroms. Per tant, podem fer PCRs múltiples i podem analitzar diferents amplicons en la PCR si cada sonda té un fluorocrom en una longitud d’ona diferent.
Per exemple, podem utilitzar diferents retrovirus.
Cada reacció de PCR conté 4 parells d’encebadors i 4 sondes específiques per a seqüències úniques de 4 retrovirus: HIV-1 (fluoresceïna), HIV-2 (tetrafluoresceïna), HTLV-I (tetrametilrodamina) i HTLV-II (rodamina).
195 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Dissenyem encebadors específics per amplificar una seqüència del genoma específica del virus. A més dels dos primers es posa un encebador específic de cada locus i cada un està marcat amb un fluorocrom diferent. En funció d’això sabem quin retrovirus ha contaminat la mostra analitzada.
Si no tenim diners (xd) analitzem les corbes de fusió. El SYBR Green I no es pot usar per quantificar en una múltiplex però si serveix per identificar, ja que cada amplicó té una Tm diferent. Després de l’amplificació es farà un anàlisi de les corbes de fusió. En funció de la Tm, ens sortiran pics diferents. Cada pic correspon a un amplicó o un altre (d’un o altre retrovirus).
DETECCIÓ D’SNPs Amb les oligosondes podem identificar la presència de mutacions puntuals. S’utilitzen per la detecció d’SNPs.
Recordem que els oligonucleòtids de la PCR es poden fer servir com a : - Oligonucleòtids com a encebadors. L’especificitat ha d’estar a l’extrem 3’, perquè sinó no pot hibridar de manera estable. L’oligo coincideix amb l’extrem 3’.
Oligonucleòtids com a sondes. La sonda ve marcada i amb l’extrem 3’ bloquejat.
L’especificitat es troba en l’SNP amb el qual ha d’hibridar. En funció de si la sonda hibrida o no, la Taq la digerirà o no. Llavors: o Si hi ha emissió de fluorescència, hi ha la forma mutada de l’al·lel, la sonda s’ha digerit.
o Si no hi ha emissió de fluorescència, hi ha la forma salvatge de l’al·lel, la sonda no ha hibridat del tot i no s’ha digerit.
196 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Assaig TaqMan Per la detecció d’SNPs dissenyarem: - Dos encebadors que delimiten l’amplicó.
Una sonda específica per la mutació. En el cas de l’assaig TaqMan tindrà un fluorocrom a un extrem i un quencher a l’altre extrem. El fluorocrom, quan s’alliberi del quencher, desprendrà fluorescència.
Ara bé, aquest sistema només serveix per detectar regions al·lèliques conegudes. Si tenim un al·lel A i un C i només dissenyem l’oligo per detectar l’A, no veurem amplificació pel C.
llavors hem de fer dues oligosondes amb fluorocroms de longitud d’ona diferent.
197 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Si l’individu és homozigot, la sonda hibridarà, la Taq digerirà i s’alliberarà una determinada quantitat de fluorescència. Si l’individu és heterozigot, hi haurà hibridació i digestió en un al·lel però no en l’altre, de manera que hi haurà senyal fluorescent en un i bloqueig en l’altre. La quantitat de fluorescència no arribarà al nivells que tindríem si l’individu fos homozigot; així distingim quan hi ha un al·lel mutat de quan n’hi ha dos.
El termociclador et permet analitzar moltes mostres alhora. Es poden genotipar entre 50-100 mostres de diferents individus, i pots obtenir el resultat per cada individu o pel conjunt de mostres. En aquest gràfic tenim distribuïdes les regions que ens indicarien que estem davant d’homozigots per 1, per 2 o d’heterozigots.
198 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 ddPCR – Detecció de mutacions per PCR digital En una PCR digital se solen utilitzar oligosondes per la detecció d’una seqüència concreta. Per cada al·lel s’utilitza una sonda TaqMan marcada amb un fluorocrom diferent. Recordem que aquest tipus de PCR pot quantificar quantitats molt petites de DNA. Fins i tot es pot detectar la presència de cèl·lules tumorals i com aquestes responen a un tractament. En aquests casos, es pot estimar la proporció en una mateixa cèl·lula de còpies normals i còpies mutades per una mutació en concret.
Recordem també que es feia amb microgotes, i que molt poques d’aquestes contenien les dues còpies. En l’anàlisi doncs veurem que algunes microgotes no emeten fluorescència, altres ho fan per la còpia wt i altres per la còpia mutant. Així es pot quantificar quantes còpies hi ha mutants respecte les wt (estimem la proporció de cèl·lules tumorals en una mostra de teixit).
Detecció de metilació del DNA per PCR Les oligosondes també es poden utilitzar per detectar variacions en el patró de metilació del DNA. En aquest cas, dissenyarem dues sondes, una per presència i una per absència de metilació després d’un tractament amb bisulfit sòdic. Una detectarà la no modificació de la citosina (específica de no metilació; la sonda contindrà Adenina) i l’altre la metilació de la citosina (específica de metilació; la sonda contindrà Guanina). Cada una estarà marcada amb un fluorocrom diferent a un extrem i un Q en l’altre.
199 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Com hem dit, tractarem el gDNA amb bisulfit sòdic. Aquest tractament recordem que feia que les citosines no metilades passessin a ser Uracils (Timines), per tant ara aparellen amb Adenina. En funció de si hi ha o no metilació, obtindrem una fluorescència o una altra. En el nostre cas l’absència de metilació es veurà en color lila i la presència de metilació en color verd.
Quan analitzem el senyal, la diferència de senyal entre metilades i no metilades ens permet determinar el percentatge de metilació.
Fins i tot, si considerem el llindar (threshold), les còpies non metilades tallen un cicle i mig abans de les metilades. Per tant, podem determinar que hi ha el triple de còpies no metilades que metilades.
200 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 El mateix passaria en el cas de la PCR digital; si no hi ha metilació només tindràs senyal en la no metilació. Com abans, ens fixem en la proporció.
201 ...