HH (2007)

Otro Portugués
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 5º curso
Asignatura HH
Profesor E.I.
Año del apunte 2007
Páginas 20
Fecha de subida 02/07/2015
Descargas 14
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 2 – Regulació metabòlica TEMA 2: Transportadors 23-04-15 TRANSPORTADORS DE GLUCOSA SGLT: cotransportador de sodi i glucosa, GLUT5: també transporta glucosa, GLUT1: els resultats actuals apunten a que té una Km baixa (d’1mM), GLUT2: s’expressa a fetge, pàncrees, intestí i ronyó (no s’expressa ni a múscul ni a cervell) i té una Km molt elevada, GLUT1 i GLUT3: tenen una Km baixa i s’expressen a tots els teixits, GLUT4: només s’expressa a fetge i a teixit adipós i té una Km fisiològica.
Entre els grups de recerca hi ha discrepàncies respecte els valors de la Km dels diferents transportadors, la idea és que GLUT2 té una Km elevada, GLUT3 té una Km baixa, GLUT4 hi ha total consens, però GLUT1 hi ha discrepàncies. GLUT2 està present sobretot en pàncrees i fetge, mentre que GLUT1 que presenta més discrepàncies es troba per tots els teixits. GLUT3 sembla que pot expressar-se en tots els teixits, encara que en alguns llocs el posen com a transportador únic de cervell. GLUT4 s’expressa a múscul i a teixit adipós.
Característiques cinètiques dels transportadors de glucosa, de l’hexocinasa i de la glucocinasa La cinètica variarà en funció de la Km. Aquells transportadors amb Km elevades, tindran canvis de v i d’activitat més grans, mentre que aquells que tinguin Km baixes tindran canvis de v i d’activitat més petits quan la [glucosa] augmenti. La situació intermèdia és la de GLUT4.
1 TEMA 2 – Regulació metabòlica El gràfic de la dreta està lligat a l’enzim responsable de la fosforilació de la glucosa, en aquest cas l’hexocinasa, que té una Km molt baixa i no varia pràcticament l’activitat, mentre que la glucocinasa té una Km molt alta i sí que varia molt l’activitat.
Al múscul tenim GLUT4 i l’hexocinasa (Km intermèdia i Km baixa respectivament), mentre que al fetge tenim GLUT2 i la glucocinasa (ambdues tenen una Km elevada). Totes dues proteïnes tenen un paper regulador en el pas de glucosa a glucosa-6P. GLUT2 i la glucocinasa també s’expressen a les cèl·lules beta-pancreàtiques i posen en marxa els mecanismes que permeten l’alliberació de la insulina.
Combinació de regulacions per la insulina en diferents passos del tràfic en la membrana GLUT4 s’expressa en múscul i TA i és sensible a la insulina. La regulació de GLUT4 és deguda al reciclatge del receptors i dels endosomes.
GLUT4 és internalitzat als endosomes, que poden acumular-se dintre de la cèl·lula (tardaran en reciclarse) o poden anar directament al compartiment de reciclatge de proteïnes dels endosomes, on n’hi haurà molts i es concentraran les proteïnes que es volen reciclar en vesícules més petites, que podran anar a la membrana. En aquest reciclatge tenen un paper molt important els endosomes, els components de reciclatge de proteïnes i l’aparell de Golgi, per on passaran les vesícules per anar a la membrana. Tot el procés d’internalització és un procés complex amb diferents etapes i camins. El reciclatge de GLUT-4 en TA i múscul estimulats per insulina podria ser un cas especialitzat de la via de reciclatge dependent de clatrina, la qual té lloc en totes les cèl·lules. El mecanisme de control de la insulina estimula que els transportadors que estan endocitats en vesícules retornin a la membrana => augmenta el número de transportadors a la membrana (no incrementa la velocitat, sinó que afavoreix el retorn).
Hi ha també l’etapa de lligament de la vesícula a la membrana, també la d’ancoratge de la vesícula, després es fusiona i queda funcional. Hi ha diferents punts de control. Inicialment es pensava que la insulina blocava l’endocitosi, però s’ha vist que afavoreix el retorn a la membrana a diferents nivells.
2 TEMA 2 – Regulació metabòlica Alguns mecanismes es coneixen i d’altres no. Les etapes més conegudes són la 1, 2 i 5. Poden estar relacionades amb la PI-3 quinasa.
Rutes de senyalització iniciades per activació de IRTK (NO) La insulina s’uneix als receptors que fosforilen el substrat IRS, que serà el lloc d’ancoratge per a diferents enzims que s’activaran i activaran diferents vies de senyalització. Hi ha la via de les MAPK, del PI3quinasa i de les fosfolipases (concretament la gamma).
Efectes de la PKB sobre el metabolisme glucídic (NO) Sembla que el control de GLUT4 a la membrana ve donat per un efecte directe de la PKB sobre els GLUT4. A més PKB inicia una ruta que inhibeix la GSK3 i no es para la síntesi de glicogen. Les dues GSK3, tant alfa (ser9) com beta (ser21) s’inactiven per fosforilació, i la beta és més important perquè pot estar relacionada amb la proliferació cel·lular.
3 TEMA 2 – Regulació metabòlica Convergència de rutes de senyalització iniciades per insulina i exercici Rab-GAP és substrat de la PKB i l’AMPK. En resposta a la insulina la PKB (Akt) s’activa a través de la PI3K, que també pot activar formes rares de la PKC (èpsilon i gamma). La PKB pot fosforilar a la proteïna RabGAP, que juga paper important en la translocació de GLUT4 cap a la membrana plasmàtica. En una situació de repòs, l’activitat de la Rab-GAP evita el tràfic de GLUT4 cap a la superfície cel·lular mediat per Rab. D’aquesta manera, l’AMPK i la PKB actuen regulant la funció de les Rab. Davant l’estimulació per insulina, la PKB pot activar-se i fosforilar Rab-GAP (AS160), fent que Rab no es pugui inactivar (hidròlisi de GTP gràcies a les GAP; les GEF permetran l’intercanvi de GDP a GTP, són factors d’intercanvi de G).
Rab activa fa que el transportador GLUT4 torni a la membrana.
En el múscul aquest procés de retorn de GLUT4 a la membrana pot activar-se de manera independent a la insulina durant l’exercici, dependrà de:   Increment de calci en el citosol L’augment de Ca pot activar les calmodulines quinases dependents de calci (CaM-K) o les PKC (les formes clàssiques que vénen regulades només per calci). Aquestes quinases activaran altres quinases fins a arribar a un efector que tindrà efecte sobre la translocació de GLUT4.
Increment de l’AMP (incrementa la ràtio AMP/ATP, però l’ATP es manté, qui s’eleva és l’AMP) En situacions on hi ha molt consum d’energia. L’AMP permet l’activació de l’AMPK de manera independent a l’AMPc. L’AMPK és un dels principals sensors de l’estat energètic cel·lular i de la posada en marxa de mecanismes cel·lulars. Ve regulada per un metabòlit intern de la cèl·lula => no calen senyals extracel·lulars. LKB1 pot fosforilar en una treonina a l’AMPK, però no se sap com es regula. AMPK en estat basal és activa.
La resposta via insulina pot ser regulada negativament per la presència d’àcids grassos lliures (poden anar cap al múscul i ser metabolitzats), per citocines i per situacions d’estrès (acumulació de proteïnes al RE). Aquests fosforilen al receptor d’insulina o el substrat del receptor d’insulina (IRS) en serines aturant la cascada de senyalització.
4 TEMA 2 – Regulació metabòlica Transport de glucosa al fetge: Sistema G6Pasa (NO) Tenim el GLUT2, no regulat per insulina tant clarament com el GLUT4. No hi ha evidències clares. Està regulat bàsicament per canvis de concentració de la glucosa circulant. En el cas del fetge s’ha de tenir en compte que el GLUT2 actua entrant i fent sortir glucosa del fetge en funció de l’estat nutricional. És un transport bidireccional en funció de la concentració intra i extracel·lular de glucosa. La concentració de glucosa interna ve regulada per la que entra i per la concentració de glucosa alliberada a partir del glicogen. Cal tenir en compte que la glucosa que s’obté de glicogen és glucosa-1-fosfat, que passa a glucosa-6-fosfat. Per a tenir glucosa, cal l’actuació de la glucosa-6-fosfatasa, que es troba a les membranes del reticle endoplasmàtic. Els braços més curts estan de cara al citosol, i els més llargs estan de cara a la llum del RE, ja que és una 7TM. La hidròlisi de glucosa-6-fosfat a glucosa es dóna doncs a l’interior del RE. Primer de tot cal que entri la glucosa-6-fosfat, per un transportador que no té a veure amb els GLUT. Dins el RE la glucosa-6-fosfat és hidrolitzada en glucosa i Pi. La glucosa ha de retornar al citosol, i després a fora. El retorn de glucosa al citosol implica la participació d’un altre tipus de transportadors, no el GLUT2, és un T3, del que no s’ha trobat mecanisme de control. El Pi també ha de sortir del RE, per un T2 tampoc massa caracteritzat, però actualment es diu que el mateix transportador de glucosa-6-fosfat, seria un transportador antiparal·lel de Pi i glucosa-6fosfat.
Cal regular doncs les activitats del transportadors del RE o de la glucosa-6-fosfatasa. Hi ha hormones que regulen l’expressió del gen de la glucosa-6-fosfatasa.
Regulació de la hipòxia i gens de resposta a l’estrès per HIF GLUT1 i GLUT3 es poden expressar en tots els teixits. Al múscul i al fetge no són els principals. S’ha vist que aquests transportadors estan regulats per canvis en l’expressió gènica a nivell de presència de proteïnes transportadores. Dins dels mecanismes de resposta hi ha la resposta que es produeix en les situacions d’hipòxia (O2 baix) => no podrà fer metabolisme aerobi => necessitarà més glucosa per la glucòlisi, ja que disminueix el rendiment energètic. Els canvis en l’entrada de la glucosa es donen per transportadors GLUT1 i 3, tenen una Km molt baixa. Es controlen per expressió gènica. S’activa el factor de transcripció HIF (factor induïble per hipòxia). HIF augmenta la quantitat de transportadors de glucosa 5 TEMA 2 – Regulació metabòlica a les cèl·lules, augmenta els nivells d’enzims glucolítics i intenta revertir la manca d’oxigen incrementant l’angiogènesi, que és la vascularització (VEGF).
Regulació del HIF HIF-1 és un factor de transcripció amb una estructura heterodimèrica (alfa i beta). La subunitat beta és una proteïna que s’expressa de forma constitutiva i per sí sola no és funcional => perquè pugui interaccionar amb l’element de resposta a hormones, cal que estigui formant el dímer. La subunitat alfa és una subunitat que varia la seva concentració en funció dels nivells d’oxigenació. Aquesta se sintetitza contínuament, però si hi ha oxigen serà degradada, de manera que els seus nivells són molt baixos. En condicions d’hipòxia s’atura la degradació, s’acumula la subunitat alfa i l’heterodímer es pot unir al HRE i donar lloc als productes gènics.
HIF-1 alfa conté prolines que es poden hidroxilar en condicions normals d’oxigen per l’enzim prolilhidroxilasa (enzims PHD). En aquesta reacció d’hidroxilació cal O2 molecular i també cal la presència de Fe. Sembla ser que es requereix la presència d’alfa-cetoglutarat (amb la conseqüent formació de succinat). Un cop s’ha produït la hidroxilació, la presència d’aquests grups fa que la proteïna pugui interaccionar amb la pVHL (proteïna relacionada amb el síndrome de VHL), que recluta diferents proteïnes, formant un complex amb activitat ubiqüitina lligasa. Es produeix la poliubiqüitinació de l’alfa, una senyal de degradació al proteosoma.
6 TEMA 2 – Regulació metabòlica En condicions de normòxia, HIF-1-alfa sintetitzat és eliminat sistemàticament. Si manca la pVHL sempre tindrem HIF-1 activa => es produeix una hipervascularització, s’afavoreix la glucòlisi... S’afavoreix la proliferació cel·lular. És un gen supressor de tumors.
L’activitat PDH ve bloquejada per citrat, isocitrat, fumarat i succinat. Si s’acumulen aquests metabòlits vol dir que aquests metabòlits no podran tirar cap endavant perquè hi ha poca oxigenació (no queden coenzims oxidats). Els metabòlits intermediaris actuen com a missatgers i regulen l’expressió gènica. Hi ha la isoforma HIF-2-alfa que també interacciona amb HIF-1-beta i és més tumorogènica.
Elements de transcripció reguladors del promotor del gen de GLUT2 TRANSPORTADORS D’AMINOÀCIDS Els aminoàcids són captats pels diferents tipus cel·lulars. A diferència del què succeeix amb la glucosa, no són transformats en un producte de retenció dintre de la cèl·lula => aquests aminoàcids lliures poden anar cap al seu destí principal, que és cap al recanvi proteic. Haurem de tenir en compte la síntesi proteica i la seva degradació (hi ha un pool d’aminoàcids). Tot sovint, amb la ingesta es capten més aa dels necessaris pel recanvi proteic (són metabolitzats). IMP: destacar que els aa que entren queden com aa lliures.
Excepte els teixits que expressen glucocinasa i GLUT2 enlloc d’hexocinasa, la [glucosa] sempre es manté molt baixa, ja que hi ha mecanismes de retenció. GLUT2 és bidireccional, però la resta de transportadors 7 TEMA 2 – Regulació metabòlica actuen de forma unidireccional perquè la concentració de glucosa lliure intracel·lular és molt baixa. En el cas dels aa, la concentració intracel·lular d’aquests és molt elevada, amb ràtios intra/extra molt altes.
Aquest procés necessita energia perquè es produeixi aquest transport en contra de gradient.
La taula mostra les concentracions d’aminoàcids en el múscul: En el cas dels glúcids tenim un únic compost important, la glucosa, però en el cas dels aa en tenim 20 naturals => els transportadors seran més complexes. Malgrat tot, els transportadors d’aminoàcids no són del tot específics, ja que un mateix transportador pot portar més d’un tipus d’aminoàcid. Ara bé, els aa transportats tenen propietats similars. També hi ha aa transportats per diversos transportadors.
Podem classificar els transportadors d’aminoàcids en funció de si depenen o no de sodi: Acoblament de transportadors d’aminoàcids Cap d’aquests transportadors està íntimament relacionat amb un procés d’energia (no són bombes de transport actiu primari). Tenen serines fosforilables, però encara no sabem si això comporta cap tipus de regulació. El transport dels aminoàcids va associat a un bon funcionament de la bomba Na/K+ (transport 8 TEMA 2 – Regulació metabòlica actiu secundari), es fa un cotransport (antiport). La diferència de gradient de sodi afavoreix l’entrada en contra de gradient dels aminoàcids.
També hi ha transport actiu terciari! De vegades s’acumula molt un aa en concret, però d’altres no poden ser transportats per transport actiu secundari. Per poder incorporar-lo es fa servir un transport terciari (sistema L), que empra la diferent concentració entre dintre i fora d’un determinat aa per provocar que la sortida d’aquest aa permeti l’entrada d’un altre aa cap a dintre de la cèl·lula).
27-04-15 Transportadors i transceptors d’aminoàcids Com regulen la quantitat de transportadors? El nº total de transportadors a la membrana permetrà un transport més o menys ràpid dels aminoàcids. En una situació en la qual la [aminoàcids] disminueix s’ha 9 TEMA 2 – Regulació metabòlica d’augmentar el nombre de transportadors. Per canvis a nivell de l’expressió dels transportadors podrem incrementar el nombre d’aquests (no hi ha spare transporters). Aminoàcids dintre cèl·lula poden fer de senyals perquè augmenti l’expressió de receptors d’aminoàcids.
L’augment de la síntesi proteica el podem explicar per un augment de la concentració intracel·lular d’aa, que estimula l’activitat del complex TORC1 i bloqueja la de GCN2, que són proteïnes quinases. La funció d’aquests és controlar la síntesi proteica: GCN2 la inactiva, mentre que TORC1 l’activa. Així doncs, quan els nivells intracel·lulars d’aminoàcids augmenten, TORC1 s’activa i s’estimula la síntesi proteica (no l’expressió gènica). A nivell de GCN2, aquesta és un gen vital de control general i regula l’expressió d’un TF que activa la transcripció (ATF4). Quan ATF4 està activat augmenta l’expressió dels transportadors d’aminoàcids. Un augment en la [aminoàcids] regula negativament GCN2, que bloquejarà l’expressió d’ATPF4 disminuint l’expressió dels transportadors, ja no en necessitarem tants. Sembla que TORC1 té alguna relació amb ATF4 també, però no se sap.
TORC1: senyalització per PI3K/Akt Via senyalització de la PI3K, que era per la interacció de insulina, s’activa la PI3K, que activarà les PDK, entre elles PDK1, que es troba a la membrana i un cop activa fosforila Akt (o PKB). La PKB fosforila i bloqueja els bloquejants de Rheb, denominats TSC1 i TSC2. Rheb és una proteïna G petita que un cop activada desencadena la cascada de senyalització al activar mTOR, que és la diana de la rapamicina. La quinasa mTOR pot formar dos tipus de complexes: TROC1 (més típic) i TORC2. Aquests complexes estan formats per mTOR i altres proteïnes, però n’hi ha dues que marquen quin tipus de complex es forma. Si hi ha raptor es forma TORC1 (proteïnes quinasa implicades en la resposta de fàrmacs), mentre que si hi ha rictor es forma TORC2.
Perquè sigui totalment activada cal la fosforilació de la serina a part de la treonina, cal la doble fosforilació per activar Akt. Thr308 és la necessària per fer l’efecte (fosforilada per PDK1), però també cal la Ser473 (fosforilada per PDK2). S’ha vist que Akt activa amb moltes fosforilacions en Ser473 i 10 TEMA 2 – Regulació metabòlica poques en Thr308, això ja pot provocar algunes respostes cel·lulars, però poques => algunes vegades amb la fosforilació de serina i prou Akt ja és activa. Es creia que hi ha una PDK2s que fosforila Akt, però no s’ha identificat. S’ha vist que TORC2 és una de les quinases que activa la Ser473. La idea és que cal TORC2 per acabar de fosforilar.
Aquesta via de senyalització està afectada per la insulina (l’hem vist), però també per nutrients com la glucosa i els aminoàcids. Ja vam veure que aquesta via pot servir per explicar algunes situacions en les quals l’augment de la captació de glucosa per part de la cèl·lula muscular augmenta encara que no hi hagi insulina. Si hi ha molts nutrients, entre ells glucosa i aminoàcids.
Com intervenen els aminoàcids? S’ha vist que l’activació de Rheb pot donar-se no només de resposta a l’eliminació del bloqueig de TSC1 i TSC2 com a conseqüència de la fosoforilació d’aquests per Akt, sinó que la presència de components com glucosa i sobretot aa lliures, el mecanisme, que no se sap ben bé com funciona, provoca l’activació de Rheb fent que s’activi mTOR, que pot formar el complex TORC2. El complex TORC2 pot fosforilar Akt, fent que el cicle augmenti més.
A part d’això, la presència d’aa activant mTOR fa que s’afavoreixi la presència de TORC2 i TORC1. TORC1 és qui té un paper important regulant la síntesi proteica!! Un dels enzims caracteritzats pel qual actua TORC1 és l’enzim S6K una quinasa que està dintre de les proteïnes amb l’activitat petita del ribosoma. És una senyal que promou que hi hagi augment en la taxa de síntesi proteica.
GCN2 i mTOR: síntesi proteica Repàs: hi ha tres parts de la síntesi proteica: iniciació, elongació i terminació. En totes tres etapes hi ha diferents punts de control. A allà on hi ha més punts de control és en l’etapa de la iniciació: 11 TEMA 2 – Regulació metabòlica Hi ha dues vies d’entrada a la síntesi proteica i en ambdues branques hi ha diversos punts de control: 1) Punt de control pel complex eiF4F Per reclutar el mRNA el factor eiF4 intervé estrictament. La majoria dels mRNA cel·lulars tenen en la cua de polyA en 3’ i en 5’ tenen l’estructura K. Intervenen factors de reducció per iniciar la síntesi proteica que reconeixen l’estructura K (el cap del mRNA). 4E reconeix específicament l’estructura K, que interacciona amb altres components d’altres subunitats del complex eiF4 fent que aquest sigui funcionalment actiu. Al final cal que eiF4 estigui unit al mRNA. Per tal que eiF4 pugui unir-se al mRNA cal que 4E estigui lliure. La unió d’EIF4 amb el mRNA ve afectada per la interacció per 4E amb proteïnes BP. Quan 4E està unit a 4EBP no és funcional i no s’iniciarà la síntesi proteica (situació de repòs). Per dissociar aquest complex cal la fosforilació de 4EBP, fent que BP es dissociï de 4E => cal que 4E estigui lliure perquè pugui reconèixer l’estructura K i es formi el complex de pre-iniciació. La fosforilació de 4EBP pot donar-se per mTOR => afavoreix la síntesi proteica (mTOR també fosforila S6K, una proteïna quinasa que també fosforila altres subunitats del complex d’iniciació de la traducció). Aquesta fosforilació també es pot donar via les MAPk.
2) Punt de control pel complex eiF2 Comença per la subunitat 40S, que s’acobla a diferents elements per formar el complex 43S. En aquesta branca juga un paper important eiF2, que forma un complex ternari amb el GTP i la metionil-tRNA (porta la metionina d’iniciació de la traducció). La formació del complex ternari és una de les etapes imprescindibles per la síntesi proteica. És un dels punts d’entrada cap a la iniciació de la reducció. D’aquí només es coneix la subunitat 43S, però no hi ha el mRNA, per reclutar-lo cal que hi hagi l’altra branca, on hi ha els factors iniciadors de la traducció, que van formant complexes i al final s’uneixen a la 43S formant el complex 48S.
Així doncs, per la iniciació de la síntesi proteica és imprescindible la formació del complex ternari i quan el ribosoma ja està pràcticament acoblat, eiF2 hidrolitza GTP a través d’una GTPasa, fent que s’alliberi eiF2, GDP i Pi (el tRNA no s’allibera perquè ja està interaccionant amb el ribosoma => es quedarà a allà). Perquè la síntesi proteica torni a iniciar-se cal que eiF2 torni a unir un GTP i alliberi el GDP. Per això cal una GEF (proteïna bescanviadora de GDP per GTP), que és eiF2B => eiF2B interaccionarà amb eiF2 i l’activarà permetent que torni a iniciar-se la traducció. Aquest intercanvi de GDP per GTP ve controlat per diferents proteïnes quinases, entre elles GCN2.
EIF2 i control de la iniciació per GCN2 12 TEMA 2 – Regulació metabòlica Esquema de com funciona l’intercanvi de GDP a GTP a eiF2. I a sota hi ha el complex: eiF2 està composat per tres subunitats (alfa, beta i gamma), eiF2B està constituït per 5 subunitats, entre les quals hi ha les que interaccionen amb el GDP i GTP, que afavoreixen aquest bescanvi, que son la gamma i la èpsilon, és el punt catalític. Les subunitats alfa, beta i delta d’eiF2B no participen en l’intercanvi, però en el moment que formen el complex queden molt properes a eiF2 alfa, aquesta unió sinó seria molt transitòria, però si eiF2 està fosforilat en alfa en una serina, quan se li uneix eiF2B per fer el bescanvi, les subunitats delta, beta i alfa passen a unir-se molt fortament i el complex no se separa => eiF2 queda atrapat per eiF2B, però a la vegada a les cèl·lules d’eiF2 n’hi ha força, però d’eiF2B n’hi ha molt poc => si es fosforila una part important d’eiF2, el suficient per captar tot eiF2B, s’acaba parant la síntesi proteica. No és la fosforilació en sí, sinó el fet que atrapa l’eiF2B.
De les quinases que fosforilen eiF2, en mamífers n’hi ha 4 tipus diferents de ben caracteritzades degut a patologies: 1) HRI (quinasa inhibida pel grup hemo) La primera va ser HRI. La síntesi proteica en mamífers ha estat molt estudiada en reticulòcits de conill, que són els precursors dels eritròcits, que tenen una síntesi proteica molt ràpida, en especial l’hemoglobina. En aquests es va veure que la síntesi proteica venia regulada pel grup hemo (hemina), si hi havia un dèficit de grup hemo es parava la síntesi proteica, mentre que si n’hi havia molt s’augmentava. Es va postular que hi hauria un inhibidor regulat per hemina, que és HRI. HRI és activat quan hi ha poc hemo i és una de les quinases que fosforila la Ser en eiF2.
2) PKR (proteïna quinasa regulable per RNA) Van veure que en infeccions víriques es parava la síntesi de les proteïnes cel·lulars fent que se sintetitzessin les proteïnes codificades pel virus. Es va veure que es donava en particular en el cas d’infecció de virus de dsRNA (present en molts virus) per un mecanisme de cell-shutdown.
3) GCN2 Van veure que en llevats (i després també ho van veure en mamífers) la síntesi proteica venia regulada per la presència d’aa (nivells baixos parava, nivells elevats augmentava). Va ser quan es va caracteritzar que dintre dels gens dels GCN (general control nonderepressible) hi havia un factor que és el que feia aquest efecte, es va veure que és una quinasa regulada pels nivells d’aminoacil tRNA.
4) PERK Finalment, en situacions d’estrès com podria ser l’acumulació de proteïnes mal plegades en el RE (UPR: unfolding protein response), també es para la síntesi proteica. Això és degut a PERK, una quinasa del RE.
Activació de la GCN2 per tRNA no carregat Regulació ve donada perquè GCN2 pot estar en la forma lliure o té una tendència a unir els tRNA quan aquests estan lliures d’aminoàcids. Si hi ha un nivell d’aa lliures baixos, hi haurà poc aminoacil tRNA, que és imprescindible per la síntesi proteica. Hi haurà molt tRNA buit i aquest interacciona amb un dels dominis de la GCN2 (PK), que s’activarà (canvi conformacional que exposa el domini catalític) i s’acabarà aturant la síntesi proteica. La fosforilació de la GCN2 per TOR potencia la seva activació, però no pot activar-la per ella mateixa.
13 TEMA 2 – Regulació metabòlica Senyalització de la resposta a proteïnes mal plegades mitjançant PERK PERK és una proteïna quinasa que es troba inserida a la membrana del reticle i que té el centre actiu exposat a la cara citosòlica. En condicions normals es troba a la membrana del reticle i interacciona amb la xaperona BiP (PERK està inactiva perquè no pot dimeritzar). Quan hi ha una acumulació de proteïnes mal plegades (excés de síntesi), la xaperona BiP interaccionarà amb aquestes i permetrà l’alliberament de PERK => d’aquesta manera PERK podrà dimeritzar i activar-se per autotransfosforilació.
PERK activa pot fosforilar eiF2, que quedarà inactiva unida a eiF2B. No hi haurà una parada total de la síntesi proteica, sinó que hi haurà una parada molt forta de la traducció dels mRNA, però s’activa a la vegada la traducció d’altres mRNA que de normal no es tradueixen!!! Aquesta fosforilació doncs, atura la traducció de la majoria de les proteïnes cel·lulars, però activa algunes proteïnes com les GCN4 (ATF4 en mamífers), que són factors de transcripció que promouen l’expressió d’aquells gens que codifiquen per proteïnes relacionades amb la supervivència en situacions d’estrès.
Per tant, si hi ha nivells baixos d’aminoàcids => GCN2 s’activa i fosforila eiF2 => s’atura la majoria de la síntesi proteica i augmenta l’expressió d’ATF4 => augmenta l’expressió de gens que transporten aa => augmenten els transportadors d’aa a la mb.
14 TEMA 2 – Regulació metabòlica Per què es paren uns i augmenten els altres? En els mRNA, la traducció comença quan es troba el codó d’iniciació AUG, però dintre del mRNA hi ha varis AUG. Generalment el primer que es troba és el que es fa servir per iniciar la síntesi, però hi ha mRNA que tenen varis AUG que poden servir de punt d’inici de la traducció i la síntesi proteica comença la traducció quan es troba AUG i continua fins al codó de STOP.
Hi ha mRNA que contenen vàries pautes de ruptura de traducció, varis OFF, n’és un exemple GCN4 (de llevats). En el mRNA de GCN4 s’ha vist que abans de l’AUG d’inici de traducció del què seria l’ORF del propi GCN4, hi ha 4 trossos que són ORF’s, pautes de lectura, anomenats upper ORF’s. Això vol dir que quan s’uneix mRNA i s’acobla el ribosoma, el primer ORF es tradueix i dóna lloc a un pèptid curt que s’allibera, troba el codó de STOP, però està molt lluny del final, de la cua polyA. En aquest punt es produeix com una certa separació de subunitats però no s’allunya totalment, de manera que es pot tornar a unir al ribosoma quan troba el següent ORF. Però perquè això es doni cal que hi hagi el complex ternari, sinó no es pot reiniciar la síntesi proteica. Quan s’està en una situació en la qual eiF2 és totalment funcional, s’acobla el ribosoma en el primer ORF, es tradueix el pèptid, després es dissocia una mica del ribosoma i pot tornar a recarregar el complex ternari i fer el segon ORF i va fent fins el quart ORF. Cada cicle que hi ha mig dissociació hi ha una certa probabilitat que se separin del tot, si ho fa quatre vegades, la probabilitat de separació és molt gran, de manera que abans d’arribar al ORF de GCN4 ja s’han separat les subunitats ribosmoals i aquest no es tradueix. Si hi ha pocs aa i la majoria de l’eiF2 està inactiu o li costa molt recanviar el GDP per GTP => la probabilitat de recàrrega per arribar ja en el segon ORF és molt baixa, i cada cop més => tarda molt temps en poder-se recarregar el complex ternari => li dóna temps de passar a tots els ORF fins arribar al quart i sintetitzar GCN4.
Si eiF2 està activat el cicle és molt ràpid i en cada pas del primer al segon hi ha una certa probabilitat que el ribosoma es dissociï del tot, com que n’hi ha quatre la probabilitat és molt elevada. Si el procés de recanvi va molt més lent perquè eiF2 és poc funcional (està fosforilat), aleshores el ribosoma va avançant igual, va avançant perquè no hi ha complex ternari, de manera que se salta els ORF i s’inicia GCN4. Sempre hi ha alguna traducció dels altres pèptids, sempre nivells basals, però la quantitat és molt més baixa.
En la imatge observem que GCN4 té 5 ORF diferents, ATF4 en té 3 (el segon està solapat amb una pauta de lectura de l’ATF4 sense STOP => en funció d’on es comenci es traduirà el primer pèptid o es traduirà ATF4). Podem trobar per tant uORF (upstream ORF) i ORF solapats.
15 TEMA 2 – Regulació metabòlica Hi ha moltes proteïnes amb paper regulador que tenen aquesta estructura, en les quals hi ha varis ORF i fa que es tradueixin o no i en molts casos o més llargues o curtes segons el punt d’iniciació. El punt d’inici de la traducció no només depèn de la presència d’AUG, sinó que també depèn del context en el qual està posat, igual en la transcripció.
La capacitat d’un mRNA nadiu ve afectada per la presència de diferents uORF:    Seqüència que tenen al voltant d’AUG (context), com la seqüència KOZAK, que incrementa la traducció d’aquest ORF Nombre d’ORF Espaiat entre ORF’s També cal tenir en compte que la fosforilació d’eiF2 (té 4 PK) en el cas dels mamífers respon a senyals intracel·lulars => la síntesi proteica és un mecanisme tan bàsic que ve controlat directament per canvis intracel·lulars, no hi ha sensors externs. Hi ha regulació de la traducció a nivell extracel·lular gràcies a TOR, però no en l’etapa d’eiF2.
No s’ha pogut demostrar la hipòtesi que a més d’haver-hi transportadors d’aminoàcids, hi hauria sensors d’aminoàcids que també podrien afectar a la posada en marxa de la via TOR. Aquests sensors afectarien diferent en funció de si tinguessin un aminoàcid unit a la cara interna o a la cara externa (transceptors).
28-04-15 TRANSPORT DE LÍPIDS (AG) Àcids grassos lliures són transportats per la sang amb unió a l’albúmina i quan arriben a cèl·lules que tenen necessitat de font de nutrients els capten i un cop entren immediatament els uneixen amb el coenzim A formant acil-Coa (queden retinguts, igual que la glucosa amb el P).
16 TEMA 2 – Regulació metabòlica La [] cel·lular d’aminoàcids lliures és més elevada que en la sang? A aquí passa el mateix, àcids grassos entren a la cèl·lula i donen acil-Coa => [] àcids grassos dintre de la cèl·lula és baixa perquè ràpidament passen a acil-Coa. Aquest procés és catalitzat per l’enzim acil-Coa sintasa, ja el vam veure.
Transportadors d’àcids grassos associats a membrana Com es produeix l’entrada dels àcids grassos cap a dintre de la cèl·lula? Durant molt temps es creia que era per difusió passiva degut a la seva característica amfipàtica (cap polar, cua hidrofòbica), que permetria que s’inserís a la bicapa lipídica i amb un flip-flop entrar. Es veu que aquest mecanisme segueix acceptant-se i és el més general pels àcids grassos de cadena curta. Però dintre de l’organisme hi ha molts àcids grassos de cadena llarga (FA) o molt llarga (VLCFA) i el procés d’entrada és diferent, ja que per flip-flop sembla que és difícil. A part que pugui haver-hi entrada per aquest mecanisme, també hi ha mecanismes addicionals que reforcen això o que actuen com a transportadors, constituïts per proteïnes de mb que afavoreixen la captació d’àcids grassos => proteïnes transportadores d’àcids grassos de la sang al citosol. Dintre d’aquests transportadors hi ha la família de les FATP (fatty acid transport protein). A part d’això també hi ha una translocasa d’àcids grassos, denominada freqüentment com a CD36. Hi hauria dos tipus de proteïnes implicades en el transport: FATP i CD36. A part hi ha proteïnes que actuen com a reconeixement dels àcids grassos, unint-los i facilitant-ne el transport per les FATP, el localitza perquè es pugui produir el transport. Aquestes proteïnes s’anomenen FABP (fatty acid binding protein). A més a més, sovint també hi ha un procés d’entrada d’àcids grassos captats associat a la formació de vacúols... => en alguns processos també intervenen les caveolines i altres.
17 TEMA 2 – Regulació metabòlica Esquema que ho resumeix. Model de la CD36 en el qual estaria associada a FABP, que estaria exposada a la part externa de la mb plasmàtica, FABP uniria l’àcid gras i facilitaria que CD36 reconegués l’àcid gras, l’entrés dintre i a dintre hi hauria la FABP citosòlica que presentaria l’àcid gras a l’acil-Coa sintasa per sintetitzar acil-Coa. Hi ha diferents CD36 (correran diferent en un gel segons el grau de glicosilació), si no està glicosilada pesa uns 35KDa, però glicosilada pot arribar als 100KDa, no se sap el perquè d’aquestes glicosilacions.
També veiem l’altra via, la de les FATP, en aquest cas s’ha vist que l’entrada de l’àcid gras pot anar directament amb participació o no de les FABP (no calen), i moltes de les FATP ja tenen associat l’acilCoa sintasa. Els àcids grassos de cadena molt llarga (VLCFA) solen entrar per la via de les FATP, mentre que els que tenen la cadena llarga (FA) solen entrar per la de la CD36 o podrien entrar per les dues.
FATP1 pot transportar diferents tipus de FA, alguns dels quals no podrà esterificar => necessitarà la participació d’ACS1 per poder unir-los-hi el Coa. CD36 en canvi, ha d’unir dues FABP i només actua com a transportador => ACS1 esterifica.
18 TEMA 2 – Regulació metabòlica Com es regula aquest transport? Hi ha moltes hipòtesis: diversitat de FATP (no ho veurem en detall). Ens interessa veure la regulació dels àcids grassos juntament amb la glucosa. L’esquema mostra la similitud de regulació entre la glucosa i els FA en múscul cardíac. CD36 és el més estudiat en regulació i s’ha vist que el mecanisme pel qual es controla la capacitat de captació és el procés d’internalització (endocitosi) i el procés de retorn del transportador cap a la mb plasmàtica (exocitosi), mecanisme molt semblant al de GLUT4 (vindria regulada pels mateixos mecanismes, amb participació de l’AMPK i la PKB).
CD36 i GLUT4 en un múscul resistent a la insulina Tot aquest fenomen de transport sembla que guarda relació amb la predisposició o situació prèvia a l’aparició de la diabetis de tipus 2 degut a resistència a la insulina => problemes amb CD36 en etapes de pre-diabetis.
En situacions normals GLUT4 pot anar cap a la mb del múscul i augmentar els seus nivells. Es dóna quan hi ha un augment de la glucosa en sang (després d’ingerir). Si a més a més d’haver-hi glucosa està en una situació en la qual hi ha àcids grassos circulants en elevada [], el CD36 va cap a la mb plasmàtica i capta els àcids grassos a dintre de la cèl·lula i també poden ser consumits per produir glucosa.
Si el múscul no tingués glicogen o en tingués poc, s’acumularia i aniria cap a glicogen, però això té un valor finit, si el múscul té emmagatzemat el màxim de glicogen => agafaria la glucosa i la degradaria i els 19 TEMA 2 – Regulació metabòlica àcids grassos podria passar que s’acumulessin en forma de cotícules lipídiques dins la cèl·lula muscular (normalment no s’emmagatzemen a aquí, sinó les cèl·lules que envolten el múscul). Aquesta acumulació en el múscul i el pas de CD36 a la mb, el què produeixen és que el CD36 encara vagi més cap a la mb, en situacions amb molts lípids circulants i encara s’augmenta més el retorn de CD36 cap a la mb plasmàtica.
CD36 a més a més d’actuar de transportador d’àcids grassos, també podria actuar de receptor o pseudoreceptor d’àcids grassos, és senyal de la circulació de molts àcids grassos circulants, i pot activar vies de senyalització de quinases => produeix canvis dintre de la cèl·lula. El que sí que fa és augmentar els àcids grassos dintre de la cèl·lula, augmenta molt la síntesi de DAG. DAG s’ha vist que és un activador d’una proteïna quinasa important, la PKC (DAG és missatger secundari) -> PKC activada per Ca i DAG.
PKC és una quinasa que fosforila en serines el receptor d’insulina, fent que aquest perdi l’activitat tirosina-quinasa o que disminueixi molt => pot passar que el receptor d’insulina esdevingui insensible a la presència d’insulina => el GLUT4 que havíem passat a la mb per captar el màxim de glucosa i disminuir els nivells de glucèmia no respon a insulina, de manera que els GLUT4 tornen a internalitzar-se i el múscul no capta glucosa, hi ha nivells d’hiperglucèmia => diabetis. El mateix passarà amb els àcids grassos => hiperlipèmia.
Mecanismes que poden produir resistència a la insulina Diferents factors que regulen la capacitat de resposta en presència d’insulina -> nivells insulina normals o fins i tot més elevats del normal, però en els quals no hi ha resposta a la insulina. Moltes són degudes a que bé per activació de les MAPk o de DAG, o de p38... (qualsevol de l’esquema i altres quinases més), poden acabar fosforilat el receptor d’insulina en serines o fosforilar el substrat del receptor d’insulina en serines (IRS) o fins i tot hi ha situacions en les quals bloquegen una quinasa, la p110p85 (PKB).
Per qualsevol d’aquests mecanismes es pot bloquejar la resposta a la insulina. La presència de proteïnes relacionades en situacions d’inflamació, en obesitat... també poden bloquejar la resposta -> SOCS.
20 ...