2. Tècniques d'estudi de les cèl·lules (II) (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 1º curso
Asignatura biologia cel·lular
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 22/03/2016
Descargas 13
Subido por

Vista previa del texto

MRDD MÈTODES D’ESTUDI DE LES CÈL·LULES (II) Microscopia òptica i electrònica Fraccionament cel·lular Centrifugació diferencial La tècnica del fraccionament cel·lular s’utilitza quan es vol fer un estudi en profunditat d’un cert tipus de mostra.
La centrifugació diferencial es basa en agafar un tros de teixit, posar-lo dins d’un homogeneïtzador (tub d’assaig amb un èmbol interior que el què fa és convertir la mostra inicial en una substància líquida, anomenada homogeneïtzat). Durant aquest procés mecànic les cèl·lules s’inflen per la pressió i acaben trencant-se alliberant així tot el contingut cel·lular.
Per a obtenir una fracció pura de cadascun dels orgànuls alliberats, es fan un seguit de proves que classifica aquestes components segons la mida i la densitat. Aquestes tècniques són bàsicament centrifugacions.
Exemple per a estudiar ribosomes: En la primera centrifugació, es separen els nuclis (1000 g, 20’). En el sobrenedant és sempre on queden les restes.
En la segona centrifugació, centrifugarem la mostra i obtindrem els orgànuls més grans de la cèl·lula (mitocondris, lisosomes i peroxisomes).
(10 000g, 20’).
La resta del citoplasma que queda en el sobrenedant el tornem a posar en un altre tub d’assaig i el tornem a centrifugar (a velocitat ultracentrífuga) (105 000g, 2h). Ara en la part del precipitat tindrem ribosomes lliures juntament amb ribosomes units a parts de parets del RER. Per a obtenir aquesta fracció pura de ribosomes ara tornem a centrifugar (105 000g, 20’) però afegint desoxicolat sòdic, que el que fa és desenganxar la fracció dels ribosomes enganxats a la membrana del RER.
Finalment en el sobrenedant quedaran les fraccions de les membranes del RER i en el precipitat quedaran els ribosomes lliures.
MRDD Gradient de densitat Aquesta tècnica es basa en que al llarg d’un tub d’assaig, es genera un gradient pronunciat, per exemple, de sacarosa i s’hi afegeix la mostra a estudiar. Com més pronunciada sigui aquesta concentració de sacarosa, més retingudes quedaran les substàncies a estudiar. Al centrifuga la mostra, es veu que es generen unes bandes que retindran els orgànuls cel·lulars que tinguin la mateixa densitat i la mateixa mida. Per a separar els diferents components s’empra un tipus de tub d’assaig foradat per la part inferior i d’aquesta manera es van separant les diferents parts les quals normalment s’identifiquen per un canvi de color. Després s’estudia cada mostra per separat per veure quina és la fracció d’estudi.
Nuclis Per a comprovar la puresa de cadascuna de les mostres obtingudes anteriorment, normalment s’utilitza un MET per a comprovar no tan sols la forma sinó el contingut de cadascun dels orgànuls de les mostres.
Mitocondris, lisosomes i peroxisomes.
Vesícules de l’Ap. Golgi, RE...
Microsomes: RER amb ribosomes units i ribosomes lliures.
Tècniques d’estudi de les cèl·lules Cultius cel·lulars: Fibroblasts, limfòcits, bactèries, cèl·lules HeLa, L, etc.
 Per estudis fisiològics  Per estudis morfològics  Per estudis químics Tot i que aquestes són les més comuns, avui en dia es poden cultivar gairebé tots els tipus de cèl·lules.
Tipus de cultius cel·lulars:  Cultius primaris (s’inicien). Es realitzen al laboratori per primer cop. (Ex: individu que s’ha de fer un cariotip).
 Cultius secundaris (reiteració del cultiu primari). Subcultivació del cultiu primari per a la seva supervivència.
 Cultius de línies establertes (cèl·lules adaptades a un creixement prolongat in vitro). Ex: Cèl·lules HeLa, L, etc.
Molts cops són col·leccions de cultius que es compren directament per a fer estudis.
Normalment aquestes tècniques d’estudi s’estudien per a veure el funcionament de diversos processos i, a la vegada, per a entendre i saber quins són els components que actuen en cadascun d’aquests processos. Els mètodes més comuns per a identificar aquestes desenvolupaments els de reconeixement enzimàtic, ja que permeten localitzar cadascun dels enzims que actuen en un determinat procés.
Normalment es reconeix que la reacció ha estat positiva gràcies a l’addicció d’un marcador prèviament.
Aquests marcadors es poden identificar mitjançant l’observació a través del MET i poden ser:  Partícules d’or: s’uneixen aquestes fraccions al substrat i mitjançant el contrast es localitzen.
També es poden afegir molècules d’or de diferents mides per localitzar diferents partícules.
 Precipitat: S’empren substàncies que al reaccionar amb un determinat enzim precipitin. Per això es fan reaccions intermèdies per a poder observar més acuradament cadascuna de les reaccions i no crear falsos positius. Es localitzaran aquestes mostres per cúmuls de taques negres en la imatge final.
Per a fer aquestes estudis en cultius cel·lulars s’han de simular les condicions de vida de les cèl·lules per a obtenir així òptims resultats. Aquestes similituds al cos humà han de ser tan a nivell d’alimentació com MRDD a nivell atmosfèric. Un exemple d’això pot ser l’O2, la temperatura i l’aliment que els hi arriba per la sang que en el cas dels estudis es subministra a través dels medis de cultiu. [Per a bacteris facultatius o per a bacteris anaeròbic se’ls hi extreu l’oxigen mitjançant unes gerres].
Els medis de cultius emprats poden estar o bé en estat líquid, sòlids o semi sòlids.
Sempre s’ha de controlar les mesures en que es treballen aquestes mostres per a no contaminar-les, sobretot amb els microorganismes que hi ha a l’atmosfera i per això és important treballar en campanes de flux laminar o altres condicions de màxima esterilitzar.
Per a organismes que tenen un creixement més lent ( com podrien ser les cèl·lules humanes), no s’utilitzen plaques de petri ja que la probabilitat d’infecció de la superfície de la mostra al obrir-les, és extremadament elevada. Per això, normalment els cultius cel·lulars es fan servir botelles de cultiu que tenen una boca molt petita per evitar al màxim la possibilitat de contaminació. A vegades també es treballa amb unes plaques que tenen pouets, les quals gràcies a aquestes concavitats es poden introduir els medis de cultius i les cèl·lules per a una posterior observació al microscopi òptic invertit.
Microscopi de contrast de fases (o Òptica Nomarski) Tinció amb blau de metilè.
Cèl·lules HeLa.
Quan en un cultiu cel·lular les cèl·lules ja estan molt juntes entre si, per a poder-les travessar en un altre medi per a que puguin continuar proliferant, normalment s’utilitza un enzim proteolític, lleugerament diluït, com ara la tripsina, per a que les cèl·lules es desenganxin entre si i es puguin agitar i es puguin separar fàcilment. Aquest procés es dur a terme en un petit instant de temps.
ESTUDIS DE TIPUS FISIOLÒGICS: Normalment s’utilitzen per a conèixer la ultraestructura, la composició o la localització d’una determinada molècula i a partir d’aquí esbrinar el funcionament d’aquesta.
Per a fer aquestes estudis normalment s’utilitzen micromanipuladors tals com microinjeccions, microelectrodes o microespiròmetres per a agilitzar la manipulació. A més també s’ha de subministrar diferents mesures a les cèl·lules per a mantenir-les vives com ara de respiració, de potencials de membrana o bé intercanvis gasosos d’una o vàries cèl·lules. Per a poder utilitzar tots aquests estris normalment s’utilitza MO invertits per a facilitar la manipulació.
Aquestes estudis són molt importants sobretot per a tots els processos de fecundació in vitro.
ICSI: Injecció intracitoplasmàtica d’espermatozous Aquestes microinjeccions que es van en diverses tècniques, però sobretot en la FIV, són possibles perquè les lesions es regeneren per si soles, és a dir, aquestes cèl·lules són capaces de revertir la pròpia membrana i reestructurar-se .
MRDD Composició d’un medi de cultiu típic per cèl·lules de mamífer Aminoàcids Vitamines Sals Diversos Arginina Biotina NaCl Glucosa Cistina Colina KCl Penicil·lina Glutamina Folat NaH3PO4 Estreptomicina Histidina Nicotinamida NaHCO3 Vermell fenol Isoleucina Pantotenat CaCl2 Sèrum sencer Leucina Piridoxal MgCl2 Lisina Tiamina Metionina Riboflavina Molts cops es subministren als medis de cultius altres components com per exemple antibiòtics per a prevenir la contaminació de la mostra.
Sovint també s’afegeix sèrum sencer (component líquid de la sang) ja que és la substància que conté tots els anticossos i hormones circulats pròpies d’una persona, el que fa que si aquest cultiu després s’ha de subministrar a un pacient, aquest no ho reconegui com a forani. Això es fa també per intentar imitar al màxim les condicions corporals.
En canvi, si s’han de fer estudis en cultius bacterians o de rutina, com que aquests no necessiten el sèrum de ningú en específic, s’utilitza el sèrum de cabra.
Un exemple d’aquests cultius cel·lulars són les cèl·lules mare pluripotents les quals, mitjançant estímuls, es poden diferenciar en una gran diversitat de cèl·lules diferents.
Fenilalanina Treonina Tripròfan Tirosina Valina Tècniques de localització microscòpica de molècules específiques: Histoquímica, citoquímica i immunocitoquímica.
Normalment són reaccions les quals se’ls hi afegeix un cert component i a mesura que s’augmenta la concentració d’aquest, va augmentant la reacció. Per tant en aquest cas es diferencia o reconeix aquestes molècules o reaccions mitjançant el color.
   Histoquímica: Estudi dels teixits químicament.
Citoquímica: Estudi de les cèl·lules químicament.
Immunocitoquímica: Quan es reconeixen un cert tipus de molècules gràcies al principi de reconeixement que tenim en immunologia. És a dir, es reconeix una molècula perquè s’ha generat un anticòs contra aquesta. (Depenent de si l’estudi es fa en cèl·lules – immunocitoquímica – o en teixits – immunohistoquímica – es denominarà d’una manera o un altra). Per exemple com ara el reconeixement d’una proteïna que actua com a antigen per un anticòs.
MRDD També s’utilitza una altra tècnica semblants a les anteriors però amb un fonament diferent, la qual permet saber el seguiment del que passa en cada pas d’un procés determinat al llarg del temps 3 14 32 mitjançant l’ús d’isòtops radioactius com ara H (triti), C, P..
 Autoradiografia: Tècnica que permet localitzar les macromolècules que han estat fixades amb isòtops radioactius al posar el tall del teixit en la foscor en contacte amb una emulsió fotogràfica, que queda impressionada per la radiació.
Normalment, quan es treballa amb 3 glúcids o lípids es treballa amb H o 14 C i quan es treballa amb ADN o 32 proteïnes s’utilitza el P.
Aquests isòtops dins del cos d’un organisme no es comporten com a tals sinó que s’uneixen directament a certes molècules i únicament emeten partícules radioactives.
Per dur a terme aquests experiments, el que es fa és subministrar a aquests organismes la solució de molècules marcades i cada cert temps o bé s’extreu una part del teixit en estudi i es fan talls per a poder observar les cèl·lules o bé es sacrifica un animal cada cert temps.
Per tant, cada cert temps, es mesura la resposta radioactiva per a poder localitzar on es troba en cada instant.
Per a poder observar aquest resposta però, s’ha de cultivar prèviament la mostra en una solució específica, una emulsió de Bromur de plata (AgBr) en la foscor, ja que aquesta en al foscor, quan rep l’estímul de la radiació, fa que la plata precipiti i per tant permet que els grànuls de planta indiquin la seva localització.
Aquesta tècnica a la vegada permet una semi quantificació ja que és possible contar cadascun dels grànuls de plata que precipiten en cadascuna de les estructures cel·lulars i així comparar-ho en el temps.
Experiment amb leucina tritiada amb cèl·lules del pàncrees que sintetitzen amilasa. La radioactivitat es detecta als 3’ en el RER; als 20’ en l’Aparell de Golgi; i als 90’ en els grànuls de zimogen que són secretats per l’Ap. de Golgi.
La gràfica està feta a partir de la quantitat de grànuls de plata que es trobava en els diferents orgànuls cel·lulars.
MRDD Amb aquesta tècnica s’ha permès esbrinar que durant l’embaràs, la mare sintetitza proteïnes que s’emmagatzemen dins dels òvuls de les filles.
Gangli sentinella: Permet fer el seguiment de diverses cèl·lules metastàsiques.
És una tècnica que consisteix en buscar el primer gangli limfàtic de drenatge directe des de el tumor, el qual per aquest motiu presenta la màxima probabilitat d’afectació per cèl·lules metastàsiques.
Per fer-ho, s’injecta un radio traçador (col·loide marcat amb tecneci 99, ja que té una vida molt curta i no és tòxic per a l’organisme) en el tumor o en una zona molt pròxima a aquest.
A més a més, és imprescindible realitzar una gammagrafia per a veure el lloc de drenatge i marcar-lo amb tinta sobre la pell per a posteriorment, i amb l’ajuda d’un detector de radiació gamma, poder extreure el gangli en el quiròfan.
Si al mirar el primer gangli, aquest no mostra cèl·lules metastàsiques, es mira el segon gangli per confirmar que el tumor no ha fet metàstasis. Si en el primer gangli sí que trobem cèl·lules metastàsiques, és molt probable que el tumor hagi fet metàstasi i per tant s’han de localitzar els altres òrgans diana on el càncer s’ha expandit.
Aquesta prova s’usa generalment en càncer de mama, de penis, de cap i de coll, de colon i de pell.
La radiologia nuclear és una subespecialitat de la radiologia en la qual s’introdueixen radioisòtops (compostos que contenen formes radioactives d’àtoms) en el cos amb el propòsit de prendre imatges, avaluar la funció de l’òrgan o localitzar tumors o malalties.
...