Tema 3: Bancos de cDNA 1/2 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 12
Fecha de subida 03/10/2017
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Tema 1 de Tecnología del DNA recombinante

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TEMA 3 BANCOS DE cDNA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
María Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología.
Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología BANCOS DE cDNA.
Un banco de cDNA es una colección de clones, cada uno de los cuales porta la secuencia complementaria correspondiente a un RNA maduro de una célula pasada a dsDNA. Donde antes teníamos uracilos, ahora tenemos timinas, y el resto de la secuencia es la misma. Se intenta que contengan todas las secuencias que están expresando en un tejido o tipo celular determinado. Es una representación de una población de mRNAs que se ha copiado a dsDNA y se ha clonado en un vector.
¿Utilidad? Una vez se ha clonado la secuencia codificante de un gen, esta puede servir para: - - Deducir las secuencias de las proteínas (el 99,99999999% de las secuencias de las proteínas se han determinado mediante bancos de Cdna, no secuenciando la proteína Una vez tenemos la secuencia del Cdna se puede utilizar su secuencia para expresar la proteína de forma recombinante (utilizar un huésped ya sea procariota o eucariota para expresar con un plásmido la secuencia de cDNA).
También nos permite obtener una sonda que nos puede permitir clonar u obtener el gen entero a partir de southern blot o de dna genómico.
ABUNDANCIA Y COMPLEJIDAD.
Abundancia relativa de cada una de las clases de mRNA polyA de hígado de ratón.
Es una tabla de frecuencias de diferentes tipos de RNA que hay en hígado de ratón. Son RNAs que se expresan mucho y RNAs que se expresan poco. Normalmente se expresan muy poco, a nivel de una copia por célula.
En un banco de cDNA, el número de clones que contienen una secuencia particular será proporcional a la abundancia del RNA concreto en la población de RNAs.
Si queremos capturar el cDNA de un gen que se expresa poco debemos saber cuántos clones independientes tiene el banco de cDNA, porque esto determinará en buena parte si, de este banco de cDNA, podemos capturar el gen que nos interesa o no.
¿Cuántos nos harán falta? Depende de lo que queramos encontrar, sabemos su abundancia y fijando la probabilidad del 99% utilizaremos la formula, sale la N que es el número de clones independientes que queremos obtener.
Para cDNAs que se expresan en 10 copias o menos nos hace falta 10^7-10^8 clones independientes para hacer un banco de cDNA.
1 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Clon independiente = N= descendencia que origina cada uno de los Lambda encapsidados a la hora de hacer el banco de cDNA, Cada uno de los Labdas que obtenemos será un clon independiente el uno del otro.
Si nosotros obtenemos entre 10^7 y 10^8 Lambdas, cada uno de ellos capaces de generar un clon independiente, podemos capturar bancos de cDNA que se expresen en poca abundancia.
ESQUEMA PARA LA CONSTRUCCIÓN DE UN BANCO DE cDNA.
¡¡Siempre se hace a partir de un tejido determinado, nunca a partir de un organismo!! 1. Siempre que el organismo tenga tejido se hace a partir de tejidos o de células concretas de este tejido, que contendrán los mRNAs, el mRNA o la proteína de cDNA de interés.
2. A partir del tejido se aisla el RNA total y se purifica el mRNA poli adenilado, ¿por qué? Porque la mayor parte de genes son genes que sufren splicing, que van a parar a ribosomas, y entonces a partir del RNA poliadenilado es una forma muy buena de capturar los RNAs que se han traducido. El 99,9999% de una célula es RNA ribosomal que no codifica nada más que para RNA ribosomal, por tanto, aislando el poliadenilado aislamos el que codifica para proteínas.
(El paso 3 y 4 no lo dijo) 3. Síntesis del cDNA: primera y segunda cadena.
4. Preparación del Cdna para el clonaje (metilación, reparación de extremos, adaptadores…) 5. Al final se clonan los cDNAs con un fago lamda.
6. Habitualmente, dspues se hace un “screening”, determinar qué clones nos interesan del banco del cDNA.
PREPARACIÓN DEL RNA.
Esto no es una tontería, de hecho, es la parte más complicada. La preparación del RNA para determinar mediante secuenciación masiva la secuencia del cDNA es la parte más critica porque todos los tejidos tienen ribonucleasa, la presencia de RNasas es crítica. Así pues, el problema principal es que las RNasas son ubicuas.
Si hacemos bien extracción de DNA de un tejido acabamos obteniendo porque si no se quitan del medio las ribonucleasas, lo degradan y al final lo que obtenemos es miseria en cantidad y en cuanto a calidad.
Entonces, ¿qué se hace? Lo primero de todo, raramente partimos de tejido fresco, partimos de tejido congelado en nitrógeno líquido. El paso de disgregación (trituración) del tejido se hace aprovechando que lo tenemos congelado en nitrógeno líquido, vamos picando hasta que quedan reducidos a trozos. Como lo tenemos congelado, las ribonucleasas ahí no trabajan.
Una vez triturado tratamos inmediatamente con la famosa mezcla de isotiocianato de guanidinio y fenol, es un agente desnaturalizante y, entonces, lisa las células y al mismo tiempo impide que las ribonucleasas degraden el RNA, las inactiva.
2 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Una vez ya tenemos el RNA total obtenido se elimina todo el mRNA que no sea poli-adenilado, es decir, se purifica el mRNA poliadenilado. Se hace utilizando una columna de oligo de T en sepharosa, el mRNA poliadenilado se eluye con un amortiguador (amortidor) de muy baja fuerza iónica.
Al tanto, porque algunos genes que traducen a proteínas (ej.
Histonas) no están poli-adenilados.
Imagen: Las bandas que parecen más intensas son las correspondientes a RNA ribosomal y lo de la derecha es el RNA poli adenilado. Esta diapo no es muy buena, en el RNA total las únicas bandas que se ven son las de RNA ribosomal, y el poli adenilado (estaría en las bandas de ribosomal) prácticamente es invisible. Por si algún día lo hacemos.
SÍNTESIS DEL CDNA MÉTODO “HOMOPOLIMERIC TAILING”.
3 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Hay un primer paso esencial a la hora de construir la molécula de cDNA y es utilizar una transcriptasa inversa para hacer la cadena complementaria en todos los RNAs poliadenilados que hemos aislado mediante el método comentado anteriormente (si se trata de un banco de cDNA).
- Sintetizar la primera cadena: Sólo hay un método para sintetizar la primera cadena y es coger todos los RNAs y colocar un primer, que será complementario a la cola de poliadeninas que llevan la mayor parte de RNAs mensajeros.
Se hace provechando este primer de oligo de T que porta ligada a la secuencia de un adaptador.
(*) Primer adaptador: es una cadena sencilla que suministramos durante el proceso de clonaje y se sintetiza en su complementaria. Al adaptador también se le llama linker. Es una única molécula oligonucleotídica.
No es el concepto de adaptador clásico que hemos comentado unas clases atrás, quiere que nos quedemos con este concepto de adaptador.
Adaptador = cualquier pareja de moléculas (¡dos!) oligonucleotídicas que forman directamente un extremo cohesivo con sus secuencias complementarias.
(*) Una vez sintetizada su complementaria para generar el extremo cohesivo hace falta el corte por un enzima de restricción, ¡¡siempre!! Para el adaptador clásico también.
Este oligo de T va ligado a una secuencia que tiene la diana de enzimas de restricción. Para facilitar el clonaje del banco de cDNA normalmente utilizamos enzimas de restricción ricas en GC porque los genomas eucariotas son ricos en AT, como por ejemplo: Sal I (6 nts) y Not I (8 nts).
Ponemos enzimas de corte poco frecuente, porque está en el primer adaptador y hace falta que se corte con sal o not. Si hay una diana dentro del producto de reacción el cDNA quedará cortado.
Aún así, se puede cortar el Cdna. Así pues, suministramos dCTP* = desoxicitidina METILADA para tal de evitar el problema.
Por tanto, aunque usemos enzimas de corte poco frecuente (sal y not) un truco es que, durante el momento en que se hace esa primera cadena, suministrar los 3 nucleótidos normales y el cuarto modificado químicamente.
A pesar de estar metilada se aparea perfectamente con las Gs e introduce tantas Gs metiladas como Cs tenga la primera cadena del cDNA. En conclusión, nos quedará hemimetilado por Sal y por Not, entonces cuando generemos los extremos cohesivos esta diana no será cortada.
¿Por qué no utilizamos una metilasa? Deja la pregunta en el aire.
4 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Utilizaremos también una transcriptasa inversa. Tenemos 3 posibilidades: 1. AMV: procedencia aviat 2. MMULV: procedencia murina. Se utiliza para secuenciar DNA de forma masiva.
3. Tth: Procedencia variable. Es una DNA polimerasa normal que viene de termus thermophilus, lo único que en presencia de manganeso actúa de transcriptasa inversa.
En principio, la que se utiliza es la de procedencia de murina (MMULV). Se utilizan versiones modificadas (se modifica la secuencia de algún aminoácido), tanto por ingeniería genética o a purificadas a partir de E. Coli, que las produce de forma recombinante (ninguna transcriptasa inversa se modifica directamente del huésped). El objetivo de la modificación es eliminar actividades RNAsas que puedan aparecer.
Para hacer bancos de cDNA y para reacciones de ultrasecuenciación de forma masiva de DNA se utiliza la de procedencia murina.
Solo en el caso de que nos interese moldes con cDNAs muy largos (un RNA de 7 kb maduro, que es enorme) podemos utilizar la tth. ¿Ventaja? Es un poco más procesiva que las otras dos.
Entonces, la tth cuando utilizamos moldes largos está recomendada. Ya sea por alguno de estos tres, ya hemos hecho la primera cadena, ya tenemos cDNA.
Resumen: usar oligo de T + adaptador + enzima de restricción corte poco frecuente + Dctp* + transcriptasa inversa.
Síntesis de la segunda cadena de cDNA: Hay dos métodos diferentes: 1. Homopolímero: permite obtener cDNAs con el 5’ más intacto (con más exactitud) 2. Autoprimado: puede ser que sea más efectiva pero el extremo 5’ puede estar modificado.
En vez de eliminar el RNA lo que se hace es incubar el híbrido de cDNA con mRNA + RNAsa H, así se introducen nicks en el RNA. ¡OJO! La RNAsa H introduce nicks cuando y sólo cuando este RNA hace cadena con un DNA normal.
Se utiliza la DNA pol I de E. coli y se hace una síntesis de reemplazo (Nick translation), queda un 3’ donde poner nucleótidos, y la DNA polimerasa I (con actividad nick translation) hace la síntesis de la cadena.
Problema: Al lado 5’ le pasa lo mismo que a los fragmentos de Ogazaki, actúa de primer, pero queda RNA, con lo cual se acaba perdiendo porque el RNA no se puede clonar y no se puede recuperar en forma de DNA.
La solución para que no se pierda es eliminar completamente el RNA por temperatura en vez de nickarlo, es el llamado método “homopolimeric tailing: 1. Una vez hemos hecho esto, tenemos una molécula de DNA que tiene un extremo 5’ y un extremo 3’. Se elimina el RNA y lo adaptadores no usados.
2. Una vez eliminamos el RNA tenemos una colección de moléculas donde hay 5’ con el oligo de T primer adaptador y un 3’ que es lo que ha dejado sintetizado la transcriptasa inversa. Se comienza por aquí.
5 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología 3. Por este 3’ añadimos una cola de oligo de G, es decir, añadimos una cola de homopolímero sobre el extremo 3’ del cDNA.
4. Añadimos también terminal transferasa, pues esta enzima puede incorporar nucleótidos sin un molde que copiar. Esta cola es para poner un primer en la segunda cadena.
5. “Primaremos” la segunda cadena con un primer adaptador 2 de oligo de C complementaria a la oligo de G que acabamos de poner. Esta cola de oligo de G es para poder primar la segunda cadena. Por tanto, el primer adaptador 2 está en el extremo 3’.
6. Hibridarán las C’s con las G’s y se hace la segunda cadena con el enzima Klenow (pol K).
(*) Ponemos las Gs para tener una secuencia conocida donde después colocar el primer primer adaptador. Entonces, utilizando este primer adaptador que hibridará sobre la cola de oligo de G haremos la segunda cadena.
Cuando hacemos la segunda cadena estaremos copiando la secuencia correspondiente al primer adaptador uno. Y cuando hagamos la segunda cadena también estaremos copiando la cadena complementaria al primer adaptador 2.
El adaptador, por ejemplo, sería la diana de restricción sal y not.
El adaptador 2 está en el extremo 3’.
(*) Una vez hemos hecho las dos cadenas, tenemos las dianas de restricción en forma de doble cadena y no queda nada más que poner las dos enzimas de restricción para generar los extremos cohesivos y ya podemos clonar.
Primer adaptador 2 es la secuencia correspondiente a sal I y primer adaptador dos es la secuencia correspondiente a Not. Una vez tienes las dos dianas en forma de doble cadena son cortables con diana de restricción 2 generando extremos cohesivos.
Vuelta a explicar.
El método del autoprimado se basa en no eliminar el RNA, con la RNasa H hacemos nicks, conseguimos tener un extremo 3’ sobre el cual la DNA polimerasa de E. Coli puede añadir nucleótidos, y sólo esta polimerasa, porque hace síntesis de reemplazo Nick translation.
Si sobre los nicks se coloca la DNA pol I por Nick translation tenemos hecha la segunda cadena.
El problema es que perdemos el extremo 5’ del RNA, es el mismo problema de los fragmentos de Ogazaki y es el RNA que nos servía de cebador para hacer la síntesis de reemplazo.
No queremos que nos pase esto. Entonces en lugar de hacer autoprimado aplicamos el método de homopolímero para hacer la segunda cadena. Se basa en eliminar completamente el RNA.
Entonces, introducimos una secuencia de oligo de G en el extremo 3’ de la primera cadena del cDNA.
Colocamos aquí el primer adaptador 2 y con el enzima Klenow sintetizamos la segunda cadena completa. El resto se ha entendido antes.
6 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología ¿Qué clonaremos? En el lado 5’ del cDNA, en una secuencia muuuuuuy rica en C-G, esto ahora lo colocaremos en un vector para tal de facilitar el clonaje, la secuenciación y la expresión del cDNA (transcripción y traducción).
Cuando la RNA polimerasa se encuentra con secuencias de este estilo, muy ricas en C-G, puede tener problemas para alargar la cadena de RNA que está sintetizando, entonces, hace una pausa y se frena, le cuesta muchiiiiiiisimo, por tanto tampoco es un método perfecto, pero para la síntesis de cDNA full lenght está bien.
Eventualmente, la mitad de la gente hace autoprimado y la otra mitad homopolímero. Ambos se basan en los mismo, en hacer la primera cadena de cDNA con una transcriptasa inversa y difieren en hacer la segunda.
LIGACIÓN CON EL VECTOR Y ENCAPSIDACIÓN IN VITRO.
Ya tenemos toda una colección de cDNAs, no hacemos uno único, con una sola reacción tenemos todos los cDNAs correspondientes al RNA que tenía un tejido concreto.
Ahora hacemos la ligación con el vector (eventualmente pre-digeridos). El vector más habitual ahora es un Lambda fago, es decir, se utiliza su maquinaria para usarlo luego en E. Coli. El clonaje es direccional.
La zona del comienzo de cualquier gen, si hemos colocado la diana Sal el extremo 5’ de cada cDNA esta flanqueado por una diana sal y el extremo 3’ de cada cDNA esta flanqueado por una diana not.
El cDNA nos quedará orientado correctamente respecto al promotor que queramos, controlamos la orientación en que se pone este cDNA.
Es decir, al ser clonaje direccional la presencia de los CG de las dianas de restricción de sal y not y sabemos dónde está cada diana.
Como es direccional podemos utilizar Lambda con not y sal. Cuando hacemos el clonaje de todos los cDNAs hacemos la reacción de encapsidación in vitro.
Esta reacción ¿por qué la hacemos? Porque tenemos una colección de cDNAs que para tener múltiples copias los hemos distribuido en E. Coli y utilizaremos la maquinaria de Lambda para introducir todo este banco de cDNA de E. Coli y generar numerosas copias de cDNA.
7 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología La maquinaria de Lambda es la maquinaria más potente en la naturaleza. Se encuentra en la cubierta de landa.
Una vez hemos insertado mediante enzimas de restricción y ligasas nuestros cDNAs, mezclamos en dos tubos: 1. Un tubo con los genes de la cabeza 2. El otro tubo los de la cola (hablando de la cápside de landa).
Si mezclamos el tubo 1 con el 2 y tiene lugar la reacción de encapsidación.
Es decir, necesitamos un Lambda que produzca las proteínas de la cabeza y de la cola, pero que no encapside porque ha de producir las proteínas de la cápside, pero no ha de encapsidar.
Por tanto, tenemos dos mutantes diferentes: uno tiene las proteínas de la cabeza, pero no de la cola y otro al revés.
Entonces, no pueden encapsidar, los mantenemos por lisogenia.
Cuando mezclamos las dos sí pueden encapsidar (inducimos ciclo lítico).
Lambda porta las regiones cos que son esenciales para que el DNA del Lambda intercicle.
Además, así creamos los concatámeros necesarios para que los Lambda puedan encapsidar.
Después de encapsidar los tenemos a punto de entrar en E. Coli. Hay muchos laboratorios que en vez de hacer eso compran hechos los bancos de cdna hechos, pero son muy caros. IMP!! CosL se puede unir a cosR, pero no L con L: será direccional.
Desventaja: los concatámeros son extremadamente grandes.
8 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología SCREENING DE UN BANCO DE CDNA POR HIBRIDACIÓN CON SONDA.
Una vez encapsulado lo tenemos a punto de entrar en E. Coli.
¿Nuestro objetivo? Obtener el gen humano de la dihidrofolato reductasa. Capturar el cDNA de este gen de la hidrofolato reductasa (DHFR) con un banco de cDNA de hígado humano que acabamos de hacer/comprar.
1. Este banco de cDNA (genoteca) lo plaqueamos en una placa de Petri- E. Coli.
2. Infectados con Lambda. La ventaja de Lambda es que el 80% de su DNA queda sin encapsidar, replica mucho más DNA que el que puede encapsidar. Las cápsides contienen una concentración de DNA de Lambda espectacular, más que cuando hacemos un Southern Blot. La concentración de DNA libre es espectacular. El hecho de que sea tan grande es una de las razones por las que bancos de DNA genómico se hagan con Lambda.
3. Lo primero que hacemos sobre esta placa de Petri es poner un filtro de nitrocelulosa o nylon que enganchará el DNA desnudo que hay sobre la calva. De esta forma tendremos una réplica de lo que había en las calvas.
4. Para neutralizar el DNA simplemente tratamos la nitrocuelulosa con hidróxido de sodio (NaOH).
5. Hibridamos la sonda marcada (que podía venir de ratón, cerdo o lo que sea) para capturar el gen (que no se conocía) de DNA huamano. Hibridarán los clones que tengan el cDNA de la hidrofolato reductasa.
9 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología 6. Hacemos una autoradiografía.
La mayor parte del DNA aun continua en la placa porque había muchísisma cantidad. Con una pipeta Pasteur pinchamos la calva de Lambda + NaCl que dio positivo, la pasamos a un Ependorf y ya tenemos el clon de Lambda que lleva dentro el gen de la dihidrofolato reductasa humana.
¿Cómo hemos de poner la autoradiografía? La autoradiografia es el espejo de lo que hay en el filtro y el filtro es el espejo de lo que hay en la Petri, entonces el espejo del espejo es la placa de Petri original.
MANERAS DE ELIMINAR OLIGONUCLEÓTIDOS QUE NO SE HAN INCORPORADO.
Tenemos dos maneras: 1. PRECIPTACIÓN CON ETANOL.
- Es la menos eficiente pero la más fácil.
Funciona con 1 o 2 microgramos de DNA o 1 o 2 kb.
Nucleótidos y oligonucleótidos precipitan muy ineficientemente en etanol.
Si tiene 300 bases, no hace falta ni probar ya que se pierde todo.
2. MEMBRANAS DE BOROSILICATO.
- Funciona cuando tenemos cantidades pequeñas, tipo 300 bases.
2.1. Tenemos un cilindro de plástico de 1 cm de diámetro, con membrana de borosilicato al fondo.
2.2. En la membrana de borosilicato los ácidos nucleicos se enganchan muy ineficientemente sobre estas membranas.
A) Si pasan de 200 microlitros, se enganchan muy bien los DNAs.
B) Se enganchan muy bien sobre los Ependorfs.
2.3. Después se puede lavar con agua y etanol.
2.4. Eluir los nanogramos con agua destilada.
SCREENING DE UN BANCO DE cDNA MEDIANTE ANTICUERPOS.
Es la segunda manera de detectar un clon positivo en un banco de cDNA. En lugar de mirar la identidad de secuencia, detectamos el producto de cadena polipeptídica utilizando una proteína que se expresa con este cDNA que hemos clonado a partir de un vector Lambda.
El inserto del DNA se clona si se sintetiza en el marco de lectura que toca, hay un tercio de los cDNAs que pueden expresar su producto polipeptídico con el lacZ.
10 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología 1. Coger la placa de Petri y replicar.
2. Enganchar la réplica con 𝛾𝑔𝑡11 o 𝑍𝐴𝑃.
3. Film de nitrocelulosa + estimulante de la expresión y anticuerpo primario del gen de interés.
Si aislamos DHFR y lo inyectamos en un conejo, tendremos anticuerpos anti DHFR.
4. A las proteínas que haya en la calva se le enganchará el anticuerpo.
5. Se añade un anticuerpo secundario, un anti conejo.
Se obtiene inyectando anticuerpos de conejo a otro animal. Como los de conejo son diferentes, con una fosfatasa alcalina el secundario se une al primario y genera un cambio de color en la calva.
6. Se echa formaldehido para que las enzimas no pierdan la función.
7. Se quita la nitrocelulosa, entonces el anticuerpo va donde va la enzima.
Es como un Western Blot, el anticuerpo reconoce la proteina y este será reconocido por otro anticuerpo con un fluoróforo y lo podemos ver.
Para evitar que detecte dos proteínas, normalmente se hacen dos réplicas con anticuerpo primario antes de colocarlo con la DHFR y la otra con 11 ...

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