Bloc III B (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2017
Páginas 7
Fecha de subida 29/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 15. MECANISME DE TRANSFERÈNCIA HORITZONTAL D’INFORMACIÓ GENÈTICA  Transformació: És el primer mecanisme que es va descobrir, Griffith al 1928. Treballava amb un bacteri (S. pneumoniae) que és grampositiu, feia experiments amb els ratolins per veure la capacitat de causar malalties en aquests animals i veia que sempre es formaven dues colònies: unes llises i mucoses (tenien càpsula) i altres rugoses, que provenien del mateix bacteri. Agafava els ratolins, els infectava amb colònies llises i tots morien; si els infectava amb les colònies rugoses sobrevivien.
Va infectar un altre grup de ratolins amb cèl·lules rugoses mortes per calor i sobrevivien, però si els infectava amb les cèl·lules llises mortes per calor i les rugoses els ratolins morien. Es dedueix que les llises mortes tenien algun producte que havia produït un canvi en les rugoses de manera que ara podien matar. No va deduir què era el que modificava les cèl·lules però li va anomenar principi transformant. 16 anys més tard Avery i altres van identificar el principi transformat que era el DNA.
Van extreure el DNA de les cèl·lules capsulades i el van barrejar amb el de cèl·lules no capsulades. Van dividir la barreja en dos cultius diferents, un al qual hi van afegir DNAsa i l’altre al qual hi van afegir proteases, per veure si el principi transformant era DNA o altres proteïnes. Quan s’afegia DNAsa als ratolins no passava res però als que eren tractats amb proteases sí que morien i s’havia produït un canvi en la població. Així quedava clar que el principi transformant era el DNA.
Aquest procés no és exclusiu d’aquest bacteri, hi ha molts altres que el fan. Els que el poden fer de manera natural és perquè al seu cromosoma hi ha gens que codifiquen per proteïnes que participen en la transformació, tenen diferents funcions però principalment fan que el bacteri adeqüi els seus embolcalls de manera que el DNA hi pugui entrar. Quan el bacteri es torna permeable a l’entrada del DNA es diu que ha assolit un estat de competència. Aviat es va veure que hi havia dos models diferents en el procés de transformació: - Tipus S. pneumoniae: (gram +) assoleix l’estat de competència gràcies a una proteïna que el MO elabora i excreta al medi, és una feromona anomenada factor de competència, així la paret es torna permeable. Es sintetitza sempre però només quan s’arriba a una certa concentració del factor és quan es dóna l’estat de competència, coincideix amb l’etapa logarítmica de creixement del bacteri.
Primer el DNA del medi s’uneix a la superfície del bacteri, a una proteïna concreta que el fixa, una de les cadenes del DNA es trenca i entra a l’interior, se li uneixen unes proteïnes per protegir el DNA dels sistemes de restricció de la cèl·lula. Si hi ha una certa homologia el DNA es recombinarà amb el cromosoma i s’hi incorporarà, perquè la incorporació suposi un canvi el DNA ha de ser diferent però no gaire perquè hi hagi un bon aparellament de bases (distorsions) i evitar els sistemes SOS de reparació, tot i que si es replica abans de que actuï SOS sí que produirà un canvi important.
- Tipus Haemophilus influenzae: (gram -) no es sintetitza factor de competència, l’estat de competència s’aconsegueix quan el bacteri es fa créixer en medis rics dissenyats especialment per assolir aquest estat. Perquè el DNA pugui entrar a la cèl·lula ha de presentar una certa homologia amb el del bacteri, si és molt diferent no entrarà.
Microbiologia I Silvia Expósito Quan les cèl·lules es tornen competents presenten a la membrana externa unes vesícules que s’anomenen blebs (10 per cèl·lula) i presenten a l’interior una proteïna a la que s’unirà el DNA que entri a la cèl·lula molt específicament: la proteïna només uneix DNA (lineal o circular) que tingui una determinada seqüència de bases. Quan s’ha unit el DNA la vesícula s’introdueix a l’interior formant un transformosoma que conté el DNA unit a la proteïna, així es mantindrà durant el temps necessari fins que es trenqui una de les cadenes i s’incorpori per recombinació al cromosoma. La protecció enfront als sistemes de restricció en aquest cas és la vesícula. El DNA entra en forma de cadena doble i només es trenca que s’ha de recombinar.
Quan es produeix un procés infecciós i s’administra un antibiòtic, a part de destruir l’agent infecciós també eliminem cèl·lules de la flora bacteriana del nostre cos llavors s’allibera gran quantitat de DNA bacterià, així els bacteris que quedin vius poden captar aquest DNA i modificar la funció de gens importants. Això dificulta el procés d’escollir el tractament adequat. La transformació natural és important sobretot en bacteris patògens, les soques es poden tornar resistents.
Hi ha alguns bacteris que no poden fer el procés de transformació natural perquè no tenen els gens que es requereixen, alguns d’aquests al laboratori poden adquirir aquests gens per fer la transformació: transformació artificial. Consisteix en tractar les cèl·lules de manera que es tornin permeables al pas de DNA per incorporar-lo. Diferents mecanismes, en E.coli consisteix en tractar els embolcalls amb EDTA per desestabilitzar la membrana, s’afegeix un lisoenzim per desestabilitzar la capa de mureïna i ions magnesi que estabilitzen la cèl·lula.
Actualment s’utilitza la electroporació que consisteix en sotmetre al cultiu de bacteris a un impuls elèctric d’alt voltatge per uns segons, es produeixen porus a la membrana del bacteri. S’utilitza també en animals superiors i plantes per obtenir transgènics amb resistència a determinats insectes per exemple.
Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 16. CONJUGACIÓ BACTERIANA Es va descobrir en E.coli quan intentaven veure si tenia un procés de transformació natural. Van agafar dues poblacions: - Població A: met- bio- thr+ leu+ thi+ (creix en medi mínim amb metionina i biotina) Població B: met+ bio+ thr- leu- thi- (creix en medi mínim amb treonina, leucina i timina) Si fem créixer A en plaques de medi mínim no creixerà i B tampoc. Van barrejar aquestes dues poblacions en un únic cultiu per veure si es produïa la transformació, recuperaven bacteris que havien intercanviat els gens de manera que hi hagués un bacteri capaç de sintetitzar tots els aminoàcids; això ho comprovaven fent créixer la barreja en plaques de medi mínim on hi hauria creixement si s’hagués produït la recombinació.
Quan van analitzar les colònies van veure que havien recuperat la capacitat de sintetitzar tots els aminoàcids, calia comprovar si el mecanisme era la transformació repetint l’experiment però afegint al tub la DNAsa. Si s’ha donat la transformació la DNAsa impedirà el canvi, van veure que la recombinació es continuava donant, per tant, no era mitjançant transformació, sinó que era un procés diferent en el que l’intercanvi de material genètic implicava un contacte directe entre les cèl·lules.
Van agafar un tub en forma de U on a la part central hi havia un filtre que permetia el pas de molècules però no que es mesclessin les cèl·lules. Facilitaven l’intercanvi entre un braç i l’altre de molècules fent passar aire estèril per un dels dos, s’analitzava periòdicament la població de cada banda del tub. Es va veure que en cap cas es donava creixement en plaques de medi mínim, això corroborava que calia un contacte directe entre les cèl·lules per fer l’intercanvi genètic, procés anomenat conjugació.
Inicialment es va pensar que els dos DNA s’havien fusionat formant un zigot com en eucariotes, però es va comprovar que això no era cert, sinó que en una població hi havia diferents comportaments cel·lulars: unes cèl·lules actuaven com a donadores de DNA i altres com a acceptores.
Les donadores presentaven a més del seu cromosoma un plasmidi F (fertilitat) de tipus conjugatiu, perquè tenen una sèrie de gens que codifiquen per la seva pròpia transferència d’una cèl·lula a una altra; el plasmidi té seqüències d’inserció que permeten que amb una certa freqüència es pugui incorporar al cromosoma de la cèl·lula.
Un dels gens implicats en la transferència codifica per la formació del pili sexual. Totes les cèl·lules que presentin el plasmidi F també tindran a la superfície el pili sexual.
Tindrem cèl·lules F+ i F-, quan en un cultiu de bacteris una F+ està a prop d’una F- es dóna la conjugació. La F+ s’unirà a la F- mitjançant el pili sexual de la superfície, concretament a una de les proteïnes Omp A de la membrana externa. Tindrem les dues cèl·lules unides entre sí pel canal de pas i es transferirà el plasmidi de la F+ a la F-, és un procés de transferència replicativa perquè a mida que el plasmidi va passant cap a la cèl·lula F- es va replicant també a la F+, de manera que al final del procés totes dues cèl·lules presentaran un plasmidi igual.
El procés comença amb la unió de les dues cèl·lules, al plasmidi s’obre una de les cadenes per un punt anomenat ori-T (origen de transferència) i comença a passar cap a la cèl·lula F-, a mida que va passant es replica. La cadena que s’ha separat passarà pel pili sexual fins la F-, quan ha passat tot sencer es tanca per una lligasa. El resultat final és un plasmidi a F+ i un a F- que ara també serà F+.
Microbiologia I Silvia Expósito Amb una certa freqüència es va veure que es podien transferir gens cromosòmics a part dels plasmidis, és possible perquè el plasmidi F té unes seqüències d’inserció que també es troben al cromosoma de la cèl·lula, permetent que el plasmidi s’hi uneixi i quedi integrat al cromosoma cel·lular; s’anomenen cèl·lules HFR (alta freqüència de recombinació). Les HFR es comporten com F+ i si es troben a prop d’una F- passarà el mateix, s’uniran pel pili sexual i comença la conjugació, quan ja hagi passat tot el plasmidi el procés no s’atura i continuen passant gens cromosòmics fins que es trenqui el pont conjugatiu, és molt difícil que passi tot el cromosoma.
La capacitat de passar gens cromosòmics es va utilitzar per elaborar els primers mapes genètics de les espècies bacterianes, consisteix en situar dins del cromosoma l’ordre en que es troben els diferents gens. Agafaven un HFR i un F-, els deixaven en contacte, trencaven el pont conjugatiu i miraven quins gens cromosòmics havien passat a la cèl·lula receptora, d’aquesta manera veien quants gens passaven cada cert temps per ordenar-los després. És per això que ara la posició relativa dels gens al cromosoma s’expressa en minuts.
Trobem encara més tipus conjugatius a part de F+, F- i HFR: - A les HFR a vegades es produeix una desintegració del plasmidi donant lloc a unes cèl·lules F+ normals. També pot ser que com a conseqüència de la desintegració, part del plasmidi quedi unit al cromosoma i el plasmidi separat tindrà un tros de gens cromosòmics, la cèl·lula serà F’ PRIMÀRIA i serà una F+. Al procés de conjugació, la que era Fara tindrà una regió cromosòmica repetida al plasmidi i s’anomenarà F’ SECUNDÀRIA.
La població d’E.coli és una barreja de totes les formes conjugatives.
El primer que es va fer era descobrir si el plasmidi F era exclusiu d’E.coli o es podia passar a altres espècies bacterianes. Es va veure que sí que podia passar a altres però havien de ser espècies properes, que pertanyin a la mateixa família (Enterobacteriaceae). Es va veure que especialment entre gramnegatius sí que era freqüent trobar plasmidis similars, sobretot a pseudomones es va veure que hi havia diferents plasmidis i també cèl·lules HFR.
En grampositius, amb menys freqüència també es donava el procés de conjugació però amb un procés una mica diferent. Els plasmidis de grampositius (S. taecalis) no codifiquen per la formació del pili sexual, però quan una cèl·lula que té el plasmidi es troba a prop d’una que no el té es formen uns agregats cel·lulars pels que es pot transmetre el plasmidi. El contacte es produeix perquè a la superfície de totes les cèl·lules (amb plasmidi i sense) hi ha una substància d’unió que interacciona amb la substància d’agregació trobada només a la superfície de les cèl·lules que tenen el plasmidi i només és present quan estan properes a una cèl·lula que en no té.
Les cèl·lules que no tenen plasmidi tenen uns gens cromosòmics que codifiquen per una feromona que s’excreta al medi i actua com a senyal per les cèl·lules amb plasmidi perquè comenci la síntesi de la substància d’agregació que està codificada per gens plasmídics, així es formen els agregats cel·lulars i passa el plasmidi d’una cèl·lula a l’altra. Les cèl·lules amb plasmidi també tenen els gens que codifiquen per la feromona però no la produeixen perquè estan inactivats per un gen que es troba al plasmidi.
 Plasmidis: Són molècules de DNA que es troben a les cèl·lules i són independents del cromosoma cel·lular, normalment són de cadena doble, circular i tancada tot i que també poden tenir una forma lineal. Codifiquen sempre per diferents funcions prescindibles per la cèl·lula, de manera que si el plasmidi es perd la cèl·lula pot continuar creixent però perd propietats.
Microbiologia I Silvia Expósito Tots els plasmidis tenen capacitat d’autoreplicació gràcies a una sèrie de gens que presenten, i a més alguns tenen gens necessaris per codificar la seva transferència a altres cèl·lules i s’anomenen plasmidis conjugatius. També hi ha cèl·lules amb dos tipus diferents de plasmidis, un sense la capacitat de transferir-se i l’altre sí, si coincideixen aquests plasmidis es pot donar una transferència dels dos; si només hi ha el que no es pot transferir mai podrà passar a una altra cèl·lula.
Quan la cèl·lula presenta un plasmidi relativament gran normalment tenim una única còpia o dues com a màxim, si són plasmidis petits són multicòpia (fins a 10 iguals). El número de còpies de plasmidis a la cèl·lula està regulat pel mecanisme de RNA-antisentit, i el nombre de còpies pot ser important perquè els plasmidis s’utilitzen com a vectors de clonatge i per assegurar l’expressió d’aquest gen afegit és millor utilitzar cèl·lules amb multicòpia de plasmidis.
Una mateixa cèl·lula pot tenir plasmidis diferents sempre i quan no pertanyin al mateix grup d’incompatibilitat, és a dir, que codifiquin per funcions similars. Els plasmidis més importants són: - Plasmidis R: codifiquen per la resistència de diferents antibiòtics i poden incorporar-ne d’altres degut a que les resistències van incorporades en tranfusons. Tenen una gran importància clínica perquè també són conjugatius i poden passar la resistència a altres bacteris. Són el factor més important en l’augment de les resistències a antibiòtics d’ara.
- Plasmidis COL: codifiquen per la producció d’unes proteïnes anomenades bacteriocines capaces de formar porus als embolcalls d’altres bacteris causant així el buidat cel·lular i lisi de les cèl·lules, eliminen competidors.
- Plasmidis degradatius: participen en processos de degradació de substàncies recalcitrants. Hi ha diferents tipus, alguns acumulen molècules clorades d’insecticides, productes derivats de la indústria del petroli... es poden eliminar només amb bacteris que portin aquests plasmidis.
- Plasmidis de resistència a metalls pesants: urani, crom... productes que s’acumulen com a conseqüència d’explotació minera i són molt tòxics.
- Plasmidis de producció de toxines i altres factors de virulència: com pilis, adenines...
E.coli té algunes soques que poden adquirir factors de virulència gràcies a plasmidis com les enterotoxigèniques i produeixen una toxina sensible a la calor i una resistent a la calor, així produeixen infeccions al tracte gastrointestinal, també han de sintetitzar un pili especial per infectar.
- Altres Microbiologia I Silvia Expósito TEMA 17. TRANSDUCCIÓ Es va veure en Salmonella, quan es volia comprovar la conjugació. Es va mirar si es produïa l'intercanvi en dues poblacions de Salmonella, van veure que sí però que era més freqüent que la conjugació. Per comprovar-ho van agafar poblacions amb auxotròfies complementàries i van fer l'experiment amb el tub en forma de U de manera que hi havia recombinació, però si es donava per aquest tub no era possible que fos conjugació.
Analitzant van veure que una població de les dues que es feia l'experiment tenia un bacteriòfag integrat i l'intercanvi es feia gràcies al bacteriòfag que podia travessar a l'altra banda del tub per la membrana i que arrossegava el material genètic d'una cèl·lula a l'altre. A aquest fenomen el van anomenar transducció i al bacteriòfag bacteriòfag transductor.
Igual que en altres mecanismes, van veure que hi havia dos processos de transducció : especialitzada (restringida) i generalitzada. La traducció especialitzada la fan només els bacteriòfags que tenen capacitat per integrar-se al cromosoma de la cèl·lula, són els fags lisogènics i els gens que transdueixen són els que hi ha al costat del lloc on s'ha integrat el fag.
 Transducció especialitzada: Un exemple és el del fag λ que infecta E. Coli, introdueix el seu àcid nucleic en forma lineal i si actua com a lisogènic s'integrarà per recombinació al cromosoma degut a regions específiques que té el cromosoma per unir (regions de bases complementàries a una regió del bacteriòfag).
Quan entra material genètic del fag λ (lineal), té el lloc d'unió al cromosoma en un lloc de mal accés i no s'hi pot unir; primer cal que el DNA del fag es circularitzi (cosa que és possible perquè als extrems del seu DNA hi ha les regions COS d'extrems cohesius complementaris) i un cop circular ja es pot recombinar i integrar-se al cromosoma cel·lular.
En E. Coli, el lloc específic d'unió del fag λ està entre dos gens del cromosoma: el de la biotina i el de la galactosa i les cèl·lules filles tindran totes en el seu cromosoma el DNA del fag λ ja que la cèl·lula el tracta com DNA propi i seguirà així fins que per alguna circumstància el fag es desenganxi i comenci el procés de replicació, el comportament de bacteriòfag lític. Durant aquest comportament es van fent còpies del DNA del fag i de la càpsida fins a trencar la cèl·lula i alliberar-se els nous fags.
Com s'origina el fag transductor? Es dóna al desenganxar-se el fag del DNA cel·lular, quan no ho fa exactament pel mateix lloc per on s'havia unit de manera que s'emporta un tros de DNA cel·lular i pot agafar el gen de la biotina o de la galactosa. També podria passar que s'emportés ambdós gens i llavors no quedaria DNA del fag a la cèl·lula però el fag s'enduria 2 gens cel·lulars.
Per això no tots els fags es converteixen en transductors, només ho podran ser els que després de desenganxar-se tinguin un DNA de la mateixa mida que l'inicial. Això passa perquè si és més gran no cabrà a la càpsida i ja no es formarà el fag amb aquell DNA.
En el cas que s'emporti els dos gens (biotina i galactosa), no donarà lloc a un fag transductor, els transductors només tindran els gen de la biotina o el de la galactosa i mai ambdós. I d'aquesta manera els fags transductors sempre seran defectius, és a dir, els faltarà un tros del seu propi genoma, que hauran “intercanviat” per un gen cel·lular.
Hi ha fags que transdueixen gens diferents de la biotina i la galactosa, però per aconseguir-ho en E. Coli hi ha dues estratègies: Microbiologia I Silvia Expósito 1. Deleció: es pot provocar una deleció del lloc d'unió del DNA del fag al cromosoma cel·lular i llavors hi ha un segon lloc on també es pot unir el DNA del fag λ. Aquest altre lloc és entre els gens de la isoleucina i la valina i no s'hi uniran el 100% dels fags sinó que hi ha una freqüència més baixa però es podran aconseguir fags transductors amb el gen de la isoleucina o la valina d'E. Coli.
2. Deleció i unió: aquesta estratègia tracta de tallar la regió d'unió com abans i unir-la al mig dels gens que volem transduir. En aquest cas no estarem restringits a la localització natural de les regions d'unió del cromosoma cel·lular sinó que ho triarem nosaltres.
 Transducció generalitzada: Depèn de la replicació dels bacteriòfags. Es pot fer tant per fags lisogènics com lítics, només cal que es repliquin de forma específica. Els fags introdueixen l'àcid nucleic i tant si s'integra com si no (si s'integra en algun moment es desintegrarà), s'acabarà replicant a la cèl·lula, però el sistema de replicació és diferent, és un mecanisme anomenat en cercle rodant asimètric.
Es tracta de que una proteïna codificada pel fag, la proteïna A (una endonucleasa), s'uneix a una regió específica del DNA del fag i fa trencar una de les cadenes de DNA per aquell punt fent que s'obri. En aquest procés es va sintetitzant la cadena complementària a la circular (no de la lineal que s'ha trencat) i continua fins a tenir una còpia completa del DNA circular i segueix fins a tenir la cadena lineal amb la longitud de varis cromosomes bacteriòfags; el que passa és que aquesta també s'anirà fent circular al no cabre-hi.
La molècula gran i lineal de DNA que correspondria a diferents fags s'anomena concatèmer.
Sobre aquesta molècula actua una endonucleasa que talla a la regió “pac” (una regió determinada del concatèmer) i a partir d'aquell punt talla en diferents llocs corresponents al 2% del cromosoma del fag en funció de la longitud però sense tenir mai en compte el lloc específic on talla. Al final s'obtenen molts trossos de DNA del fag i es van sintetitzant les càpsides proteiques fent que s'introdueixin tants trossos de DNA com corresponguin a la llargada que ha de tenir el DNA del fag.
Els fags transductors es formen perquè a vegades al cromosoma cel·lular hi ha zones semblants a la regió “pac” que talla l'endonucleasa i aquesta no només talla la regió “pac” del fag sinó que també la tallarà si hi ha aquella seqüència al cromosoma cel·lular i tindrem trossos del DNA cel·lular tallats en fragments corresponents al 2% del fag.
Després a l'interior de les càpsides hi haurà una barreja de trossos de DNA que corresponen al genoma del fag i de la cèl·lula, incloent també fags amb només DNA cel·lular o fags només amb DNA del fag ja que la càpsida inclou DNA sense mirar de quin tipus és i per això qualsevol gen cel·lular té la mateixa possibilitat de ser transduït.
Amb cada transducció transportem DNA d'una cèl·lula a una altra i perquè tingui efecte cal que el DNA s'incorpori al cromosoma de la nova cèl·lula perquè sinó serà degradat o no passarà a una cèl·lula filla i desapareixerà aviat.
Conversió fàgica: la cèl·lula adquireix alguna propietat perquè un fag li introdueix gens seus.
Solen ser gens de virulència que produeixen toxines, en el cas de Vibrio Cholerae, que produeix el còlera, es deu a una toxina (toxina colèrica) codificada per uns gens que es troben en un fag lisogènic, el fag ctxΦ, i només produïen la malaltia aquells Vibrio Cholerae que havien incorporat aquell bacteriòfag. També E. Coli, en el cas d'introduir un fag determinat, causa gastroenteritis, és un altre exemple de conversió fàgica.
...

Comprar Previsualizar