Modulo 8 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Genòmica Humana
Año del apunte 2017
Páginas 10
Fecha de subida 13/06/2017
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MODULO 8: DIAGNOSTICO GENETICO 1. DIAGNOSTICO CROMOSOMICO Metodos de diagnostico en genetica: • Alteraciones cromosomicas ◦ ◦ ◦ ◦ • Estudio mediante cariotipo Permite una vision general de la informacion genetica del consultante Limita a la capacidad tecnica (>5Mb) Detecta alteraciones equilibradas Alteraciones genicas ◦ ◦ ◦ ◦ ◦ Estudios moleculares Hemos de saber que buscamos (gen casual) Alta resolucion (>5 Mb hasta poblaciones puntuales) Nada más investiga la zona interrogada Nuevas tecnicas permiten un abanico mas anmplio de observacion, escanear a nivel de todo el genoma El cariotipo es la disposicion ordenada de los cromosomas del nucleo de una celula atendiendo a su tamaño, la posicion del centromero y su patron de bandas. Nos permite ver todo el genoma pero limita la necesidad de cultivo celular (retrasa el diagnostico) Al ser una tecnica manual, aumenta la variabilidad.
1.1. Procedimiento de diagnostico por cariotipo a. A partir de celulas de un tejido de un individuo : hemos de decidir el tejido a partir del cual se obtendran las celulas y poner los elementos necesarios para hacer el cultivo; despues hemos de aportar las celulas en metafase y a partir de aqui y con la ayuda del microscopio, evaluar los cromosomas que observamos.
b. Observacion del cariotiopo por microscopia optica c. Observacion del cariotipo por microscopia de fluorescencia (tecnica de FISH) – nos permite detectar anomalias cromosomicas mas finas d. Hibridacion comparada de genomas – aun es mas fino Avances del cariotipo: - Vemos todo el genoma - Podemos valorar las alteraciones equilibradas - Tiene un coste asumible y relativamente barato Problemas: - Alta experiencia del personal - Necesidad de cultivo celular (retrasa el diagnostico) - Poca capacidad de resolucion (<5Mb) - muy influido por el ambiente (tecnica muy habitual) Cuando tenemos una patologia genetica podemos determinar si ese defecto genetico está relacionado con una anomalía cromosómica (ej.trisomia cromosoma 21); si lo está, haremos un diagnostico cromosomico Si no está relacionada con una anomalia cromosomica, distinguiremos entre 2 tipos de herencias: herencia mendeliana (podria ser que el locus esté localizado o que no lo este) y herencia no mendeliana (estudios de asociacion: genes o alelos de riesgo) Herencia Mendeliana: - Locus no localizado: diagnostico por patron de segregacion (ejercicio predictivo: poco fiable) - Locus localizado: • Gen identificado: ◦ Muchos alelos: diagnostico es poco fiable y, por tanto, se realiza un diagnostico indirecto ◦ Pocos alelos: diagnostico directo • Gen no identificado: diagnostico indirecto (ejercicio predictivo muy fiable) - Numericas Somias: un cromosoma extra Ploidias: 3n, 4n...
- Estructurales: trozos de cromosoma que tengan que estar en un sitio aparezcan en otro 1.1. Estudio del cariotiopo por microscopia optica Cada cromosoma tiene su bandeo especifico y es diferente entre las especies Preparacion de celulas para obtener un cariotipo: La mayoria de las celulas que se estan dividiendo quedan paradas en metafase, se fijan las celulas (hay diferentes metodos, en este caso metanol acetico) y se extienden estas en un porta, despues se añade tripsina (proteasa) y se colorea con Giemsa Observamos con microscopio, se toman fotografias y se recorta el cromosoma para ponerlos todos ordenados Ej. Sindrome de Turner (le falta el cromosoma Y) 1.2. Estudio del cariotipo por microscopia de fluorescencia: tecnica de FISH (Fluorescencia in situ hybridization) Podemos generar una sonda de ADN y la podemos marcar con una sustancia fluorescente, se unirá por complementaridad de bases, la region donde se ha enhanchado esta sonda será el genoma que queremos observar A. Protocolo de Fish (casi identico al anterior) Cogemos celulas, las tratamos (inducimos a proliferar), las paramos en metafase, fijamos estos cromosomas (se fija con formaldehido) y se desnaturalizan para que se abren y se añade nuestra sonda de interes (trocito de ADN que reconoce..) marcado con la sustancia fluorescente Observamos en microscopia de fluorescencia DAPI En este caso la sonda detecta la region de los telomeros – para cada cromosoma, por tanto, aparecen los puntitos de cada extremo Ventaja: podemos utilizar varias sondas al mismo tiempo utilizadno diferentes fluorocromos (hay fluoroforos que se excitan con bajas longitudes de onda o con altas) Ej. Inversion: esto es imposible detectarlo por un microscopio clasico -> cromosoma nº4, tenemos una anomalia estructural cromosomica, donde el cromosoma 4 se invierte de tal nmanera que parte de la region roja se traslada a la region verde y viceversa.
- En este caso, aplicaremos una sonda contra la region roja (del 1º cromosoma que sale en la foto) pero aparece el cromosoma homologo y aparecen 2 regiones marcadas en rojo: esto quiere decir que, sin saber que es una inversion, la region del cromosoma 4 se ha replicado - Utilizando una sonda para la region verde: aparece el cromosoma 4 normal y el cromosoma homologo tambien marcado en 2 regiones Si juntamos las dos imagenes podemos decir que ha habido una inversion. Esto implica en estudio previo.
FISH en interfase Caso a. Celula con sonda contra cromosoma 18, X e Y (celula masculina). Es normal ver dos manchas en cromosoma 18: son los dos cromosomas homologos.
Caso b. Hay 2 manchas contra cromosoma 18. Hay 3 manchas contra cromosoma 21, por tanto, tenemos una trisomia contra cromosoma 21.
- Amniocentesis y tecnica de FISH para descartar que exista una anomalia en el cromosoma 21 FISH Microdeleccion "P 22.3" Deficiencia de esteroide-sulfatasa - Cromosoma X - Microdeleccion - Se acumula sulfato de colesterol - Ictiosis (sequedad de la piel, aspereza, descamacion, hipertrofia de la piel) debido a que este acumulo de sulfato de colesterol hace que las celulas se queden mas adheridas.
Se trata de una mujer porque se ven dos manchas de cromosoma X Cromosoma espectral (chromosoma painting): - Cogemos los cromosomas, los separamos por tamaños, podemos recolectar en cada tubo cada uno de los cromosomas independientemente. Para cada uno de estos cromosomas, podemos hacer muchas sondas diferentes (lo cortamos en muchos trozos diferentes y cada uno de estos, sera una sonda; cada sonda, ademas, la vamos a marcar con un fluorocromo diferente), podemos mezclar todas estas sondas en un tubo y utilizarlo para hibridar un caritipo - Automaticamente, (el cromosoma 1 estará marcado de naranja) podemos detectar si ha habido alguna anomalia cromosomica, es decir, si en el momento de hibridar vemos que ha habido alguna anomalia cromosomica (aparecido un trozo de cromosoma diferente= ha habido hibridacion, falta un trozo= deleccion, etc..) - Cuando analizamos un nucleo en interfase (ADN disuelto en el nucleo) en lugar de metafase, los cromosomas no estan al azar dentro del nucleo, sino que existen regiones donde se acumulan algunos cromosomas - Analisis exhaustivo de aberraciones cromosomicas: deteccion bastante fina B. Hibridacion comparada de genomas (CGH): Permite encontrar anomalias cromosomicas sutiles (Ej. Microdelecciones/microamplificaciones) de manera no dirigida.
FISH no nos puede dar un diagnostico en este caso porque no está mapeada (no conocemos la sonda).
Se utiliza mucho en cancer como diagnostico genetico Procedimietno: ejemplo de cancer Tenemos una celula tumoral (extraemos su ADN) y tenemos una celula normal como control.
Cogemos lo que hemos extraido marcado con fluoroforo verde y el ADN de la celula normal lo marcamos con un fluoroforo diferente. Si las celulas fuesen exactamente iguales, hibridarian de forma normal y apareceria todo de color amarillo - Supongamos que en la celula tumoral hay una zona que esta amplificada: la zona amplificada la vamos a tener mas representada en esta celula que en la celula control. En los clones que tiene esa region va a competir mejor la sonda de la celula tumoral y en esa region detectamos fluoroforo de color verde mas que rojo. Sabemos qué secuencia de ADN es.
- Tb ocurre que en estas celulas tumorales hay perdidas (delecciones), en este caso, la sonda de esta region competira mejor la celula normal (veremos regiones en rojo) - Las regiones que son iguales en ambas secuencias se unirán por igual y se recombinarán perfectamente rojo y verde: saldrá amarillo Podremos mapear exactamente donde vemos una deleccion o una modificacion. Así, en este caso nos permite sin conocer nada sobre que tipo de problema cromosomico tiene, mapear las regiones mutadas y a partir de aqui podemos hacer la tecnica de FISH.
Ventajas: - Diagnosticos mas acurados - Nivel de resolucion mas elevado - Permite ver ganancias o perdidas de material (n de copias) Inconvenientes: - No nos permite observar alteraciones equilibradas - Nos muestra regiones de significado incierto - Hace falta una bioinformatica compleja - Interpretacion es mas complicada, ya que no sabemos si son grandes polimorfismos o heteromorfismos Utilidad clinica aplicada a la citogenetica: Diagnostico prenatal: objetivo: deteccion prenatal de las anomalias congenitas fetales mas frecuentes (Sindrome de Down, Sindrome de Edwards y los defectos del tubo neural) Tiene distribucion universal. Se pueden utilizar pruebas invasivas o no invasivas: Metodos no invasivos: • Ultrasonografía-ecografía: se puede utilizar para detectar el sindrome de Down. Sus marcadores ecograficos son: ▪ Pliegue nucal aumentado ▪ Persistencia ductos venoso ▪ Ausencia de huesos nasales ▪ Sandalia brecha (1 y 2 dedo del pie separados) ▪ Otros marcadores ecograficos secundarios, etc Hemos de tener en cuenta que la presencia de todos estos marcadores no implica una confirmacion de la enfermedad, habremos de hacer cariotipo.
• Determinaciones de marcadores bioquimicos en sangre materna: se trata de mirar los niveles de dos proteinas que se encuentran en la sangre materna, los niveles anomalos de los cuales se han correlacionado con la posibilidad de sufrir alguna alteracion genetica ◦ Niveles de alfa-ferroproteina: si es mas baja que la media esperada nos hace pensar y sospechar un sindrome de Down ◦ Niveles de gonadotropina corionica: si es mas baja que la media esperada " • ADN fetal en sangre materna: a la 8 semana se hace la primera ecografia y entre la 12 y 16 semanas se utilizan los marcadores bioquimicos. Esto permite establecer un riesgo de que el feto tenga Sindrome de Down. Dependiendo de los valores obtenidos, se decidirá hacer una prueba mas invasiva o no. El punto de corte es un 1/250 Las pruebas invasivas se haran siempre que el riesgo de diagnosticar la enfermedad a traves de la prueba invasiva sea mas elevado que el riesgo de provocar una perdida fetal consecuencia de la prueba. Este riesgo de perdida fetal está alrededor de 1/200.
Metodos invasivos (muestras fetales) • Biopsia de corion: consiste en realizar una puncion en el abdomen de la madre, llegar hasta la placenta y extraer una muestra de las vellosidades coriales. Se puede llevar a cabo via transabdominal o via transvertical (en funcion de la posicion fetal) Se pueden hacer entre la semana 12-14, antes de la amniocentesis, que hay que esperar mas porque ha de haber una cantidad de liquido amniotico superior.
Ventajas de hacer la prueba prematuramente: la madre no tiene aun tanta sensacion de embarazado Inconvenientes: mas agresivo, mayor riesgo de perdida fetal (mayor riesgo que la amniocentesis) • Amniocentesis: el riesgo de perdida fetal es de 1/200. La puncion se realiza directamente en el liquido amniotico y se extraen celulas fetales.
• Funiculocentesis: consiste en la extraccion de sangre fetal a traves del cordon umbilical. Es mucho mas compleja y arriesgada. Solo se puede realizar a partir de la 20 semana.
Indicaciones para un diagnostico genetico prenatal Tecnicas no invasivas: todos los gestantes Tecnicas invasivas: • • Estudio cromosomico: ◦ Parametros bioquimicos alterados ◦ Malformacion detectada ecograficamente ◦ Antecedentes: Progenitor portador de una anomalia cromosomica Hermanos afectados por una anomalia cromosomica o gestacion previa Estudio molecular: ◦ Antecedentes familiares de una alteracion monogenica ◦ Malformacion detectada ecograficamente Diagnostico hematologico: - Clasificacion - Pronostico - Tratamiento Diagnostico postnatal: - Sindromes - Infertilidad - Estudio inicial Diagnostico preimplantacional A partir de una pareja que tiene una alteracion genetica conocida, permite ver si sus fetos la tendran o no. Se realiza antes de la fecundacion; se extraen los ovulos de la mujer y el esperma del hombre y se hace una fecundacion in vitro.
Cuando la celula esta en la morula (8 cel) se saca una y se analiza para saber si hay alteracion genetica o no.
Hemos de hacerlo rapido porque antes de los 5 dias se ha de implantar o deja de ser viable (los oocitos son viables entre 3 y 5 dias).
Una vez detectado el oocito correcto (que no tiene ninguna alteracion) este se implantara y obtendremos un niño sano.
Esta tecnica tiene mucha utilidad y actualmetne se esta practicando pero la tasa de exito es baja (hemos de sumar la tasa de exito de la fecundacion in vitro y la de reducir el numero de implantes) 2. DIAGNOSTICO MOLECULAR (Directo e indirecto) El diagnostico indirecto lo usaremos cuando el gen no está identificado o no está definida la naturaleza (predictivo: muy fiable) • • Indirecto: Marcadores polimorficos, es decir, que existen varios alelos, asociados (ligaos) al locus -> sugiere una probabilidad alta de fiabilidad Directo: Deteccion de mutaciones -> certeza (la penetrancia tb influye, es decir, aunque un bebe tenga una mutacion, la certeza es casi del 100% pero tenemos que tener en cuenta el concepto de penetrancia, o sea, no tiene por que manifestar la enfermedad, tiene que ver con la relacion con otros genes Nota sobre el diagnostico indirecto: • Muchas veces las mutaciones no son evidentes: en un lugar de regulacion genetica (muchas veces aunque sepamos qué gen es, puede ser que ese gen no caiga en la region promotora, sino en la region reguladora, por ejemplo) • Los marcadores en diagnostico indirecto han de estar ligados al locus que causa la enfermedad, es decir, han de estar cerca de la mutacion, si no no son marcadores • Ej. Nail Patella Syndrom, asociado al grupo sanguineo 2.1. Diagnostico molecular directo: Deteccion de mutaciones Tipos Caracteristicas Tecnicas Grandes Delecciones Duplicaciones Inversiones Southern PCR multiplex Pequeños Mutaciones puntuales Pequeñas delecciones Pequeñas d PCR: SSCP PCR: DGGE PCR: Digestion (RFLP) PTT Dinamicas Expansion de tripletes PCR Southern Observacion Presencia o ausencia de fragmentos Movilidad alterada Cambios producto Variaciones en el tamaño del fragmento 2.1.1. Diagnostico de la Anemia Falciforme por RFLP (Rectiction Fragment Length Polymorphism) - La region de interes contiene una secuencia que es conocida por un enzima de restriccion (enzima que rompe el ADN en esa secuencia) - En la Anemia Falciforme ocurre que un gen tiene una mutacion puntual que afecta a la secuencia que reconoce este enzima de restriccion. Así, este cambio de un unico nucleotido hace que ese enzima no pueda cortar esa secuencia -> la secuencia tiene que estar altamente conservada para que funcione - Aqui podemos genotipar dos individuos Secuencia normal ---- + ---Secuencia mutante ----- Individuo normal: si tiene 2 bandas es porque tiene una banda normal y se corta (el normal se muere de malaria) - Individuo afectdo: vemos una banda porque no se corta (el afectado muere de anemia) - Portador (heterocigoto): un alelo es malo y otro es bueno (que se corta), por tanto, obtendrá las dos bandas (no se muere ni de anemia ni de malaria, por tanto, en la poblacion de Africa este es el que mas aumentado esta) 2.1.2. PCR: SSCR -> Single strans conformation polymorphism Amplificamos el fragmento de interes. Tenemos un ADN WT (normal) y un ADN MUTANT. Hacemos una PCR de estos fragmentos, que amplifica la region de interes y se hierve estas muestras para separar las dos hebras de ADN, despues añadimos la muestra en la sustancia fria (hielo), asi cuando se produce este paso, no le da tiempo a juntarse de nuevo, se quedan independiente.
Estas hebras, debido a ese unico cambio, van a migrar y tendrán conformacion diferente, por tanto, seremos capaces de distinguir si existe una C o una A Si esto lo ponemos en un gen, el fragmento que hemos amplificado es el mismo, el tamaño de la banda es el mismo, tenemos las dos hebras de ADN...
Geles de agarosa: plano. El ADN va hacia el polo positivo (porque el ADN es negativo). La idea es separar los electroforesis hacia el polo positivo haciendo pasar por un filtro molecular. En estos casos, el polo es demasiado grande por lo que en lugar de usar geles de agarosa, se utilizan geles de acrilamida.
2.1.3. Deteccion de mutaciones en el gen de la Fibrosis Quistica por ASO (Allele-Specific Oligonucleotide) Tenemos los diferentes exones afectados en la fibrosis quistica, esto es, la mutacion que da lugar a al enfermedad no es siempre la misma (hay variacion). Esto hace que la expresividad de la enfermedad dependiendo del tipo de mutacion puede ser diferente Podemos hacer una aproximidad para detectar todas las posibles mutaciones en una matriz de manera que podamos verlas todas al mismo tiempo Tenemos un dot blat assay donde tenemos oligonucleotidos que tienen la version normal del gen para esa mutacion o la version mutada del gen.
Podemos coger pacientes, hacemos la PCR para el exon II, por ejemplo, amplificamos ese exon y tiramos esa secuencia a este dot blot (por hibridacion, se unirá a la secuencia normal o a la secuencia mutada): tenemos secuencia en la banda normal en todos menos en el 5 que tiene señal en el alelo normal y en el mutado, por tanto, este paciente es heterocigoto para esta mutacion. Si presenta señal solo para la mutacion y no para la normal es porque es homocigoto para esa mutacion.
2.1.4. Deteccion de grandes delecciones en DMD (Distrofia Muscular de Duchenne): PCR Multiplex Este gen es muy particular porque es el gen mas grande que existe (2 megabases) y contiene hasta 79 exones. Manipular este gen no es facil. En los exones donde se han descrito delecciones podemos diseñar una PCR Multiplex, es decir, amplificar todas al mismo tiempo y correrlas (en vez de hacerla con 2 primers lo hacemos con muchos primers) Si tiene una deleccion en un alelo solo sera heterocigoto (si es herencia recesiva no se daría la mutacion), pero si tiene otra deleccion ademas en otro alelo aunque sea diferente, en este caso es recesividad, se daría la enfermedad. Es dcecir, tiene que haber 2 mutaciones pero no importa en qué alelos.
Nota: FISH y metodos directos, no mutuamente excluyentes: El metodo FISH nos permitia detectar anomalias estructurales a nivel cromosomico pero nosotros podriamos diseñar una sonda FISH para cada una de estas delecciones (esto seria mucho mas costoso, dependeria de muchas mas cantidades de celulas etc, en cambio, la PCR es mucho mas rapido, no depende de material genetico del cual parte tanto). Algunos metodos los podemos mezclar entre ellos 2.1.5. Deteccion de mutaciones dinamicas por PCR o Southern Ejemplo muy conocido: ENFERMEDAD DE HUNTINGTON Un alelo normal existe en 3 repeticiones que se puede amplificar y desues de varias replicaciones (de generacion en generacion) (hace que la primase falle) se puede manifestar la enfermedad. Si pasa un cierto umbral de repeticiones: son errores de replicacion, errores comunes porque son secuencias muy repetidas y ahi la primasa puede fallar.
a) Metodo de Souther: coger ADN genomico del individuo, correrlo un gen, detecta el numero de repeticiones en funcion de su tamaño y su peso molecular. En este caso, necesitamos una sonda especifica que hibride.
En el caso de ser heterocigoto (dos bandas), hay posibilidad de que se transmita a las posteriores generaciones en forma de mutacion b) PCR: Podemos diseñar 2 primers e identificar la region de interes en el individuo con premutacion tendremos 2 bandas. El problema es que la region de ADN se diseña para que amplifique un determinado tamaño, si la banda es muy grande es posible que no se amplifique bien o no se amplifique en absoluto (ej.si tiene 2 kb) a no ser que ampliemos el tiempo de procesamiento. El tamaño de mutacion puede ser imprescindible 2.2. Diagnostico molecular indirecto Se basa en que la region de interes donde se encuentra el gen mutado no la podemos detectar directamente, podemos evaluar el genotipo pero no sabemos donde esta la mutacion o no hemos mapeado cual es esa mutacion.
Podemos detectar la presencia de ese alelo mutado a partir de marcadores que se encuentran cerca de ellos y tenemos herramientas o tecnicas para detectarlas. Podemos seguir la transmision de ese alelo en una determinada familia.
Condicion que se tiene que dar para que la secuencia codificadora sea marcadora de un locus de interes: que este cerca (ligada) A partir de la transmision del alelo mutado, podemos detectar y podemos hacer un diagnostico predictivo muy fiable.
Muy importante: cuando hablamos de dos marcadores o dos genes que estan ligados, hablamos de dos locus (lugares): lo que está ligado son los locus, no los alelos 2.2.1. Estudios de ligacion con familias humanas a) Locus Nail-Patella se asocia con el locus del grupo sanguineo – no se asocia con el alelo A o B o 0 sino con el grupo sanguineo b) En cada familia se asociara con un alelo diferente, pero eso n quita que la enfermedad y el locus del grupo sanguineo estan ligados.
En este caso es el alelo A el que se asocia a la enfermedad Ejemplo: Variante polimorfica asociada a nuestro gen de interes: tenemos dos alelos de esta region polimorfica, en este caso, nuestro lugar de interes tiene tambien dos alelos (alelo mutado y alelo no mutado).
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