Tema 34. (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Complutense de Madrid (UCM)
Grado Farmacia - 3º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2016
Páginas 4
Fecha de subida 20/06/2017
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    Tema  34:  Búsqueda,  aislamiento  e  identificación  de  microorganismos  y   nuevos  metabolitos  de  interés  industrial     Requisitos  de  un  microorganismo  industrial:   -­‐  Producción  de  una  sustancia  con  interés  industrial.   -­‐  Aislado  en  cultivo  axénico  (puro).   -­‐  Rápido  crecimiento:  para  evitar  usar  un  largo  tiempo  un  equipo  costoso,  el  control  de  los  factores   ambientales  es  más  fácil  y  se  evitan  contaminaciones.   -­‐  Protección  frente  a  la  contaminación  (bajo  pH,  bacteriocinas…).  Evitan  el  crecimiento  de  otros   microorganismos  si  tienen  requerimientos  raros  o  producen  ciertas  toxinas.     -­‐  Crecimiento  en  medios  líquidos,  baratos,  a  gran  escala.     -­‐  Requerimientos  nutricionales  no  exigentes.   -­‐  Seguridad  sanitaria.  No  pueden  ser  patógenos.     -­‐  Fácil  separado  y  procesado  del  producto  generado.     -­‐  Susceptible  de  manipulación  genética.   -­‐  Conservación.  Si  se  muere  fácilmente,  perdemos  sus  propiedades.       Debemos  elegir  un  lugar  para  coger  los   microrganismos  y  un  medio  y  condiciones  en   los  que  pensamos  que  crecerán  los   microorganismos  que  buscamos.     Si  buscamos  microrganismos  productores  de   antibióticos,  se  ha  visto  que  suelen  encontrarse   en  el  suelo  y  tienen  requerimientos   nutricionales  bajos,  los  buscamos  en  muestras   de  suelo.  Se  aíslan  y  se  ve  si  son  capaces  de   producir  una  inhibición  microbiana  sobre  un   microorganismo  de  ensayo.  La  bacteria  se   siembra  en  un  césped  y  sobre  este,  las   bacterias  provenientes  del  suelo.  Debemos   aportar  una  temperatura  adecuada,  menos  de   30ºC  porque  su  medio  natural  es  el  medio   ambiente.   Otra  forma  de  hacerlo  es,  una  vez  identificado   el  microorganismo,  se  siembra  y  se  ve  sobre   qué  microorganismos  es  sensible.     Hay  microorganismos  que  son  ligninolíticos,   celulolíticos  o  hemicelulolíticos,  por  lo  que  hay   que  poner  en  el  medio  este  compuesto  para   que  puedan  hidrolizarlo.  Cuando  se  hidroliza,  puede  cambiar  el  color  de  la  placa  o  se  puede  poner  una   sustancia  que  permita  visualizar  el  componente  degradado.       Se  han  analizado  muchos  ambientes,  por  lo  que  es  más  difícil  encontrar  microorganismos  nuevos  en   ambientes  ya  estudiados.  Hay  investigaciones  que  hacen  expediciones  a  lugares  como  la  Antártida  para   buscar  nuevos  microorganismos.       Estrategias  para  la  identificación  de  nuevos  fármacos  producidos  por  microorganismos   Tenemos  colecciones  de  compuestos  naturales  producidos  por  microorganismos.  Se  hacen  extractos  de  ellos   y  se  prueban  para  ver  si  tienen  alguna  actividad  farmacológica.  No  se  hace  en  el  momento  del  aislamiento,   sino  que  se  buscan  nuevas  especies  en  lugares  raros.  Se  hace  un  screening  farmacológico.  También  se  hace   con  compuestos  de  síntesis  química.     1       Consiste  en  hacer  un  ensayo  que  permita  saber  qué  efecto  tiene  el  compuesto.  Los  que  dan  positivo,  pasan  a   una  fase  de  desarrollo  en  la  que  se  usan  modelos  animales.  Finalmente  se  hace  la  fase  clínica  con  personas   sanas  y  enfermas.  En  10-­‐15  años  desde  que  empieza  el  proceso  se  puede  obtener  un  nuevo  fármaco.     El  compuesto  debe  actuar  sobre  una  diana  en  la  célula  microbiana.   Requisitos  de  una  diana  de  antimicrobianos:   -­‐  Fisiológicos:  el  compuesto  debe  ser  esencial  para  el  crecimiento  y  supervivencia  del  patógeno.   -­‐  Toxicidad  selectiva:  sin  homólogo  en  células  humanas.  Cuantas  menos  dianas  haya  en  nuestras  células,   menos  tóxico  va  a  ser  para  nosotros.  Los  fármacos  que  actúan  sobre  ribosomas  pueden  dar  más  problemas   de  toxicidad  porque  hay  cierta  similitud  entre  los  ribosomas  humanos  y  microbianos.  Las  paredes  celulares   son  esenciales  en  hongos  y  bacterias,  hay  fármacos  que  actúan  sobre  esta  diana.       Tipos  de  ensayo   In  vitro  (bioquímico):   Usamos  la  diana  purificada,  el  componente  celular  (enzima,  receptor…)  y  se  detecta:   -­‐  La  inhibición/activación  enzimática   -­‐  La  interacción  con  el  componente  celular  (receptor)   Es  relativamente  sencillo  de  hacer.   Ventajas:   -­‐  Alta  especificidad  bioquímica.   -­‐  Alta  sensibilidad.  A  mayor  cantidad  de  diana,  mejor  se  ve  el  efecto.     Desventajas:     -­‐  No  actúan  in  vivo  (falta  de  permeabilidad).  Estos  compuestos  no  se  pueden  usar  porque  no  llegarán  a  la   diana  celular.     In  vivo  (celular):   Se  utilizan  células  vivas.  Se  mide  el  efecto  biológico  de  un  compuesto  sobre  la  célula  (screening  fenotípico):   inhibición  del  crecimiento.   Ventajas:   -­‐  Entrada  en  la  célula  y  mantenimiento  del  microambiente  de  la  diana.     Se  suelen  usar  más  estos  ensayos  porque  el  efecto  es  rápido  y  fácil  de  ver.     Debemos  hacer  ensayos  baratos  y  fácilmente  realizables.  Los  cribados  o  screening  son  de  alto  rendimiento.  Se   hacen  de  10.000  a  100.000  ensayos/día  en  HTS  (High-­‐throughput  screening).   -­‐  Automatización:  robótica  (dispensación).   -­‐  Miniaturización:  alta  densidad  de  pocillos  y  pequeño  volumen  (nanotecnología).   -­‐  Detección:  por  fluorescencia,  quimioluminiscencia.   Los  robots  pueden  trabajar  las  24  horas  del  día.   Normalmente  se  tiene  una  elevada  colección  de  compuestos,  que  pueden  ser  de  síntesis  o  de   microorganismos.  El  ensayo  debe  permitirnos  realizarlo  a  gran  escala  también.     Otra  estrategia  para  la  identificación  de  inhibidores  de  la  diana  es  el  diseño   racional  a  partir  de  la  estructura  de  la  diana.  Se  hace  con  los  inhibidores  de  la   neuraminidasa  del  virus  de  la  gripe  que  impide  la  salida  del  virus.  No  se   prueban  muchas  estructuras  porque  sabemos  cuál  encajará  en  la  diana.     -­‐  Requiere  el  conocimiento  de  la  estructura  tridimensional  de  la  diana   (purificación  y  cristalización)  y  MOA.   -­‐  Síntesis  química.   -­‐  Elevadísima  especificidad.   El  virus  de  la  gripe  utiliza  la  neuraminidasa  para  salir,  hidroliza  los  ácidos   xiálicos.  El  ácido  xiálico  encaja  en  el  centro  activo.  Si  se  sabe  la  estructura  de  la   enzima  y  del  centro  activo,  se  pueden  diseñar  compuestos  que  encajen   perfectamente  en  el  sitio  catalítico.         2       Conservación  de  microorganismos   Una  vez  tenemos  un  microorganismo  que  produce  un  compuesto  interesante,  tenemos  que  preservarlo  con   esta  actividad.  Objetivos:   -­‐  Cultivo  puro:  evitar  contaminaciones.   -­‐  Supervivencia  de  al  menos  el  70-­‐80%  de  las  células.   -­‐  Estabilidad  genética:  que  no  haya  mutaciones  que  cambien  sus  características  para  que  siga  produciendo  el   compuesto.     Métodos:   -­‐  Congelación  desde  -­‐20ºC  hasta  -­‐70º.  A  mayor  temperatura,  mejor.  La  congelación  debe  ser  muy  rápida,  se   usa  nitrógeno  líquido.  Factores:  velocidad  de  congelación,  temperatura,  crioprotectores  (como  el  glicerol,   que  hace  que  no  se  formen  cristales  grandes  en  la  célula).   -­‐  Liofilización.  Se  elimina  el  agua  por  congelación  y  posterior  sublimación.  Luego  hay  que  hidratarlo.     Alternativas:  transferencia  periódica  de  un  tubo  a  otro,  suspensión  en  agua,  desecación  en  papel,  etc.  La   estabilidad  genética  puede  no  ser  tan  buena,  porque  si  las  células  se  multiplican  es  mayor  la  posibilidad  de   mutación  genética.       Colecciones  de  microorganismos   Los  microorganismos  aislados  del  hábitat  natural  y  seleccionados  se  guardan  en  colecciones  de  ``cultivos   tipo´´.  La  ATCC  y  CECT  se  encargan  de  preservar  y  conservar  microorganismos.  En  estas  colecciones  se  puede   buscar  el  microorganismo  que  nos  interese.       Mejora  de  las  cepas  industriales   En  la  naturaleza,  los  microrganismos  pueden  producir  una  pequeña  cantidad  de  antibiótico.  Si  queremos   hacerlo  comercialmente,  necesitamos  que  produzca  mayor  cantidad  de  antibiótico.  Para  ello  se  hacen   procesos  de  mejora  de  las  cepas,  también  para  que  crezca  mejor,  requiera  menos  sustratos,  etc.       Métodos  de  mejora  de  microorganismos  industriales   •  Optimización  de  medios  de  cultivo  y  procedimientos.   •  Optimización  de  cepas:   o  Selección  natural  de  variantes  (mutación  espontánea).  Es  por  la  tasa  de  error  de  la  polimerasa  en  la   multiplicación.  Se  va  pasando  el  microorganismo  a  diferentes  medios  para  que  se  multipliquen  muchas   veces.     o  Mutagénesis  inducida  (UV,  MSE).  Se  hace  un  tratamiento  mutagénico  suave  para  que  no  cambie   demasiado  el  microorganismo.  En  la  naturaleza,  los  microrganismos  tienen  mecanismos  de  regulación  de   la  cantidad  de  antibióticos  producidos.  Por  mutagénesis  se  eliminan  los  mecanismos  de  control.     o  Obtención  de  recombinantes  genéticos:   -­‐  Transferencia  genética  entre  organismos:  cruces,  procesos  de  recombinación.  Si  un  microorganismo   produce  antibióticos  y  crece  mal  y  se  pone  en  contacto  con  otro  que  crezca  bien,  podemos  obtener  un   mutágeno  que  sintetice  el  antibiótico  y  crezca  bien.     -­‐  Utilización  de  la  ingeniería  genética:  ingeniería  metabólica.  Combinamos  rutas  metabólicas  de  distintos   organismos  para  obtener  distintas  combinaciones.     Producción  industrial  de  lisina   Los  aminoácidos  tienen  rutas  metabólicas  en  las  que  el  producto  final   tiene  una  regulación  negativa  para  que  no  se  sintetice  más  lisina  de  la   necesaria.  Si  se  elimina  el  sitio  de  unión  de  la  lisina  a  la  enzima,  deja  de   responder  a  ella.     Brevibacterium  flavum  puede  producir  60g  lisina/litro.     Modificación  de  la  cantidad  o  calidad  de  enzimas  que  intervienen  en  una  ruta  metabólica   -­‐  Modificación  de  la  dosis  génica  (aumento  de  las  copias  del  gen).  Se  integran  en  el  genoma  del   microorganismo  varias  copias  del  gen,  con  lo  que  se  multiplica  la  cantidad  de  genes  iguales  que  producen  la   enzima.     3       -­‐  Modificación  de  la  expresión  génica:  podemos  poner  un  promotor  fuerte  para  tener  una  alta  expresión  de  la   proteína.   -­‐  Modificación  de  las  características  de  la  enzima  (mutagénesis:  ingeniería  bioquímica).  Se  puede  hacer  una   enzima  más  estable  frente  a  diferentes  factores,  como  la  temperatura,  proteolisis,  etc.  Se  puede  aumentar   su  actividad  o  hacerla  más  o  menos  específica.  También  se  puede  desregular.     -­‐  Combinación  de  rutas  de  diferentes  orígenes.  Se  puede  pasar  un  compuesto  generado  por  una  bacteria  a   otra  que  lo  necesite  para  hacer  una  ruta  metabólica.  Estas  2  rutas  se  pueden  juntar  en  un  mismo   microrganismo  para  que  sintetice  él  solo  el  compuesto.     Todas  estas  modificaciones  se  pueden  hacer  al  azar  o  por  modificación  genética.         4   ...

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