Tema 5: Gens i mutants (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura genètica molecular
Año del apunte 2015
Páginas 4
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 18
Subido por

Vista previa del texto

Tema 5. Gens i mutants Les dues eines fonamentals per a l’anàlisi genètic són una col·lecció de mutants que afecten en la funció d’un gen i una còpia clonada del gen.
Es defineix com a mutació una alteració en la seqüència del DNA d’un individu que es transmet per herència als seus descendents, aquestes es produeixen per errors en la replicació, per l’alteració espontània de nucleòtids o degut a l’acció d’agents física o químics (mutàgens), però mai com a conseqüència de la recombinació meiòtica entre cromosomes homòlegs. Tenir mutants pot ser útil per conèixer millor un gen (és útil tenir diverses mutacions en aquest gen en concret), per fer anàlisi d’estructura-funció i sobretot per a fer anàlisis genètics.
Hi ha dos tipus d’anàlisi genètic: - Forward: investigador comença amb un organisme que presenta un fenotip mutant  es treballarà en la identificació i caracterització del gen responsable. FENOTIP  GEN. Mitjançant mutagènesi s’originen els gens mutants 1. Produir mutacions: mitjançant agents mutàgens per incrementar la freqüència de mutació, n’hi ha de diversos tipus Classe Mutagen Efecte primari Tipus de mutació Administració Organismes Químics alquilants Etilmetanolsulfanat (EMS) Alquila purines, en concret guanines Modifica timidines Transició G  A (més probable unió amb T) Mullant, alimentació Transicions Aplicació directa als testicles Intercalació entre bases S’incorpora en llocs on va una T durant la replicació Formació de dímers de timina Desplaçament de la pauta de lectura Transició T C (s’aparellarà amb G) Transicions i transversion.
S’escindeixen dímers de timina i s’afegeixen dos nucleòtids a l’atzar Irradiació Reordenaments de cromosoma: delecions, duplicacions, inversions i translocacions Delecions Irradiació de tot l’organisme Nitrosoguanidines (ENU) Químics intercalants Químics anàlegs de base Taronja d’acridina Radiació Llum UV Radiació ionitzant Raig-x i raiggamma Trencament cromosoma Radiació Raig de neutrons Insercions: de les més usaded Elements transposables Trencament cromosoma Inserció o escissió aleatòria Bromodeoxiuridina T-DNA Inserció aleatòria Disrupcions d’un sol gen (transposó s’insereix en la regió codificant d’un gen) i delecions petites (l’escissió de l’element transposable pot eliminar part del DNA del seu voltant) Disrupcions d’un sol gen Drosophila, C. elegans, Arabidopsis Ratolí Procariotes Irradiació llavors Soques mutants Diversos.
Sovint es combina amb psolaren per potenciar efecte Diversos Plantes Diversos Arabidopsis  Agents químics: s’usen en gairebé tots els organismes i produeixen un espectre limitat de mutacions en un únic gen. Poden dur a terme una modificació química afegint-se al DNA durant la replicació, o bé s’intercalen entre bases en una cadena de DNA. En els casos en que es modifiquen bases, el nucleòtid alterat s’aparella de forma diferent al que hi havia anteriorment, provocant transicions o transversions. També hi ha mutàgens que durant la replicació poden substituir la posició de nucleòtids normals, generant transicions. L’avantatge d’aquests agents és que ens donen una freqüència de mutació elevada, però cal tenir en compte que tenen una elevada toxicitat i s’ha de fer una posterior seqüenciació per detectar-los.
 Radiació: la majoria provoquen trencaments de doble cadena en el DNA, aquests tenen com a resultat reordenacions del cromosoma, com ara delecions, duplicacions i translocacions. Mitjançant radiació, podem dur a terme un trencament dels cromosomes o bé induir la formació de dímers de timina. En el primer cas, trobem els fast neutrons, els quals s’usen en plantes mitjançant irradiació de les llavors, i els raig-X o raiggamma que s’apliquen mitjançant irradiació de tot l’organisme. En el segon cas aplicaríem raig UV, un inconvenient d’aquest és que generalment hi ha mecanismes de reparació eficients.
 Insercions: els elements transposables tenen dos propietats clau: es mouen com una unitat independent i a més s’insereixen de forma més o menys aleatòria en el genoma. En el cas de Drosophila melanogaster, s’insereix un element P on s’han substituït els exons per un gen d’interès i un element P que codifica per la transposasa però que no té les repeticions terminals, es a dir, aquest no s’inserirà en el genoma, però codificarà per a la transposasa, la qual inserirà el nostre gen d’interès en el genoma.
L’element amb les ales tallades (sense repeticions terminals) podrà moure el nostre gen d’interès sempre i quan aquests dos s’expressin en el mateix genoma. Un avantatge d’aquest mètode és la baixa toxicitat i els desavantatges són la presència de regions amb diferent freqüència de transposició i que la transposició té preferència pels introns. Com a resultat tindrem hostes que tinguin un gen programat amb un promotor induïble, de forma que el transposó canviarà de lloc quan nosaltres posem un component que activi el promotor 2. Identificació de mutacions: en general, cal que ens fixem en un genotip molt ben definit. La cerca de mutacions es basa en el creuament d’organismes. El que fem és, induir mutagènesi en un organisme i creuar aquest amb un altre que no s’ha sotmès a mutagènesi però presenta dos marcadors en diferents cromosomes (A i B), la mutació d’interès és m (afecta en el color d’ulls). Les mutacions acostumen a ser recessives, és per aquest motiu que esperem trobar individus amb un fenotip wild-type però heterozigots per diverses mutacions que afecten en el color d’ulls i fem un creuament de la F1, en el cas que la mutació sigui dominant l’observarem en la F1. * són mutacions no desitjades que s’eliminen amb més creuaments. Els organismes que tenen marcadors ens permeten fer un seguiment, com més n’hi hagi, millor.
Hi ha mutacions que fan a l’organisme una mica inviable, o que el fenotip no es pugui observar en certes condicions: existeix una temperatura restrictiva en la qual el mutant sí que es pot observar. S’usa per fenotips letals a certes temperatures o que no es poden observar a temperatura normal. En C. elegants la temperatura permissiva és 15ºC i a 25ºC es mostra el fenotip letal. En la temperatura permissiva és on tot el fenotip és salvatge. Perquè el canvi de temperatura canvia la observació d’una mutació? No es sap al 100%, hi ha hipòtesis: o Estabilitat de la proteïna: la proteïna té la seva conformació nativa prou activa a baixes temperatures, a mesura que augmentem la temperatura, les interaccions que mantenen la temperatura canvien i la proteïna perd la seva estructura.
Molts gens importants en el cicle cel·lular en Saccharomices cerevisiae, en un Erlenmeyer posaven el llevat amb l’agent mutagen, surten mutacions a l’atzar, es distribueix en alíquotes i tenim una sèrie de plaques amb colònies i cadascuna d’aquestes són clons que presenten mutacions, es van fer créixer a 23ºC, després van fer una rèplica (mateixa placa es sembra en dues plaques diferents), una es fa créixer a 23ºC (permissiva) i l’altre a 36ºC (restrictiva).
Cada espècie té les seves temperatures permissives i restrictives A 23ºC creixen tots i a 36ºC els llevats que tenen problemes en el cicle cel·lular comencen a créixer i s’aturen en algun moment del cicle (es podien fer estudis per saber en quin moment del cicle s’aturava el creixement dels organismes)  ho identificaven a partir de les colònies que creixen a les plaques de temperatura permissiva i no a les de restrictiva.
.3. Localitzar mutacions: a quin gen afecta aquesta? Assignem la mutació en un locus del cromosoma usant mapes genètics (mirem la lligació de certs marcadors entre ells: si hi havia recombinació és que estaven separats, si no es que estan junts). Fem creuaments de la nostra mutació amb una sèrie d’organismes que tinguin un marcador recessiu que tenim identificat, obtenim heterozigots, depenent si estan lligats o no, obtindrem diferents resultats, es miren freqüències de recombinació del lligament.
Per saber si les mutacions estan en un mateix gen fem els tests de complementació: volem una col·lecció per trobar tots els gens que estan involucrats. Es fan aproximacions, quan el sistema es satura vol dir que hem identificat tots els gens.
M representa un al·lel mutat recessiu que s’ha de caracteritzar, i a és un marcador recessiu del qual es coneix la situació en un mapa, s’encreuen el mutant i el marcat per tenir una F1 heterozigota. A l’esquerra trobem el cas en que no es troben associats, perquè obtenim 4 tipus de gàmetes amb igual freqüència (estan separats i hi ha recombinació). Si a i m es troben propers, la probabilitat d’obtenir ma i ++ és menor, ja que la distància entre els gens no és la mínima per a que es realitzi la recombinació) 05/11/2015 4. Classificar mutacions Classificació de Muller: - Nullomorfs: no funcionen Hipomorfs: disminueix la funció Hipermorfs: augmenta la funció Antimorfs: proteïna funcional que enverina la funció d’una altre proteïna Neomorfs: funció nova o una funció on no toca Classificació actual: (als esquemitas) Classificar mutacions - Primera foto dalt: hipermorfs, hi ha un augment de la funció en els mutants.
Segona foto dalt: hipomorf, baixa la funcionalitat Foto del mig: neomorf, s’expressa o fa una funció nova, o s’expressa en un lloc diferent al que li toca. Funció nova Foto dreta: antimorf, s’enverina la funció d’una altre proteïna, la proteïna del gen és la mateixa - Primer foto baix: nullomorf, pèrdua total de la funció Segona foto baix: haplo-insuficient (encara no l’hem vist), ens calen les dues còpies funcionals per a que tingui la funció, a diferència de la segona foto de dalt, on l’heterozigot té menys funció però encara en té.
Per classificar podem analitzar la seqüència, i si volem més informació passem a clonar el gen i treballem únicament amb ell, podent saber així la funció específica.
Fins aquí, anàlisi genètic forward.
- Reverse: investigador identifica un gen clonat o una seqüència de DNA  treballa per a entendre el procés biològic en el que està implicat el gen o en la identificació del fenotip mutant. FENOTIP  GEN. La mutació va dirigida a gens específics.
Del que partim depèn del tipus d’estudi: podem partir de tot el genoma (llibreria genètica on estudiem que conté cada fragment), clons de cDNA si volem estudiar processos en determinats teixits (existeixen llibreries de cDNA) o un fragment del que coneixem la funció de l’ortòleg (sabem que en una altre espècie fa una determinada funció, fem cerca d’homologies en una altre espècie, on pot ser que tingui la mateixa funció  clonem i estudiem).
Molt útil la tècnica de inserció dirigida de DNA perquè partim d’un gen clonat i poder-lo clonar (es pot fer en S.
cereviseae i Mus musculus).
...