Bloc VI (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Veterinaria - 2º curso
Asignatura Microbiologia i aplicacions
Año del apunte 2015
Páginas 18
Fecha de subida 01/01/2015
Descargas 81

Vista previa del texto

BLOC VI TÈ CNIQUÈS IMMUNODIAGNOSTIQUÈS: VALORACIO DÈ LA RÈSPOSTA IMMUNÈ HUMORAL I CÈL·LULAR RESPOSTA IMMUNE HUMORAL: Es basa en la detecció d’anticossos o del complement a partir de la unió anticòs-antigen (Ab-Ag). Tenim dos tipus de diagnosis:   Diagnòstic directe  Detectem antígens.
Diagnòstic indirecte  Detectem anticossos al sèrum. Pot ser a partir de proves serològiques o a partir de dilucions amb les quals obtenim el títol (Última dilució que és positiva).
En les proves de resposta immune humoral és molt important tenir en compte la sensibilitat i l’especificitat. La sensibilitat es basa en buscar la menor proporció de falsos negatius i l’especificitat la menor proporció de falsos positius.
Tot i que aquestes tècniques es basen en la detecció de la unió antigen-anticòs poden fer-ho de dues maneres: 1. Primària  Mesuren directament la unió antigen-anticòs.
2. Secundària  Mesuren els efectes o resultats de la unió antigen-anticòs.
Per a poder veure la unió hem de marcar o bé l’antigen o bé l’anticòs. Hi ha diferents substàncies que serveixen com a marcadors.
    Fluorocroms (Immunofluorescència, FACS...) Radioisòtops (RIA) Enzims (ELISA, Western blot...) Metalls pesats (Immunohistoquímica...) TÈCNIQUES PRIMÀRIES: Mesuren directament les unions antigen-anticòs.
1.-IMMUNOFLUORESCÈNCIA: És una tècnica que s’utilitza en la identificació i localització de molècules en seccions de teixits, cèl·lules i fluids biològics. La tècnica es basa en el marcatge d’anticossos específics amb compostos fluorescents, la unió dels anticossos amb el seu antigen corresponent dóna lloc a la formació d’immunocomplexes que podem veure sota el microscopi de fluorescència. Els fluorocroms en ser excitats amb energia electromagnètica de longitud d’ona apropiada, emeten radiació de longitud d’ona característica. Hi ha una gran varietat de pigments fluorescents o fluorocroms:    FITC (Isocianat de fluoresceïna)  És el més utilitzat de tots i emet una llum de color verd groguenc.
Rodamina  Emet llum de color vermell intens.
Ficoeritrina  Emet llum taronja.
Podem utilitzar fluorocroms combinats en una mateixa mostra sempre hi quan s’excitin a la mateixa longitud d’ona però que tinguin un espectre diferent d’emissió, d’aquesta manera podem veure dos antígens diferents perquè s’hauran unit a anticossos específics marcats amb els diversos fluorocroms.
1 PROBLEMA: Podem tenir el que es coneix com a soroll de fons o immunofluorescència no específica de fons, que es deu a la fluorescència pròpia de molècules endògenes de la mostra, sobre tot entre 340-500nm. Ens dificulta la interpretació dels resultats.
Tenim dos tipus d’immunofluorescència: A. IFD (Immunofluorescència directa o primària): Els anticossos marcats amb fluorocroms s’uneixen directament als antígens de cèl·lules, teixits, microorganismes... La reacció es dóna sobre talls histològics i té una sensibilitat variable. El problema d’aquesta tècnica és que necessitem anticossos específics marcats amb fluorocroms i no sempre tenim l’anticòs específic marcat.
B. IFI (Immunofluorescència indirecta): S’utilitza per a detectar anticossos al sèrum o bé directament sobre teixits, frotis o cultius cel·lulars. Per a poder fer-ho necessitem un anticòs específic contra l’antigen que busquem i després un segon anticòs marcat i específic contra el primer anticòs. D’aquesta manera no necessitem un anticòs específic contra l’antigen que busquem i a més marcat sinó que necessitem un anticòs contra anticossos d’una espècie i que estigui marcat. És molt més fàcil trobar anticossos contra anticossos d’una espècie marcat que anticossos específics marcats.
Podem amplificar la senyal utilitzant el complement ja que la unió antigen-anticòs fixa el complement per la via clàssica. La detecció la fem mitjançant anticossos marcats contra el complement.
2 AVANTATGES:  Només necessitem anticossos marcats contra anticossos d’una espècie.
 Molt més sensible  Podem fer amplificacions utilitzant més anticossos marcats contra les unions anticòs-antigen.
 Utilitzem anticossos monoclonals que donen una major especificitat i redueixen la reactivitat creuada.
2.-CITOMETRÍA DE FLUX: És una tècnica que s’utilitza per a detectar cèl·lules que han estat reconegudes per anticossos específics marcats amb fluorocroms. És habitual per estudis funcionals de les cèl·lules com per exemple per reconèixer el tipus cel·lular o estudis fenotípics. Permet reconèixer la mida de la cèl·lula i la seva complexitat. Té una gran sensibilitat, és una tècnica ràpida i automàtica. Ens permet detectar qualsevol tipus de cèl·lula per la qual tinguem anticossos específics.
3.-RADIOIMMUNOASSAIG (RIA): És una tècnica d’unió primària que quantifica antígens o anticossos utilitzant com a sistema de detecció i amplificació el marcatge amb isòtops radioactius (H3, I125, C14). Es tracta de mesurar la radioactivitat emesa pels immunocomplexos. És molt semblant a l’ELISA però utilitzà isòtops i no enzims com a marcadors. És una tècnica molt sensible però té problemes com la perillositat, el preu, que s’han de seguir protocols determinats... Hi ha de diferents tipus com el competitiu, el Sandwich...
4.-ELISA: És una tècnica enzimàtica que utilitza enzims com a marcadors que permeten detectar la unió antigen-anticòs. Els anticossos es marquen amb enzims i s’utilitza un substrat cromogènic per aquest enzim. La quantitat de color es mesura amb un espectrofotòmetre.
És un mètode molt utilitzat perquè és molt sensible, ràpid, automàtic...
3 Hi ha diferents tipus d’ELISA: A. ELISA Directe  Tenim una placa recoberta dels antígens problema i hi afegim els anticossos específics marcats amb l’enzim. És poc usual perquè implica tenir un anticòs específic marcat amb enzim per cada antigen que volem detectar.
B. ELISA Indirecte  S’utilitza per a detectar anticossos. Al pou posem un antigen específic per a l’anticòs que volem detectar (Mostra problema) i després afegim un anticòs marcat amb l’enzim. Com que volem detectar anticossos per a un determinat antigen el que busquem són immunoglobulines i per tant posem un anticòs marcat contra immunoglobulines. Com més color detectem més unions antigen-anticòs. S’utilitza per al diagnòstic de malalties, en serologia.
C. ELISA Competitius  Serveix per a detectar unions antigen-anticòs. Als pous tenim l’antigen i afegim anticossos específics. A continuació fem un rentat per retirar l’excés del primer anticòs i afegim anticossos marcats específics contra l’antigen, no contra el primer anticòs. D’aquesta manera com més color veiem, voldrà dir que tenim menys unions antigen-anticòs perquè el segon anticòs marcat s’uneix a l’antigen i si aquest està unit al primer anticòs ja no ho pot fer. És una competència. També pot fer-se per a detectar anticossos a partir d’antígens específics i antígens específics marcats.
No és un mètode molt utilitzat perquè implica tenir un anticòs marcat específic per a cada antigen que volem detectar.
4 D. ELISA Sandwich  Al pou tenim l’anticòs problema i afegim la mostra problema que conté l’antigen que volem detectar i que és específic per al nostre anticòs. Després afegim un segon anticòs contra l’antigen que està marcat amb l’enzim. D’aquesta manera queda l’antigen problema entre dos anticossos com si fos un Sandwich. Com més color tinguem més antigen tenim perquè l’anticòs marcat s’uneix a l’antigen que tenim retingut en el primer anticòs.
E. ELISA Dot  Mesurem unions antigen-anticòs en una membrana de nitrocel·lulosa on les veurem com a punts de color (Dot). Podem detectar anticossos o antígens en un sèrum.
a. Si volem detectar anticossos al sèrum tindrem els antígens corresponents adsorbits a la membrana, després afegim la mostra problema i finalment l’anticòs marcat contra el primer anticòs. Serà un anticòs contra immunoglobulines.
b. Si volem detectar antígens al sèrum tindrem els anticossos corresponents adsorbits a la membrana, després afegim la mostra problema que contindrà antígens i finalment anticossos marcats contra l’antigen.
És molt útil en tests de camp perquè és molt ràpid. No serveix per a quantificar, però detecta la presencia d’anticossos i antígens. Com més color trobem més unió hi ha i per tant més antigen o anticòs problema.
5 5.-IMMUNOELECTROTRANSFERÈNCIA (WESTERN BLOT o IMMUNOBLOT): És una tècnica qualitativa que combina els mètodes electroforètics i els immunoenzimàtics per detectar anticossos específics contra barreges complexes d’antígens o bé per a caracteritzar antígens. S’utilitza en la caracterització d’antígens dels antígens dels virus per a crear vacunes contra les parts clau dels virus.
És una tècnica lenta, que no deixa fer moltes proves alhora, cara però molt i molt sensible.
Hi ha diferents tipus:  Southern  DNA  Northern  RNA  Western  Proteïnes Hem de seguir diferents passos en el procés: 1. Fer una electroforesis en gel per tal de separar els components antigènics de la mostra.
2. Transferim les proteïnes que han migrat en el gel a una membrana de nitrocel·lulosa que serveixi per immobilitzar.
3. Incubació amb el primer anticòs que s’unirà a l’antigen de la membrana.
4. Incubació amb l’anticòs secundari marcat amb l’enzim. Aquest segon anticòs s’unirà al complex antigen-anticòs.
5. Afegim els substrat de l’enzim  Veurem taques de colors.
6.-IMMUNOHISTOQUÍMICA: És una tècnica molt utilitzada per a detectar antígens en talls histològics o taques.
S’utilitzen anticossos marcats amb un enzim. Pot ser directe o indirecte.
  Directe  Tenim l’antigen i afegim l’anticòs específic marcat amb l’enzim.
Indirecte  Tenim l’antigen i afegim un primer anticòs específic contra l’antigen. A continuació afegim un segon anticòs marcat i contra el primer anticòs. Molt més utilitzada aquesta variant perquè no necessitem anticossos específics de l’antigen marcats.
7.-IMMUNOCROMATOGRAFIA: És una tècnica molt utilitzada en diagnòstic perquè és ràpida i senzilla. Serveix per a detectar antígens en una mostra que flueix per capil·laritat i per tant ha de ser liquida. Els anticossos es marquen amb metalls pesats.
Són tests on trobem dues línies, una que ens mostra la unió entre antigen-anticòs i l’altre que ens mostra la unió anticòs-anticòs marcat, és a dir ens mostra l’anticòs que ha quedat lliure i està marcat.
Són els típics test d’embaràs.
Positiu: 2 línies Negatiu: 1 línia perquè només detecta els anticossos lliures marcats.
6 TÈCNIQUES SECUNDÀRIES: Mesuren els efectes de la unió antigen-anticòs.
TÈCNIQUES DE PRECIPITACIÓ: Són reaccions en que l’antigen és soluble i el resultat o efecte de la unió amb l’anticòs és la formació d’un immunocomplex que precipita. Aquesta unió insoluble que forma un precipitat només es produeix si la proporció d’antigen i anticòs és la correcta, si tenim un excés d’un o de l’altre no es produeix.
Els anticossos que tenen capacitat de fer precipitar antígens solubles s’anomenen precipitines. L’anticòs amb més capacitat de precipitació és la IgG.
Tenim dos tipus de precipitacions, les de medi líquid i les de medi sòlid. Tot i així les de medi líquid no s’utilitzen actualment.
IMMUNOPRECIPITACIÓ EN MEDI SÒLID: L’antigen i l’anticòs discorren pel gel i a la zona on troben la proporció adequada, zona d’equivalència, és on es produeix la precipitació.
Un avantatge important d’aquesta tècnica és que ens permet observar les diferents unions antigen-anticòs de la mosta perquè sortiran tantes línies com unions diferents tinguem.
1.-IMMUNODIFUSIÓ EN GEL: Pot ser en un tub o placa. Nosaltres només parlarem de la immunodifusió en placa que es realitza sobre una placa de petri o sobre un portaobjectes. Pot ser de dos tipus: A. Immunodifusió radial  També anomenada immunodifusió simple de o Mancini. Tenim en un pou l’anticòs o l’antigen i aquest difon per un gel d’agar que contindrà o bé antigen o bé anticòs.
Quan trobi la proporció adequada o zona d’equivalència es produirà un anell de precipitat on l’àrea serà proporcional a la concentració d’antigen o anticòs que tenim al pou. Podem obtenir la concentració de la nostra mostra que hem col·locat al pou comparant-la amb una recta patró. Com major sigui l’àrea més concentració tenim.
B. Immunodifusió doble  També coneguda com a mètode d’Ouchterlony. Tenim l’antigen i l’anticòs en dos pous separats i tots dos migren fins a trobar la zona d’equivalència on es produirà el precipitat. S’estableix un gradient de concentració entre ells.
Aquesta tècnica ha servit per a analitzar nombroses relacions antigèniques que poden ser d’identitat total, parcial o no identitat.
7 2.-IMMUNOELECTROFORESIS: És una tècnica que es basa en separar els antígens en base a la seva càrrega elèctrica per després observar-los en la seva unió antigen-anticòs com a precipitats. És una combinació entre la immunodifusió i l’electroforesi.
Hi ha de diferents tipus: A.
B.
C.
D.
Simple Contraimmunoelectroforesi Electroforesi en coet Immunoelectroforesi creuada o bidimensional  Consisteix en fer dues electroforesis seguides.
1. Electroforesi convencional d’una barreja d’antígens 2. Electroforesi en un angle de 90º respecte de la primera on el gel conté anticossos específics fixats que no podem migrar.
D’aquesta manera els antígens migren pel gel fins a trobar el seu anticòs específic. És molt útil per a barreges d’antígens o anticossos. És un mètode semiquantitatiu.
TÈCNIQUES D’ADLUTINACIÓ: Són tècniques que difereixen de les anteriors en l’estat físic de l’antigen que ara és un element particulat i insoluble com un bacteri o un eritròcit. Per aquet motiu la tècnica és més sensible que la precipitació.
Els anticossos bivalents , anomenats aglutinines, estableixen enllaços creuats amb els antígens multivalents formant una xarxa de complexos que produeixen aglomerats que són visibles a ull nu. L’aglutinació només es produeix quan la proporció entre antigen i anticòs és l’adequada.
La IgM és millor aglutinina que la IgG.
8 Hi ha diferents tipus de tècniques d’aglutinació: 1.-ALGUTINACIÓ DIRECTA: És una tècnica qualitativa que determina l’absència o la presència d’anticossos o antígens. S’utilitza molt en el diagnòstic ràpid com a primera proba o per fer sondeig perquè dóna molts falsos negatius. Hi ha de diferents tipus: A. Test del Rosa de Bengala  És la més comuna i serveix per determinar la presencia de Brucella abortus.
Tenim una suspensió d’antígens de brucel·la inactivats i tenyits amb rosa de bengala.
Negatiu Positius B. Aglutinació directa en porta Serveix per a la tipificació de bacteris.
C. Test de l’anell de la llet Consisteix en buscar anticossos contra la brucel·la a la llet.
D. Aglutinació directa semiquantitativa  També anomenada Serum Agglutination test (SAT). Serveix per a determinar la quantitat d’aglutinines en un sèrum. Tenim una quantitat fixa d’antigen que s’enfronta a concentracions creixents d’anticossos, són dilucions.
S’ha de tenir en compte l’efecte prozona per l’elevada concentració d’anticossos o la presència d’immunoglobulines no aglutinants.
Aquesta proba també es pot fet en microplaques de 96 pous tant per determinar el títol com per caracteritzar bacteris.
2.-AGLUTINACIÓ PASSIVA: Són reaccions d’aglutinació que utilitzen cèl·lules o partícules inerts com a portadors passius d’antígens o anticossos.
D’aquesta manera podem convertir una proba de precipitació en una d’aglutinació augmentant molt la sensibilitat.
Normalment els portadors passius són partícules de làtex o bentonita, eritròcits o bacteris.
 Hemoaglutinació passiva  Utilitza eritròcits amb antígens adsorbits a la superfície. Pot fer-se servir de dues formes: o En microplaques on afegim una quantitat constant d’eritròcits amb antigen i anem fent dilucions del sèrum que conté anticossos. Podem trobar el títol que és la major dilució on es produeix aglutinació.
o Podem detectar antígens si adsorbim anticossos sobre l’eritròcit.
9 3.-INHIBICIÓ DE L’AGLUTINACIÓ VÍRICA: Hi ha virus que presenten hemaglutinines i poden unir-se a receptors de membrana dels eritròcits i així aglutinar-los.
Aquesta característica és pròpia dels Ortomyxovirus, Paramyxovirus, Alfavirus, Reovirus...
Aquesta tècnica utilitza aquesta capacitat que tenen alguns virus per a determinar concentracions d’anticossos específics contra aquests virus de manera que en funció de la concentració d’anticossos podrem veure més o menys aglutinació. Si tenim més concentració d’anticossos tindrem menys aglutinació. S’utilitza per exemple en el diagnòstic del virus de la grip i de Newcastle.
Podem fer la proba en una microplaca de 96 pous on a cada un posem la mateixa quantitat de virus hemaglutinants. Enfrontem aquesta quantitat de virus amb una concentració creixent de sèrum que conté anticossos.
  Ab +  Si tenim anticossos al sèrum o una quantitat suficient els virus no poden unir-se als eritròcits perquè es troben bloquejats per l’anticòs. No es produeix aglutinació i veiem un punt vermell al fons del pou.
Ab -  Com que no tenim anticossos o en tenim pocs el virus pot unir-se a l’eritròcit i es produeix aglutinació. D’aquesta manera el pou queda completament de color vermell.
TÈCNIQUES DE FIXACIÓ DEL COMPLEMENT: L’activació del sistema del complement es produeix per la interacció de l’antigen i l’anticòs (IgG i IgM) en la via clàssica. Es forma un immunocomplex que es fixa sobre la membrana de la cèl·lula i la lesiona. D’aquesta manera el complement C es consumeix i ja no es pot utilitzar per altres reaccions. Si es fixa sobre un eritròcit es produeix l’hemòlisi.
Fem la proba en una microplaca de 96 pous. A cada pou afegim una dilució del sèrum on prèviament eliminem el complement que hi hagi. Després a cada pou afegim la mateixa concentració d’antigen i complement.
(+) Ag-Ab  Com que hi ha unions entre l’antigen i l’anticòs es consumeix el complement i per tant no hi ha hemòlisi.
Veiem un punt vermell al fons del pou.
(-) Ag-Ab  No hi ha unions entre antigen i anticòs de manera que no es consumeix el complement.
El complement es pot unir a al membrana dels eritròcits i provoca hemòlisi.
Veurem el pou de color vermell.
10 TÈCNIQUES DE NEUTRALITZACIÓ O SERONEUTRALITZACIÓ: Són tècniques que utilitzen les reaccions antigen-anticòs per demostrar la capacitat dels anticossos per bloquejar la infectivitat dels virus o l’efecte de les toxines bacterianes. Les probes poden fer-se in vivo o in vitro: 1. In vivo  Serveixen per estudiar les propietats neutralitzants d’un antisèrum és a dir s’estudia la seva capacitat protectora a partir de la inoculació d’aquest en animals als quals després s’administra la toxina o el virus.
2. In vitro  Podem utilitzar-se per a identificar virus o en la determinació semiquantitativa d’anticossos específics en el sèrum (Seroneutralització vírica).
Aquest mètode es realitza en una microplaca on tenim controls amb cèl·lules sense el virus i cèl·lules amb virus però sense sèrum amb anticossos. A les altres plaques posem les cèl·lules amb el virus i el sèrum problema inactivat (Per destruir el complement i altres substàncies termolàbils que puguin afectar el virus) per observar si es produeix o no efecte citopàtic.
També podem afegir dilucions del sèrum per obtenir el títol neutralitzant que és la major dilució que inhibeix l’efecte citopàtic en el 50% dels pous inoculats amb una determinada dilució del virus, TCID50 (Tissue Culture Inhibition Dose 50).
11 IPAM (TEST DE LA IMMUNOPEROXIDASA INDIRECTA EN MONOCAPA) És una tècnica similar a la immunofluorescència indirecta però el segon anticòs és un anticòs contra la IgG marcat amb una peroxidasa. Serveix per a determinar si s’han produït reaccions antigen-anticòs, és a dir per saber si l’individu ha produït anticossos contra un determinat virus intracel·lular. L’enzim catalitza una reacció on es produir un producte insoluble de color vermell-marronós.
El test es fa sobre una microplaca de 96 pous. A cada pou posem:      Cèl·lules infectades (Cèl·lules + virus) disposades en monocapa. El virus ha de ser intracel·lular.
Fixador  Acetona, alcohol etílic, paraformaldehid.
Dilucions seriades del sèrum per obtenir el títol  Després incubem i fem un rentat Afegim l’anticòs secundari  Fem una segona incubació i rentem per treure l’excés.
Afegim el substrat  Llegim en un microscopi invertit Si teníem antigen al sèrum trobarem una reacció de color a les cèl·lules.
12 RESPOSTA IMMUNE CEL·LULAR: Es basen en mesurar la resposta immune de tipus cel·lular. La font de cèl·lules més important és la sang. Tot i així podem obtenir mostres cel·lulars dels limfonodes, la melsa, el moll d’os, els pulmons, etc, però implica sacrificar l’animal.
La resposta immune cel·lular pot mesurar-se de dues formes: 1. In vivo S’avalua la capacitat de desenvolupar una resposta d’hipersensibilitat retardada enfront determinats antígens.
2. In vitro  S’estudien els propis components cel·lulars, el nombre, la proporció, el fenotip i la seva funcionalitat.
IN VIVO: Van ser els primers en ser descoberts. Podem utilitzar-los de dues formes: 1. Diagnòstic veterinari: Utilitzen un antigen específic i mostren una hipersensibilitat retardada enfront d’aquest antigen.
Destaca la proba de la tuberculina (TBC) que serveix per a detectar animals infectats per micobacteris que causen al tuberculosi. Per a fer la proba injectem PPD (Purified Protein Derivate) en una extremitat i marquem un cercle al voltant de la punxada. Si l’individu ha tingut contacte anteriorment amb l’antigen es produirà una resposta de tipus Th1 que implica la producció de citocines (CK) i així es produirà una reacció d’hipersensibilitat. És a dir la zona del cercle s’inflamarà i es posarà vermellosa.
2. Desenvolupament de vacunes: Serveix per avaluar l’eficàcia d’una determinada vacuna.
IN VITRO: Consisteixen en l’estudi de les diferents cèl·lules immunocompetents:     Separació de les cèl·lules per exemple per citometria de flux o separador cel·lular activat per fluorescència (FACS) Determinar la mida i la complexitat (Grànuls) Determinar les poblacions i subpoblacions Determinar l’estat de maduració: o Cèl·lules B  CD19+ o Cèl·lules B activades  CD23+ o Cèl·lules T  CD2+, CD3+ o Cèl·lules T activades  CD25+, CD28+ o Limfòcit T helper (Th)  CD24+ o Limfòcit T citotòxic  CD28+ 13 ACTIVITAT FUNCIONAL DE LES CÈL·LULES T: Mesurem la resposta de les cèl·lules T enfront una estimulació antigènica. Podem mesurar la seva proliferació o la seva funció efectora.
1.-PROLIFERACIÓ CEL·LULAR O LIMFOPROLIFERACIÓ: L’estimulació de la proliferació de limfòcits T es pot fer de dues formes: A. Inespecífica  A partir dels mitògens que són activadors policlonals com per exemple les lectines, la fitohemaglutinina o la concanavalina A.
B. Específica  A partir d’un antigen determinat i mesurant la resposta dels limfòcits que el reconeixen. Poden ser antígens vacunals o d’un procés infecciós. A més es necessita un control inespecífic.
LECTURA: Després hem de fer la lectura del test mitjançant diferents mètodes.
1.-Mètodes radioactius: És una tècnica de lectura molt eficaç perquè permet llegir la mínima proliferació. Tot i així és un mètode perillós perquè treballem amb radioactivitat. La tècnica es basa en mesurar la radioactivitat de les cèl·lules que proliferen gràcies a la utilització de: o o Nucleòtids marcats radioactivament i que s’incorporaran de nou al DNA que s’està sintetitzant. Per exemple la timidina marcada amb H3 o C14, o altres marcats amb I125.
Aminoàcids marcats radioactivament com la leucina H3 o C14.
El test es fa sobre una microplaca de 96 pous on tenim els limfòcits i afegim diferents estímuls per posar-los a incubar. Després afegim els nucleòtids radioactius i tornem a incubar, quan les cèl·lules es multipliquin inclouran el nucli. Finalment hem de trencar les cèl·lules per a col·lectar els nuclis i mesurem la radioactivitat en cpm.
Un avantatge d’aquesta tècnica és que podem treballar directament amb la sang sense seleccionar cèl·lules.
Reacció Limfocitària mixta Serveix per detectar antígens d’histocompatibilitat en poblacions limfocitàries diferents a partir de la reacció limfocitària mixta. Aquesta tècnica es basa en la capacitat que tenen els limfòcits de proliferar quan són incubats en presència d’altres limfòcits amb MHC II diferents. Per a dur-la a terme necessitem un cultiu amb limfòcits portadors de MHC II diferents. La proliferació la detectem per la incorporació de nucleòtids marcats.
Pot ser de dos tipus:   Bidireccional: Mesurem la proliferació en els dos animals.
Unidireccional: Mesurem la proliferació en un sol animal perquè les cèl·lules de l’altre han estat irradiades o tractades amb mitomicina de manera que no es destrueixen i poden actuar com a antígens sense dividir-se.
14 2.-Mètodes colorimètrics: Consisteix en utilitzar substàncies que siguin metabolitzades pels enzims mitocondrials de les cèl·lules i que ens serveixin per mesurar la proliferació. Alguns d’aquests compostos són incompatibles amb la vida de la cèl·lula però tot i així són menys perillosos que els mètodes radioactius. Un exemple és el tetrazoli que es transforma en cristalls de formazan a l’interior de les cèl·lules. El blau d’alamar canvia de color en ser reduït a l’interior de les cèl·lules.
Es mesura la proliferació a partir de la quantitat de color gràcies a un espectrofotòmetre 3.-Mètodes per citometria de flux (FACS): Tenim dues opcions I.
II.
Utilitzar anticossos contra CD25 i CD28 que són propis de limfòcits T activats.
Estudiar modificacions de la membrana. Afegint PKH26 que és una substancia fluorescent capturada per la membrana cel·lular. Després esperem a que la cèl·lula es divideixi i podem mesurar la proliferació perquè les cèl·lules filles tenen la meitat de la fluorescència que la cèl·lula mare perquè no podem multiplicar la fluorescència.
2.-FUNCIONS EFECTORES: A. Producció de citoquines: Són produïdes per les limfòcits T CD4+ activats també anomenats limfòcits helper.
a. ELISA: Utilitzem l’ELISA Sandwich per quantificar les citoquines dels sobrenedants dels cultius limfocitaris. Per detectar l’IFN-γ que es produït per les cèl·lules Th1 s’utilitza la tècnica dx TBC que és complementària al test de la tuberculina. Necessitem un cultiu sanguini on afegim estímuls (PPD) com M.bovis, M.avium. Incubem i fem una recol·lecció del plasma i fem un ELISA IFN- γ.
b. ELISPOT: Serveix per a mesurar la freqüència amb la que els limfòcits T produeixen un determinat tipus de citoquina. Podem determinar el número de cèl·lules que produeixen citoquines. És una modificació de l’ELISA:  La placa es troba recoberta d’anticossos contra les CK  Afegim els limfòcits T + Diferents estímuls (Ag/C+/C-)  Incubem  Eliminem les cèl·lules i afegim l’anticòs secundari marcat amb un enzim i el substrat.
Si les cèl·lules han produït citoquines, aquestes hauran quedat retingudes al primer anticòs i així el segon anticòs marcat podrà unir-se a elles. Trobarem taques a la placa. Cada taca correspon a una cèl·lula productora de citoquines.
15 c. Citometria de flux (FACS): Permet determinar el perfil de citoquines produïdes per un tipus cel·lular en concret.
 Tinció de citoquines intracel·lulars  Permet identificar cèl·lules que produeixen activament un tipus de citoquina. Tenim un cultiu cel·lular el qual estimulem per a que produeixi citoquines i bloquegem la sortida d’aquestes de les cèl·lules mitjançant un inhibidor de la proteïna de transport com la brefeldina A. A continuació fixem i permeabilitzem la cèl·lula. A continuació fem passar anticossos monoclonals marcats amb fluorocroms cap a l’interior de les cèl·lules i així podem veure les cèl·lules que produeixen la citoquina que volem.
 Captura de citoquines amb anticossos biespecífics  S’utilitzen anticossos biespecífics que són híbrids i que amb cada braç s’uneixen a un epítop diferent. Amb un braç s’uneix a un marcador de la membrana cel·lular i amb l’altre a una citoquina quan surt de la cèl·lula.
Després marquem les citoquines amb un anticòs secundari marcat. Podem marcar les citoquines o les cèl·lules.
d. Bioassaig: Les citoquines es poden detectar per la seva activitat en anàlisis biològics de creixement cel·lular en els que funcionen com a factors de creixement positiu o negatiu. És a dir poden provocar el creixement cel·lular o no. Són tests complexos.
B. Citotoxicitat: Està mediada pels limfòcits T CD8+ que tenen un efecte citotòxic sobre les cèl·lules. Per mesurar la citotoxicitat es fan una sèrie de tests que poden ser dependents o independents del complement el qual llisa les cèl·lules. Les probes per mesurar la citotoxicitat poden ser:     Directes i específics  Citotoxicitat produïda per limfòcits T CD8+.
Directes i inespecífics  Citotoxicitat produïda per cèl·lules NK.
Citotoxicitat independent d’anticossos.
Citotoxicitat dependent del complement.
Per a fer les probes inactivem les cèl·lules diana amb radiació o mitomicina. Després fem un cultiu amb les cèl·lules citotòxiques i les cèl·lules diana marcades amb Cr51. Quan les cèl·lules marcades són destruïdes per l’efecte citotòxic alliberen la radioactivitat i la podem mesurar amb un comptador de centelleig.
Com més radioactivitat veiem més citotoxicitat tenim.
Una alternativa al marcatge amb radioactivitat és el marcatge o tinció amb DiO.
ACTIVITAT FUNCIONAL DE LES CÈL·LULES B: Les cèl·lules B activades es transformen en cèl·lules plasmàtiques i comencen a produir anticossos que són les immunoglobulines.
1.-TRANSFORMACIÓ LIMFOCITÀRIA: Pot ser de dos tipus:   Inespecífica: S’activen per mitògens policlonals que poden ser PWS (Necessitaran cooperació dels limfòcits T), LPS, etc.
Específica: S’activen per un antigen determinat que pot provenir d’una vacuna o d’un procés infecciós. Es necessita un control.
16 Després hem de fer la lectura mitjançant radioactivitat, mètodes colorimètrics o citometria de flux.
2.-MESURA DE LES IMMUNOGLOBULINES SECRETADES: Es produeixen en baixes quantitats en els cultius cel·lulars i per tant s’han de detectar amb diferents tècniques:    RIA/ ELISA FACS (Citometria de flux), ELISPOT modificat Tècnica de formació de plaques hemolítiques  Consisteix en barrejar en agar líquid cèl·lules B i eritròcits amb antígens adsorbits sobre la membrana. Ho portem a incubar per a que es produeixin anticossos. Afegim el complement i els eritròcits es lisaran si existeixen unions antigen-anticòs. Es formaran plaques de lisi visibles.
ACTIVITAT FUNCIONAL DE LES POLIMORFONUCLEARS, MONÒCITS I MACRÒFAGS: La seva activitat funcional s’avalua amb diferents tècniques: 1.-ADHERÈNCIA: Les integrines són les glicoproteïnes responsables de l’adherència. S’expressen en major nombre quan la cèl·lula està activada com en els fagòcits. Es pot mesurar per citometria de flux (FACS) o per immunofluorescència.
Aquesta característica s’utilitza per a separar cèl·lules polimorfonucleades fent-les passar per un tub que conté boletes de vidre i fent diferents rentats queden retingudes només les cèl·lules que tenen aquesta propietat.
2.-QUIMIOTÀXIS: Podem observar la quimiotaxis de diferents formes: 1. Observació directa 2. Fer passar les cèl·lules per microfiltres 3. Fer migrar les cèl·lules en un gel d’agarosa en direcció a un pou ple de compostos que les atreuen. S’han de posar controls.
3.-INGESTIÓ: Consisteix en avaluar la capacitat d’ingestió de les cèl·lules. Podem avaluar-la de diferents formes: 1. Directament  A través d’un microscopi 2. Radioactivament  A través de la ingestió de partícules radioactives i mesurem la radioactivitat.
3. Colorimètricament  Afegint una emulsió d’oli vermell O opsonitzat, després extraiem el colorant amb un dissolvent i finalment quantifiquem amb un espectrofotòmetre.
4. Citometria de flux  A través de la ingesta de partícules marcades amb fluorocroms.
5. Índex d’ingestió de bacteris i fongs  Mesurem l’índex d’ingestió de bacteris i fongs opsonitzats i no opsonitzats. Després es determina el nombre d’organismes vius del sobrenedant i fem un cultiu.
Determinem el nombre dels que han sobreviscut i així sabem quants han estat ingerits.
4.-EVALUACIÓ DE LA MORT INTRACEL·LULAR: Pot avaluar-se de diferents formes: A. Avaluació de la mort intracel·lular  Es mesuren els mecanismes encarregats de la mort dels microorganismes com per exemple els metabòlits d’O2. Hem d’aturar la fagocitosi i comptar els microorganismes viables intracel·lulars. Hem d’eliminar els microorganismes extracel·lulars per exemple amb antibiòtics que no traspassin la membrana la membrana cel·lular. Després hem de fer rentats i provoquem la lisi de les cèl·lules per a comptar els microorganismes.
17 B. Reducció del NBT  NBT és el nitroblau de tetrazoli que és fagocitat i es transforma a l’interior del fagosoma en cristalls de formazan. Les mesures es poden fer directament amb un microscopi, amb un espectrofotòmetre o amb l’ELISA.
C. Quimioluminescència  L’explosió metabòlica que es produeix durant la fagocitosi es pot mesurar amb fotòmetres. Es pot afegir luminol per intensificar les emissions de llum.
18 ...